胡萝卜组织培养系统实验

胡萝卜组织培养系统实

验

标准化工作室编码[XX968T-XX89628-XJ668-XT689N]

云南大学生命科学实验教学中心

实验报告

课程名称：细胞工程实验

院系：生命科学学院

2013级生物技术（国家生命科学与技

年级专业：

术基地班）

姓名：杨梦梅选课号：

学号：座号：A2

开课日期：学期：2015秋季学期

任课教师：吕琦、牛芸

云南大学生命科学实验教学中心制

胡萝卜愈伤组织的诱导、继代及细胞悬浮培养研究

第一作者：杨梦梅同组实验者：赵姗

(云南大学生命科学学院, 昆明 650504)

摘要: 以胡萝卜肉质根为外植体诱导出愈伤组织, 并建立细胞悬浮系. 实验结果表明: 胡萝卜肉质根是诱导愈伤组织和进行细胞悬浮培养的可行外植体; 诱导致密型愈伤组织的最佳激素浓度配比是 mg/ L 2, 4- D+ mg/ L KT;继代培养1代~ 2时,可得到高活性的悬浮细胞系；细胞悬浮培养细胞经过 14 天达到高峰期（生长平台）。

关键词: 胡萝卜; 组织培养; 细胞悬浮培养; 致密型愈伤组织;

The study about inducement, subculture and suspension

cell lines of Carrots’ callus

Abstract: Carrots’ flesh roots can induce callus as explants, and then it establishes suspension cell lines. The experimental results show that: Carrots’flesh roots really can induce callus and then make suspension cell lines. In order to induce high density callus, the best hormone ratio is mg/ L 2, 4- D+ mg/ L KT. Subculturing the cell line for 1 to 2 times, we

can obtain the suspension cell line with high activity. After 2 weeks, the cell line reaches to the peak of growth.

Keywords: Carrot; tissue culture experiments; suspension cell; callus in

high density

胡萝卜( Daucus carota L . ) , 属于十字花科植物, 是一种十分重要的蔬菜作物, 由于胡萝卜肉质根营养丰富，约含有88％的水、6％～8％糖、1％～2％植物纤维，0．7％～1．2％蛋白质、1％灰份及0～3％脂肪，及其适于生食、加工、烹调等多种用途, 在世界范围内广泛栽培。中国是农业大国, 胡萝卜作为蔬菜作物在人们生活中起着重要的作用。因此, 加快我国胡萝卜育种研究以成为迫切需要。近些年来, 随着生物技术与分子生物学技术的快速发展, 作为生物技术研究的理想材料, 许多国家对胡萝卜体细胞杂交技术、遗传转化与再生技术、分子标记与基因克隆技术进行了广泛深入的研究。我国科研工作者在胡萝卜的生物技术与分子生物学研究上也取得了一定进展, 特

别是在组织培养、原生质体融合、遗传转化及再生等方面。但是在胡萝卜细胞培养方

面并不是太多, 因此继续深入研究还是很有必要的。

本文对胡萝卜愈伤组织诱导的最佳培养基和细胞悬浮培养的条件进行探讨, 为其次

生代谢产物α- 胡萝卜素、β- 胡萝卜素（维生素A前体）的生产以及将来的工厂化和分子生物学研究打下基础。

1材料和方法

1. 1 材料来源

胡萝卜肉质根自农贸市场购买.

1. 2 方法

1. 2. 1 MS培养基的配制1000ml

1)用大烧杯取蒸馏水100-120ml

2)依次用移液管量取加入母液：100ml大量（10x）、100ml大量钙盐（10x）、

10ml微量I（100x）、1ml微量II（1000x）、10ml铁盐（100x）、10ml有机（100x）、100ml有机肌醇（10x）、以及适当含量植物激素。

3)称取30g蔗糖加入，搅拌直至全部溶解，作为1号溶液备用。

4)称取9g琼脂，用量筒量取500ml蒸馏水一起加入1000ml体积白瓷缸中，放

在电炉上一边加热一边搅拌，加热直至清澈无沉淀。将1号溶液加入，继续

加热搅拌，至将要沸腾，离火。

5)用pH试纸调pH至。

6)在白瓷缸中定容至1000ml，搅拌均匀。

7)分装至350ml培养瓶中每瓶约40~50ml。121℃高压灭菌20min。

探究实验：

( 1) 以胡萝卜肉质根形成层为外植体诱导。用自来水洗净胡萝卜肉质根, 用小刀切成长约6~7cm块段, 将其在 75% 的酒精中消毒 60s, 再用0. 1% 的升汞消毒 10min或用20%次氯酸钠水溶液消毒20min, 最后用无菌水漂洗三遍每遍5~10min..

（2）消毒好的胡萝卜根块, 切去形态学下端的5~10mm厚的一片, 留下部分用消毒好的小刀, 沿截面横切成厚度 3~5mm 左右的小圆片, 然后将小圆片的韧皮部和木质部切去, 留下形成层, 再切成长 3mm, 宽 1. 5mm, 高 3~5mm 的小长块, 分别接种在M1、M2、M3、M4的诱导培养基上.

（3）获得愈伤后进行继代培养, 培养环境条件与诱导培养相同.

1. 2. 3胡萝卜愈伤组织的继代