细胞实验的基本操作.pdf
《细胞实验》17 质粒转染实验步骤
质粒转染大肠杆菌材料试剂：胰化蛋白胨，酵母提取物，琼脂，NaCl，NaOH（调pH），氨苄青霉素，卡那霉素，质粒提取试剂盒仪器：高压灭菌锅，42℃恒温水浴锅，，恒温摇床（37℃,225rpm），无菌培养板，消毒1.5ml 离心管，消毒枪头，无菌操作台实验步骤：1.LB培养基的配制：在950 ml去离子水中加入: 胰化蛋白胨10g 酵母提取物5g NaCl 10g 摇动容器直至溶质溶解.用5mol/LNaOH调pH至7.0.用去离子水定容至1L.在15psi高压下蒸汽灭菌20min.固态培养基LB固体培养基及倒板：（1）.配制：100mlLB培养基加入1.5g琼脂粉（2）.抗生素的加入：高压灭菌后，将融化的LB固体培养基置与55℃的水浴中，待培养基温度降到55℃时（手可触摸）加入氨苄抗生素（终浓度为50μg/ml），以免温度过高导致抗生素失效，并充分摇匀。
（3）.倒板：一般10ml倒1个板子。
培养基倒入培养皿后，打开盖子，在紫外下照10-15分钟。
（4）.保存：用封口胶封边，并倒置放于4℃保存，一个月内使用。
2.从-70℃冰箱中取200μl感受态细胞悬液，室温下使其解冻，解冻后立即置冰上。
3.加入质粒DNA溶液（含量不超过50ng，体积不超过10μl），轻轻摇匀，冰上放置30分钟后。
4.42℃水浴中热击45s/90s，热击后迅速置于冰上冷却3-5分钟。
5.向管中加入1ml LB液体培养基（不含Amp），混匀后37℃振荡培养1小时，使细菌恢复正常生长状态，并表达质粒编码的抗生素抗性基因（Ampr ）。
6.将上述菌液摇匀后取100μl 涂布于含Amp的筛选平板上，正面向上放置半小时，待菌液完全被培养基吸收后倒置培养皿，37℃培养16-24小时。
同时做两个对照：对照组1：以同体积的无菌双蒸水代替DNA溶液，其它操作与上面相同。
此组正常情况下在含抗生素的LB平板上应没有菌落出现。
对照组2：以同体积的无菌双蒸水代替DNA溶液，但涂板时只取5μl 菌液涂布于不含抗生素的LB平板上，此组正常情况下应产生大量菌落。
细胞遗传学实验技术标准操作规程（SOP）
细胞遗传学实验技术标准操作规程（SOP）细胞遗传学实验技术标准操作规程（SOP）外周⾎培养及染⾊体的识别 (2)⽩⾎病⾻髓及外周⾎染⾊体 (7)外周⾎细胞脆性位点检测技术 (9)⼈⽺⽔细胞培养收获操作程序 (11)绒⽑细胞培养和染⾊体分析 (13)⾼分辨染⾊体操作⽅法和识别 (15)GII式显带法 (21)N式显带法 (21)R(反式)显带法 (23)姐妹染⾊单体互换（SCE）技术 (23)荧光原位杂交操作程序 (25)附:细胞遗传学实验试剂配制标准操作规程（SOP） (27)天平称量操作规程 (27)药匙处理操作规程 (27)PBS配制规程 (28)胰酶配制规程 (28)培养基配制规程 (29)1N HCL配制规程 (29)1N N A OH配制规程 (29)外周⾎培养及染⾊体的识别1. 原理：外周⾎中的淋巴细胞⼏乎都是处在G0期或G1期，⼀般情况下是不分裂的。
当在培养基中加⼊植物⾎凝素（Phytohaemagglutinin PHA）时，这种⼩淋巴细胞受到刺激后转化为淋巴母细胞，并开始进⾏有丝分裂。
经过短期培养后，⽤秋⽔仙素处理就可获得⼤量中期分裂相的细胞，制⽚后可以清楚地对染⾊体进⾏观察与分析。
2. 外周⾎培养与收获操作步骤：2.1 采⾎：⽤20:1肝素（0.4%）温润⽆菌注射器抽取外周⾎5ml（注意：消毒时需脱碘）。
2.2. 种⾎：将注射器搓捏，使⾎样混匀，在⽆菌条件下，⽤7号针头垂直种⾎0.3ml±抗凝⾎（成年男⼦28滴，成年⼥⼦30滴左右，⼉童32滴）⾄外周⾎培养基内。
2.3. 培养：将培养瓶放⼊37℃恒温箱中培养68-72⼩时，注意第⼆观察培养液有⽆凝⾎、溶⾎或长菌的现象，可每天培养液摇⼀摇，以便细胞可获得充分的营养，但⼀般情况下可不摇。
2.4. 制⽚过程：2.4.1. 加秋⽔仙素：在培养完成前2-3⼩时，加⼊浓度为20ug/ml的秋⽔仙素2-3滴（7号针头竖滴）后，继续培养2-3⼩时。
K562细胞培养
K562细胞培养实验实验人员：刘嵘、郝茜、张寅峰、龙琪实验材料：K562细胞，无菌RPMI-1640培养基，无菌离心管，无菌吸管，无菌培养瓶，离心机，倒置显微镜，超净工作台，CO2培养箱。
培养基成分：培养液由90%不完全1640培养液[RPMI-1640液95毫升；0.1M丙酮酸钠1毫升；0.2M谷氨酰胺1毫升；1M HEPES 1毫升；7.5%NaHCO3 1毫升；青霉素、链霉素（各一万单位）1毫升]和10%灭活胎牛或新生牛血清。
细胞培养操作：一、细胞冻存与复苏：细胞冻存实验步骤1、将细胞悬液收集至离心管中。
2、1000rpm离心10分钟，弃上清液。
3、沉淀加含保护液的培养，计数，调整至5×106/ml左右。
4、将悬液分至冻存管中，每管1ml。
5、将冻存管口封严。
如用安郶瓶则火焰封口，封口一定要严，否则复苏时易出现爆裂。
6、贴上标签，写明细胞种类，冻存日期。
冻存管外拴一金属重物和一细绳。
7、按下列顺序降温：室温→4o C(20分钟)→冰箱冷冻室（30分钟）→低温冰箱（-30o C 1小时）→气态氮（30分钟）→液氮细胞复苏实验步骤：1、取出贮存细胞，37o C水浴中快速融化。
2、把1-2ml冻存细胞加入到大约25ml完全生长培养基，轻轻混匀。
3、以大约800rpm离心2到3分钟，弃去上清。
4、在完全生长培养基轻轻再次悬浮细胞，并且进行活细胞计数。
5、细胞铺板，细胞接种应该至少为3×105活细胞/ml。
二、细胞培养与传代：1、将细胞培养液转移到离心管中，离心800-1000rpm,5min。
2、去除上清。
3、加入1ml培养基到离心管内，用吹打使细胞悬浮。
4、将细胞悬液吸出，加入到已加入8ml培养基的新的已灭菌培养瓶中。
5、在倒置显微镜中观察瓶中细胞密度是否适中6、旋开半圈培养瓶口，放入CO2培养箱中培养7、观察并适时传代实验结果：b)细胞传代一次时间：其中，第四代（5.20上午-5.22晚上）细胞密度低，生长繁殖时间最长；第五六和第八代细胞生长繁殖一代耗时时间最短，且最终细胞密度也最大，以致培养基变黄。
细胞生物学实验教程中山大学生命科学学院.pdf
前言细胞生物学是高校生命科学的主干课程之一，是一门实验性很强的学科。
生命科学的许多重大发现与细胞生物学实验技术的不断创新、发展是分不开的。
因此，学习和掌握细胞生物学最基本的技术和最新的实验方法，对于从事生命科学研究工作者来说是非常重要和完全必要的。
目前，适用于高等院校不同层次使用的细胞生物学实验教材不多。
由于细胞生物学已成为重要的前沿生物学科，其发展速度之快可谓日新月异，突飞猛进，异常迅速。
各种研究新方法、新技术如雨后春笋层出不穷。
各学科之间的相互渗透，相互依存紧密相联。
如细胞生物学与分子生物学、分子遗传学等实验技术之间就具有很强的依存性和相融性。
细胞生物学实验技术的巨大变化，将推动细胞生物学向着更深的层次发展。
我们为了紧跟学科发展的趋势，把握学科前进的方向，适应学科发展的要求，将多年来在教学和科研实践中积累及编写的细胞生物学技术编写成《细胞生物学实验》一书。
旨在让学生能掌握细胞生物学研究的基本操作技能和新的实验技术，从细胞生物学的角度分析生物学中的问题，为独立进行研究打下基础。
本书是王金发教授主编的《细胞生物学》的配套教材之一。
全书共有64个实验，内容较丰富，知识面广，既包括常规的经典实验，又新增了不少与现代细胞生物学和分子生物学相关的新技术，如电穿孔和电融合技术、反转录病毒载体介导的基因转导技术、胚胎干细胞的培养和体外分化技术、流式细胞技术、细胞显微注射、共聚焦显微技术、细胞凋亡检测技术等。
这些实验内容新颖、技术先进，可操作性强，对培养学生的动手能力、分析问题和解决问题的能力很有帮助。
本书第1～4章由戚康标编写；第5～7章由何炎明编写；第8章由何炎明、张利红编写；第9、12章及附录由刘兵编写，并对全书进行文字编辑和校对；第10、11章由张利红、张为民编写；冯冬茹参加了部分实验的初稿编写工作。
本书在编写过程中得到王金发教授的亲自指导和中山大学生命科学院的大力支持，在此表示感谢。
由于编者的水平有限，难免出现错误，恳请广大读者给予批评指正。
高中生物的细胞实验教案
高中生物的细胞实验教案
实验目的：通过观察显微镜下的细胞结构，了解细胞的组成和功能
实验材料：
1. 显微镜
2. 盖玻片
3. 鲤鱼皮细胞样本
4. 盐水
5. 小刀
6. 小勺
7. 水滴管
8. 缝纫针
实验步骤：
1. 取一片鲤鱼皮细胞样本，用盐水洗净。
将样本放在盖玻片上，加入一滴盐水。
2. 用小刀先将细胞表面削平，然后用小勺轻轻压碎细胞，使细胞内液体渗出。
3. 用水滴管加入一滴水，混合细胞内液体。
用缝纫针搅拌均匀，覆上盖玻片。
4. 将盖玻片放在显微镜台上，调整放大倍率，观察细胞结构。
5. 观察细胞的外观特征，包括细胞核、质体、液泡等结构。
记录观察到的细胞结构和特点。
6. 总结细胞的结构与功能，讨论细胞结构与功能之间的关系。
实验注意事项：
1. 操作过程要轻柔，避免破坏细胞结构。
2. 使用显微镜时要小心操作，避免损坏显微镜。
3. 实验后要注意清洁实验台和实验器材。
拓展实验：
1. 观察其他种类的细胞样本，比较不同种类细胞的结构与功能。
2. 进一步研究细胞器官的功能和相互作用。
实验评价：
通过本实验，学生能够深入了解细胞的结构与功能，培养观察、记录和分析实验结果的能力。
同时，也促进学生的团队合作与沟通能力。
细胞迁移侵袭实验操作步骤(Transwell)
上未迁移的细胞 , 以免影响读数。尤其就是膜周边上可用细牙签或小镊子缠 上湿棉花擦洗 , 但要小心避免将膜戳破 ; (7)Chamber 与膜上都无法标记 , 操作时应小心避免混淆实验组与对照组 ; (8) 充分晾干 , 避免残留水分导致镜下聚焦不一致。
配套 ,BD 公司的 Matrigel, 无血清 DMEM,(1% 胎牛血清 )DMEM 与 1640 培养基 ,DMEM 完全
培养基 ,1640 完全培养基 (也可加到 20% 血清 ),无菌 PBS, 棉签 ,胰酶 ,4% 多聚甲醛固定液或者
甲醇 ,结晶紫染液 (0 、 1%(g/ml)PBS 结晶紫 )
中的成分可以影响到上室内的细胞 ,应用不同孔径与经过不同处理的聚碳酸酯膜 行共培养、细胞趋化、细胞迁移、细胞侵袭等多种方面的研究。
,就可以进
实验步骤 :
1 材料准备 : 可拍照显微镜 ,Transwell 小室 ,孔径 8μm,没包被胶的 (Coster 与 Corning 公司的也较常 用),Transwell 迁移实验的细胞培养板 24 孔板。细胞培养板应当与购买的 Transwell 小室相
小时使其干成胶状 ; (4) 后续步骤同迁移实验 (1-8) 。
注意事项
(1)Matrigel 在过高或过低的温度均易凝固 , 因此操作所需枪头与离心管应提前
在 4℃预冷 ;
(2) 铺胶时保证液面水平 , 胶的厚度均匀一致 验。
其她
Transwell 做肿瘤侵袭实验的具体步骤 (1) 基质胶准备 :将冻存于－ 80 度冰箱的 BD matrigel 4 度过夜 ( 24h ), 变成液态 ; (2) 取 300ul 无血清培养基 , 加入 60ul ( 或 50ug/ 每室 ) Matrigel , 混匀 ,( 4℃操作 ,最好在 冰浴上 ),加入上室各 100ul ( 3 个室 ); 放入 37 ℃培养箱中 ,孵育 4-5h ( >5h ); 此间经常观察 , 当出现 “白色层 ”时 , 说明已经变为固态。 注释 :无血清培养基与基质胶按 1: 5 稀释 , 每孔加 50ul , 在 37℃培养箱中 1-2h 。 (3) 消化细胞 , 无血清培养基洗 3 次, 计数 , 配成细胞悬液 ; (4) 用无血清培养基洗 Matrigel 洗 1 次; 每孔加入 100ul 细胞悬液 ; (5) 下腔室中加入 500ul 含有 20 ％FBS 条件培养基 ; (6) 37℃培养箱中 ,孵育 20-24h ; (7) 取出 transwell 用 PBS 洗 2 遍 , 5%戊二醛固定 , 4℃ ; (8) 加入结晶紫 ( 0、 1% ) 染色或 Giemsa 染色 ( 5 －10min ), 室温 0、 5h , PBS 洗 2 遍 , 用 棉球擦去上表面细胞 , 显微镜下观察。 迁移实验 transwell 在 24 孔板中浸泡 1 小时 ; 消化细胞 , 无血清培养基 洗 2 次 , 计数 , 配成 细胞 悬液 , 每孔加入 100ul 细胞悬液 ; 加药刺激 ; 下腔室中加入条件培养基或其她刺激因 子 ; 37 ℃培养箱中 ,孵育 20-24h ; 取出 transwell 用 PBS 洗 2 遍 , 5% 戊二醛固定 , 4℃;PBS 洗 2 遍, 加入结晶紫 ( 0、1% ) 染色 , 室温 0、5h , PBS 洗 2 遍 , 用棉球擦去上表 面细胞 , 显微镜下观察计数 10 照相 , 记录。 侵袭实验 取 300ul 无血清培养基 , 加入 30ul ( 或 50ug/ 每室 ) Matrigel , 混匀 ,( 4 ℃ 操作 ,最 好在冰浴上 ),加入上室各 100ul ( 3 个室 ); 放入 37 ℃ 培养箱中 ,孵育 4-5h ( >5h ); 消化细胞 , 无血清培养基洗 3 次 , 计数 , 配成 细胞悬液 ; 用无血清培养基洗 Matrigel
细胞WB实验步骤
细胞Western Blot实验步骤细胞：共9种细胞。
实验器材：PHCbi细胞培养箱、酶标仪（BioTek）、Tanon EPS300电泳仪；电泳槽、转膜槽、烧杯、巴氏吸管、枪头、量筒、搅拌器、离心机（上海翌圣，ESMC6K）、金属浴锅（上海翌圣，ES-MB1）、孵育箱、孵育盒、VORTEX旋涡混合器、摇床（Kylin-bell，Orbital Shaker TS-2）细胞培养皿。
实验试剂：DMEM培养基、FBS（胎牛血清，中乔新舟）、胰酶-EDTA、PBS洗涤液（博士德）、RIPA裂解液（碧云天，P0013B）、PMSF（中文名为苯甲基磺酰氟，ST506）、BCA 蛋白浓度测定试剂盒(增强型)（碧云天，P0010）、SDS-PAGE凝胶配制试剂盒（碧云天，P0012A）、快速封闭液（或脱脂奶粉）、一抗（immunoclone）、一抗稀释液、二抗（碧云天，Goat Anti-rabbit IgG(H+L)）、二抗稀释液、一抗二抗去除液、β-actin内参一抗、GAPDH 内参一抗、Tubulin内参一抗、三色预染Marker（10-250kDa）、PBST洗涤液、ECL超敏发光试剂盒（碧云天，BeyoECL Plus）。
1.细胞裂解工作液配置：自己配RIPA:PMSF=100:1。
2.加入裂解液：方法:1：倒掉废液培养基，用PBS洗三次，加入1ml SDS裂解液（或RIPPA: PMSF=100:1），在培养瓶中吹匀一遍。
吸取上清液至1.5ml EP管中，并置于冰上。
3.离心：离心机先开机预冷，然后4℃，12000rpm/min—15000rpm/min离心15min，收集上清液到新的1.5mlEP管中，不要吸到底部白色沉淀。
4.BCA法测定蛋白浓度：（1）蛋白标准工作液的配置与分装：取30mg蛋白标准品（BSA）加入1.2ml的蛋白标准配置液中，配置成浓度为25mg/ml的蛋白质标准液。
取上述蛋白标准液20ul,加入980ul PBS 中，配成0.5mg/ml的蛋白标准工作液，分装标记好并保存在-20℃冰箱中待用。
慢病毒感染细胞 操作手册
慢病毒感染细胞实验方法一、实验概述培养生长状态良好的目的细胞，根据慢病毒感染预实验结果设计各组实验条件，进行正式感染。
若为荧光标记的慢病毒感染，参照预实验确定的感染时间点，于荧光显微镜下观察GFP表达情况，荧光率达70-80％左右，细胞汇合度达80%左右，收集细胞进入下游实验。
若为抗性基因（如Puromycin）标记的慢病毒感染，感染48 h-72h后，使用抗生素筛选48h，收集细胞汇合度70%-80%左右的生长状态良好的细胞进行下游实验。
二、实验材料1.主要试剂试剂名称试剂来源cat.No.胎牛血清Ausbian VS500TDMEM Corning 10-013-CVR胰酶生工生物工程（上海）股份有限公司T0458-50G Puromycin Clontech 631305D-Hanks 上海吉凯基因技术有限公司配制2.主要仪器仪器名称仪器来源cat.No.荧光显微镜奥林帕斯IX71CO2培养箱日本三洋SANYO MCO-175倒置显微镜上海蔡康光学仪器有限公司XDS-100离心机赛默飞世尔科技(中国)有限公司Fresco 21生物安全柜上海振样创空气净化设备有限公司Bio 1200-Ⅱ-A2三、实验步骤1．准备目的细胞（1）从液氮罐中取出细胞冻存管，迅速放入37℃水浴中，并不时摇动使其尽快解冻。
（2）完全解冻后，1300 rpm，离心3 min，75%酒精擦拭冻存管消毒后，移至生物安全柜。
（3）吸去冻存液上清，加入1 mL新鲜的完全培养基重悬细胞，将细胞悬液接种至含有3 mL完全培养基的6-cm dish 中，轻轻晃匀后置于37℃、5% CO2培养箱。
（4）24 h后更换一次培养液继续培养，待细胞汇合度达80%左右传代培养，保持细胞良好的生长状态。
2．目的细胞慢病毒感染（1）贴壁细胞：a.处于对数生长期的细胞胰酶消化，完全培养基制成3-5×104个/mL细胞悬液，并根据表1接种相应的细胞数到培养板中，继续培养保证感染时铺板量达到15-30%左右。
细胞实验的基本操作
细胞实验的基本操作【细胞培养】一、细胞的复苏：非原代培养的细胞一般冻存于液氮之中，需要培养时要先从液氮中取出使之复苏。
细胞复苏的原则——快速融化：必须将冻存在－196℃液氮中的细胞快速融化至37℃，使细胞外冻存时的冰晶迅速融化，避免冰晶缓慢融化时进入细胞形成再结晶，对细胞造成损害。
具体操作如下：1、实验前准备：1.1、将水浴锅预热至37℃，并将含10%FBS的培养液置于其中预热；。
1.2、用75％酒精擦拭紫外线照射30min的超净工作台台面。
1.3、在超净工作台中按次序摆放好消过毒的离心管、吸管、培养瓶等等。
2、取出冻存管及迅速解冻：2.1、根据细胞冻存记录按标签找到所需细胞的编号。
2.2、从液氮罐中取出细胞盒，取出所需的细胞，同时核对管外的编号。
2.3、迅速将冻存管投入到已经预热的水浴锅中迅速解冻，并要不断的摇动，使管中的液体迅速融化，约1-2min后冻存管内液体完全溶解，取出用酒精棉球擦拭冻存管的外壁，再拿入超净台内。
3、平衡离心将细胞悬液吸到离心管中，1000～1500rpm离心3分钟；4、制备细胞悬液吸去上清液，加入10 ml培养液，用吸管轻轻吹打均匀，使细胞悬浮；5、细胞计数细胞浓度以5×105/ml为宜。
6、培养细胞将复合细胞计数要求的细胞悬液吸到培养瓶中，将培养瓶放入37℃和5％CO2的培养箱内培养（略微拧松培养瓶盖），换液的时间由细胞情况而定。
通常，除少数特别注明对DMSO 敏感的细胞外，绝大部分细胞株（包括悬浮性细胞），在解冻之后，可直接放入含有10-15ml（5－10倍）新鲜培养基的培养角瓶中，待隔天再置换新鲜培养基以去除DMSO 即可，如此可避免大部分解冻后细胞无法生长或贴附的问题。
二、细胞的传代：培养的细胞生长至一定密度之后，由于培养液中营养逐渐消耗、代谢物逐步积累（可见到培养液变黄），而且细胞的生长空间也受到限制，就会影响到细胞的继续生存。
这时就需要分离出一部分细胞和更新培养液，这一过程就叫做传代。
亚细胞定位实验操作步骤
亚细胞定位实验操作步骤亚细胞定位⼀、实验材料玻⽚，镊⼦，75%酒精，细胞转染⽤物品，PBS，4%多聚甲醛，Trixon-X-100，铝箔，摇床，DAPI染⾊液，荧光封⽚液，指甲油，载玻⽚，激光扫描共聚焦显微镜（型号：ZEISS LSM 510 META），光盘⼆、实验原理亚细胞定位是指某种蛋⽩或表达产物在细胞内的具体存在部位，如胞核，胞浆内，细胞膜或某⼀特定细胞器上存在。
通常是将⽬的蛋⽩与报告基因（如绿⾊荧光蛋⽩基因EGFP、红⾊荧光蛋⽩基因Dsred等）融合表达，在激光共聚焦显微镜下观察荧光的表达部位从⽽致使⽬的蛋⽩在细胞内的定位。
DAPI，4，6-联脒-2-苯基吲哚，是⼀种标记细胞核的荧光染料，因其与dsDNA有⾼度的亲和⼒，与DNA结合后会发出强烈的荧光。
激光共聚焦扫描显微技术（Confocal laser scanning microscopy）是⼀种⾼分辨率的显微成像技术。
普通的荧光光学显微镜在对较厚的标本（例如细胞）进⾏观察时，来⾃观察点邻近区域的荧光会对结构的分辨率形成较⼤的⼲扰。
共聚焦显微技术的关键点在于，每次只对空间上的⼀个点（焦点）进⾏成像，再通过计算机控制的⼀点⼀点的扫描形成标本的⼆维或者三维图象。
在此过程中，来⾃焦点以外的光信号不会对图像形成⼲扰，从⽽⼤⼤提⾼了显微图象的清晰度和细节分辨能⼒。
三、操作程序与结果判定（结合⾃⼰的经验将可能遇到的问题及解决办法也列出）1、细胞爬⽚的处理细胞爬⽚可以买专门的爬⽚（⼀般直径14mm的⼩圆玻⽚正好适合24孔板的⼤⼩），在超净台中取出后⽤75%酒精浸泡5-10分钟，⽤镊⼦夹取后在酒精灯上过⽕后轻轻放⼊细胞板内（放前可事先在孔内滴⼀滴⽣长液以避免玻⽚与细胞板之间出现⽓泡）。
此后再接⼊适量消化好的细胞。
注意: 1、不建议将爬⽚泡酸后⾼压灭菌，⾸先玻⽚太薄⾼压容易使玻⽚变形，其次湿灭很容易使玻⽚上留下⽔渍影响细胞贴壁；2、接细胞时控制合适的细胞量，避免收样时细胞量过度拥挤甚⾄打堆影响结果的观察。
细胞周期实验标准操作流程
细胞周期实验标准操作流程1.种板细胞个数：5mL含5×106个的细胞悬液种在75mL培养瓶中。
2.加药处理足够的时间后，终止反应；3.收集细胞（加药后细胞还需收集培养液中的细胞）；4.PBS洗2次，1000r/min离心10min；5.用1mL的PBS悬浮细胞后置入15mL离心管中，在漩涡振荡器上，边振荡边缓慢加入共9mL体积的70%的预冷冰乙醇。
盖上盖子；6.将固定好的细胞放入-20℃保存（可长期保存，但至少要过夜）；7.使用前，1000r/min离心10min弃去70%冰乙醇，用预冷的PBS洗涤2次；8.用0.5mL的50µg/mLRNase（用PBS配）悬浮细胞后，置37℃水浴中30min；9.最后加入25µL1mg/mLPI（用PBS配），避光染色30min；10.上流式细胞仪Ari aⅢ检测细胞周期。
注意事项：1.做早期凋亡（annexin V和PI双染）实验，需要准备一管未染色的细胞；细胞周期全部样品都需要加入PI染料；2.如果用试剂盒或者之前已经配好Rnase和PI浓度也不要紧。
原则是要求：Rnase和PI的终浓度都能达到50µg/mL。
雪 2011-12-8 9:26:21小莫，做细胞周期实验需要养细胞洪雪 2011-12-8 9:26:29把药物加到细胞里面洪雪 2011-12-8 9:26:38用细胞来测周期的洪雪 2011-12-8 9:27:12你让你老婆先了解一下大概的情况，要是真的想做，再联系我洪雪 2011-12-8 9:27:24我们仪器试运行到这个学期期末洪雪 2011-12-8 9:27:42试运行期间不收费洪雪 2011-12-8 9:28:21不收测试费，但是需要自己准备染料等其他的。
我们只帮测和分析数据缘 10:00:57好的，谢谢缘 10:01:07是你在测吗洪雪 10:03:08是的洪雪 10:03:20她有学生在养细胞吗？缘 10:03:27有啊洪雪 10:03:44在哪里养缘 10:03:48刘观艳在养缘 10:03:54在六楼洪雪 10:04:24那她要测的那几个化合物做过MTT吗？缘 10:04:37做过了10:04:53成功接收文件打开文件打开所在文件夹洪雪 10:04:55那你把这个给她缘 10:04:57好像是在中国药科大学做的洪雪 10:05:06让她按这个来准备做周期的样品洪雪 10:05:35但是她还没有RNA酶和PI呀，这个得买缘 10:05:47这个要多少钱洪雪 10:06:02看你要什么公司的了缘 10:06:10你们经常用的洪雪 10:06:24我们这边用的是SIGMA的洪雪 10:06:47但是这个要至少一个月才买得回来，有点久洪雪 10:07:03你想下其他的办法缘 10:07:06好的洪雪 10:07:18或者去和彭老师借一点洪雪 10:07:26阿远之前用过的洪雪 10:07:30她做过洪雪 10:07:36我之前配了好多洪雪 10:07:40在细胞房缘 10:07:47好的，那我问一下洪雪 10:07:52恩洪雪 10:08:11我们这边上班时间的下午开机。
普诺赛生物细胞培养操作指南说明书
普诺赛生物细胞培养操作指南Operating Instruction of Cell Culture目录收到常温细胞后如何处理？ (2)温馨提醒 (3)贴壁细胞传代 (4)悬浮细胞传代 (5)细胞冻存 (6)细胞复苏 (7)细胞培养常见问题及解决方法 (8)收到常温细胞后如何处理？1.首先，观察细胞培养瓶是否完好，培养液是否有漏液、浑浊等现象。
若有，请拍照，并及时与普诺赛技术支持联系（所拍照片将作为后续服务依据）。
2.用75%酒精擦拭细胞培养瓶表面，显微镜下观察细胞状态。
因运输问题，部分贴壁细胞会有少量从瓶壁脱落；先不要打开培养瓶盖，将细胞置于细胞培养箱内静置培养2-4小时，以便稳定细胞状态。
3.仔细阅读细胞说明书，了解细胞相关信息，如贴壁特性（贴壁/悬浮）、细胞形态、所用基础培养基、血清比例、所需细胞因子、传代比例、换 液频率等。
4.静置完成后，取出细胞培养瓶，镜检、拍照，记录细胞状态（所拍照片将作为后续服务依据）；建议细胞传代培养后，定期拍照、记录细胞生长状态。
5.贴壁细胞：若细胞生长密度超过80%，可正常传代；若未超过80%，移除细胞培养瓶内培养基，预留5ml左右继续培养，直至细胞密度达80%左右再进行传代操作，瓶盖可稍微拧松。
6.悬浮细胞：将细胞培养瓶内液体全部转移至50ml无菌离心管内，1200rpm离心5min，离心后上清培养基可收集备用，管底细胞沉淀加入5ml培养基吹打、重悬。
镜检时，若细胞密度超过80%，可将细胞悬液分至2个细胞培养瓶内培养，补加培养基至5ml；若细胞密度未超过80%，将细胞悬液移至原瓶继续培养，直至细胞密度达80%左右时再进行传代操作。
温馨提醒1.可将培养瓶内多余的培养基转移至50ml无菌离心管中，备用；细胞首次传代时，可以将该培养基按照一定比例和客户自备的培养基混合使用，让细胞逐渐适应培养条件。
2.确认细胞状态良好后，应及时将部分细胞冻存，再进行后续的实验，避免后期实验失误可能发生细胞污染或死亡而导致的细胞丢失，影响后续实验。
标准操作规程(SOP)——细胞计数
一、目的细胞计数法是细胞学实验中进行细胞计数的基本方法，通过细胞计数，能够保证实验的准确性、稳定性和可重复性。
二、范围适用于中国国家流感中心的所有技术人员进行细胞计数的操作。
三、定义细胞计数法是用来计数细胞悬液中细胞数量的一种方法。
一般利用计数板（红细胞计数板）进行。
即可用于分离（散）细胞培养接种前计数所制备的细胞悬液中的细胞数量，也可用于对培养物的细胞数量进行计数。
不论计数的对象如何，均须制备分散的细胞悬液。
四、程序（一）生物安全要求实验室生物安全级别：BSL-2（二）材料1．生长成片的MDCK 细胞2．血细胞计数板3．1mL 、10mL 无菌移液管4．台盼蓝（0.4% PBS 溶液）建议：经常检查试剂使用的有效期（三）实验步骤1．消化细胞（方法见MDCK 细胞培养标准操作规程）。
2．用血细胞计数板来计算细胞悬液中的细胞数，需要充分分散细胞。
3．在18μL 台盼蓝（0.4% PBS 溶液）中加入2μL 细胞悬液，混匀，成10倍标准操作规程（SOP稀释。
死细胞被染成蓝色。
4．将以上细胞悬液加入到血球计数板的载玻片与盖玻片之间的计数室中，在显微镜下计数。
5．计算计数室四个角上三线包围的正方形中的活细胞，压线的细胞计数遵循计数原则，数上不数下，数左不数右。
如果观察到成片或者成团的细胞，应重新悬浮细胞液，重新计数。
用以下公式计算每毫升悬液中活细胞的数量。
C=4个角正方形内的活细胞总数/4×104×10C：每毫升活细胞数；五、参考文件《流行性感冒诊断标准》。
大肠杆菌感受态细胞制备实验(CaCl2法) (PDF)
大肠杆菌感受态细胞制备实验（CaCl2法）细胞经过一些特殊方法（电击法、CaCl2法）等处理后，细胞膜的通透性发生了暂时性的改变，成为能允许外源DNA分子进入的细胞，即感受态细胞（Compenent cells）。
1实验方法原理：带有外源DNA 的重组质粒，在体外构建后，导入宿主细胞，随着细胞的大量复制、繁殖，才能够有机会获得纯的重组质粒DNA，该过程称之为转化过程。
受体细胞经过一些特殊方法（如：CaCl2，RuCl 等化学试剂）的处理后，细胞膜的通透性发生变化，能容许外源DNA 的载体分子通过。
2实验材料、试剂、仪器耗材：E. coli DH5α菌株LB固体培养基、LB液体培养基、CaCl2、硫酸镁、SOB、TFB等培养皿、恒温摇床、聚丙烯管、电热恒温培养箱、台式高速离心机、无菌工作台、烧瓶、恒温水浴锅、低温冰箱、制冰机、分光光度计、微量移液枪、锥形瓶、试管等3实验步骤：1、从37℃培养16-20 h的平板中挑取一个单菌落(直径2-3 mm)，转到一个含有100 ml LB 或SOB培养基的1L烧瓶中。
于37℃剧烈振摇培养3 h。
一般经验，1 OD600约含有大肠杆菌DH5α 109 个/mL。
2、将细菌转移到一个无菌、一次性使用的、用冰预冷的50 ml聚丙烯管中，在冰上放置10 min，使培养物冷却至0℃。
3、于4℃用Sorvall GS3特头（或与之相当的转头）以4 100 r/min离心10 min，以回收细胞。
4、倒出培养液，将管倒置1 min以使最后的痕量培养液流尽。
5、每50 ml初始培养液用30 ml预冷的0.1 mol/LCaCl2-MgCl2溶液(80 mmol/L MgCl2，20 mmol/L CaCl2)重悬每份细胞沉淀。
6、于4 ℃用Sorvall GS3转头（或与之相当的转头）以41 00 r/min离心10 min，以回收细胞。
7、倒出培养液，将管倒置1 min以使最后的痕量培养液流尽。
细胞计数方法细胞计数板法
细胞计数⽅法细胞计数板法细胞计数⽅法------细胞计数板法实验原理：当待测细胞悬液中细胞均匀分布时，通过测定⼀定体积悬液中的细胞的数⽬，即可换算出每毫升细胞悬液中细胞的细胞数⽬。
具体操作：1. 将计数板及盖⽚擦拭⼲净，并将盖⽚盖在计数板。
2. 将细胞悬液吸出少许，滴加在盖⽚边缘，使悬液充满盖⽚和计数板之间，静置3min，注意盖⽚下不要有⽓泡，也不能让悬液流⼊旁边槽中。
3. 计算板四⼤格细胞总数，压线细胞只计左侧和上⽅的。
然后按公式计算：细胞数/mL=四⼤格细胞总数/4×104个/ml(注：当细胞很多时，可在四个⼤格中选⼀定数⽬较平均的⼩格，由于每⼤格中有16个⼩格，然后对选定的⼩格计左侧和上⽅的细胞数，求出每⼩格的细胞数，取平均值m，m×16即每个⼤格的平均值。
所以，细胞密度=m×16×104个/ml) 说明：公式中除以4，因为计数了4个⼤格的细胞数。
公式中乘以104因为计数板中每⼀个⼤格的体积为：1.0mm（长）×1.0mm（宽）×0.1mm（⾼）=0.1mm3⽽1ml=1000ul=1000mm3（注意：镜下偶见有两个以上细胞组成的细胞团，应按单个细胞计算，若细胞团10%以上，说明分散不好，需重新制备细胞悬液。
）================================================细胞计数板的使⽤⼀、⾎球计数板-基本构造⾎球计数板是⼀块特制的厚型载玻⽚，载玻⽚上有四个槽构成三个平台。
中间的平台较宽，其中间⼜被⼀短横槽分隔成两半，每个半边上⾯各刻有⼀⼩⽅格⽹，每个⽅格⽹共分九个⼤格，中央的⼀⼤格作为计数⽤，称为计数区。
计数区的刻度有两种：⼀种是计数区分为16个⼤⽅格（⼤⽅格⽤三线隔开），⽽每个⼤⽅格⼜分成25个⼩⽅格；另⼀种是⼀个计数区分成25个⼤⽅格（⼤⽅格之间⽤双线分开），⽽每个⼤⽅格⼜分成16个⼩⽅格。
细胞规程
生物制品生产和检定用动物细胞基质制备及检定规程本规程适用于人用生物制品生产用动物细胞基质及检定用动物细胞，包括具有细胞库体系的细胞及原代细胞。
细胞基质系指可用于生物制品生产的所有动物或人源的连续传代细胞系、二倍体细胞株及原代细胞。
生产非重组制品所用的细胞基质，系指来源于未经修饰的用于制备其主细胞库的细胞系/株和原代细胞。
生产重组制品的细胞基质，系指含所需序列的、从单个前体细胞克隆的转染细胞。
生产杂交瘤制品的细胞基质，系指通过亲本骨髓瘤细胞系与另一亲本细胞融合的杂交瘤细胞系。
一、对生产用细胞基质总的要求用于生物制品生产的细胞系/株均须通过全面检定，须具有如下相应资料，并经国务院药品监督管理部门批准。
（一）细胞系/株历史资料1. 细胞系/株来源资料应具有细胞系/株来源的相关资料，如细胞系/株制备机构的名称，细胞系/株来源的种属、年龄、性别和健康状况的资料。
这些资料最好从细胞来源实验室获得，也可引用正式发表文献。
人源细胞系/株须具有细胞系/株的组织或器官来源、种族及地域来源、年龄、性别及健康状况及病原体检测结果的相关资料。
动物来源的细胞系/株须具有动物种属、种系、饲养条件、组织或器官来源、地域来源、年龄、性别、供体的一般健康状况及病原体检测结果的相关资料。
如采用已建株的细胞系/株，应具有细胞来源的证明资料。
应从能够提供初始细胞历史及其溯源性书面证明材料的机构获得，且应提供该细胞在该机构的详细传代记录，包括培养过程中所使用的所有原材料的详细信息，如种类、来源、批号、生产日期及有效期、制备或使用方法、质量标准及检测结果等。
2．细胞系/株培养历史的资料应具有细胞分离方法、细胞体外培养过程及建立细胞系/株过程的相关资料，包括所使用的物理、化学或生物学手段，外源插入序列，筛选细胞所进行的任何遗传操作或筛选方法、在动物体内传代过程以及细胞生长特征、培养液成分等。
同时还应具有细胞鉴别、内源及外源因子检查结果的相关资料。
细胞换液详细流程
1:00 进实验室1:20 肥皂洗手，1）打开细胞室空调，照明灯，换拖鞋进更衣间，更衣，打开细胞间内照明灯，2）依次将培养液、PBS从4℃取出，通过细胞间内放传递窗，关闭传递窗。
3）打开操作台电源开关，吹强风，打开紫外。
4）出细胞间，关闭细胞间照明灯。
5）脱无菌衣。
将培养液、PBS从传递窗拿出，放外间凳子上。
6）关闭细胞室照明灯，打开紫外，打开传递窗紫外。
2:00 肥皂洗手，1）进细胞室，关闭细胞室紫外，打开照明灯，关闭传递窗紫外，2）将培养基、PBS放入传递窗。
3）换拖鞋进更衣间，更衣，打开细胞间内照明灯，4）关闭超净台紫外，改为照明，风力中档，带无菌手套，5）将培养基、PBS、垃圾桶从传递窗取出，6）75%酒精喷手及物品，放入超净台，7）凡是带入超净工作台内的酒精、PBS、培养基、胰酶的瓶子均要用75％酒精喷洒。
8）点燃酒精灯，75%棉球擦拭台面。
9）将PBS置于酒精灯附近加热，PBS若太冷容易使细胞脱落。
10）枪用之前先用酒精擦拭。
11）离开超净台，拉下玻璃门。
12）酒精喷手，打开培养箱，于培养箱内旋紧瓶盖，头勿伸入。
13）取出，看培养液颜色，镜下观察细胞生长状况。
14）HePG2细胞一般两天换一次液，培养液不再是新鲜的粉红色，或为橙色甚至黄色。
15）酒精喷培养瓶，放超净台。
16）靠近酒精灯火焰操作。
17）器皿使用前必须过火灭菌18）继续使用的器皿（如瓶盖、滴管）要放在高处，使用时仍要过火。
19）打开培养基、PBS封口膜，酒精棉球再擦一下，酒精灯烤干。
20）摇一下，翻过来，打开瓶盖，在酒精灯上烧口消毒，倒掉旧培养液。
21）各种操作要靠近酒精灯，动作要轻、准确，不能乱碰。
如吸管不能碰到废液缸。
22）半干棉球吸去瓶口余液，再烘一下。
23）吸取两种以上的使用液时要注意更换吸管，防止交叉污染。
24）吸液时不可太猛，枪须竖直拿，以防液体污染枪。
25）加PBS液2ml，沿皿壁向无细胞一侧加，注意枪头不能碰瓶口26）摇一下，翻过来，倒掉，半干棉球吸去瓶口余液，再烘一下。
病毒感染细胞实验整体流程及原理
成都百美科生物QQ7742053病毒感染细胞实验整体流程及原理目的基因不能直接整合到大多数真核细胞，常用的手段是将目的基因包装成病毒来感染细胞，从而得到表达满足实验需求。
1、病毒的种类病毒有很多种，常见的有慢病毒和腺病毒1.1慢病毒1.1.1原理慢病毒（Lentivirus）是逆转录病毒的一种。
构建的siRNA / miRNA慢病毒载体，与化学合成的siRNA 和基于瞬时表达载体构建的普通siRNA 载体相比，一方面可以扩增替代瞬时表达载体使用，另一方面，Lentivirus-siRNA 克隆经过慢病毒包装系统包装后，可用于感染依靠传统转染试剂难于转染的细胞系如原代细胞、悬浮细胞和处于非分裂状态的细胞，并且在感染后可以整合到受感染细胞的基因组，进行长时间的稳定表达。
1.1.2特点1）直接包装成为假病毒颗粒，对分裂和非分裂细胞均有感染作用，适合RNAi 研究和体内实验中难于转染的细胞(比如神经元细胞、干细胞或其它原代细胞)。
2）可以通过简单方式，在短时间内获得稳定表达特定基因的多种细胞株。
3）可用于基因敲除、基因治疗和转基因动物研究。
4）无需任何转染试剂，操作简便。
5）可以根据客户需要制备多种标记。
1.1.3慢病毒包装简要流程：1）含有目的基因的慢病毒RNAi 干扰载体的构建和质粒纯化提取。
2）慢病毒载体，包装系统共转染病毒包装细胞293T等。
3）培养48hrs - 72hrs 左右，收集含有病毒的上清培养液。
4）病毒的纯化和浓缩。
5）分装、- 80 ℃保存。
6）滴度测定目的基因检定，并出具检测报告。
1.2、腺病毒成都百美科生物QQ77420531.2.1原理腺病毒(Adenovirus，Ad)是一种无包膜的线状双链DNA病毒，其复制不依赖于宿主细胞的分裂。
有近50个血清型，大多数Ad载体都是基于血清型2和5，通过转基因的方式取代E1和E3基因，降低病毒的复制能力。
这些重组病毒仅在高水平表达E1和E3基因的细胞中复制，因此是一种适用于治疗的高效控制系统。
细胞增殖实验(Brdu法)
细胞增殖实验(Brdu法)1.将盖玻片放入到24孔板中，将长满的大盘细胞用胰酶消化后，按1-2万个细胞/孔加入到24孔板中。
2.待细胞长至50%-60%的密度后，更换培养液，导入相应质粒，4-6小时后更换培养液。
3.培养24h后，于每孔板加入10µm的Brdu，继续培养4h。
4. 4％冷的多聚甲醛固定20分钟，PBS洗三遍。
5. 0.2％Triton X－100通透10分钟，PBS洗三遍。
6. 按1:1000稀释Brdu抗体，于每孔中加300µl，4度过夜后，PBS洗三遍。
7.0.5ug/ml DAPI染核，然后直接照荧光片。
8.蒸馏水洗掉PBS，甘油封片，指甲油封片子的四周。
4%20min甲醇+30%丙酮）PBS3×5min穿孔15min()PBS×5min加入5%BSA Brdu，于4℃杂交过夜PBS×5min染色2min1.将盖玻片放入到24孔板中，将长满的大盘细胞用胰酶消化后，按1-2万个细胞/孔加入到24孔板中。
2.待细胞长至50%-60%的密度后，取出细胞爬片，3. 4％冷的多聚甲醛固定20分钟，PBS洗两遍。
4. 2N HCL in PBS(1:5 用PBS稀释盐酸) 室温10分钟5. neutralize by incubating the samples in borate buffer (0.1 M) for 10 min at room temperature.硼酸中和，PBS 3次4. Blocking buffer (5% BSA, PBS, Tween-20 0.2%)。
Goat serum 10%5. Blocking buffer封闭（5%BSA）1 小时6. BrdU(rat)/Cdk5(rabbit) 一抗4度过夜，PBS洗三遍。
7.二抗室温2小时（避光），或者37度1半小时，PBS洗三遍。
（一抗，二抗稀释到blocking buffer）Dip the cover silp into DD-H20, and air-dry in filter-paper.8. Anti-fade with DAPI,put the coversilp up-side down,然后直接照荧光片。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
细胞实验的基本操作【细胞培养】一、细胞的复苏：非原代培养的细胞一般冻存于液氮之中，需要培养时要先从液氮中取出使之复苏。
细胞复苏的原则——快速融化：必须将冻存在－196℃液氮中的细胞快速融化至37℃，使细胞外冻存时的冰晶迅速融化，避免冰晶缓慢融化时进入细胞形成再结晶，对细胞造成损害。
具体操作如下：1、实验前准备：1.1、将水浴锅预热至37℃，并将含10%FBS的培养液置于其中预热；。
1.2、用75％酒精擦拭紫外线照射30min的超净工作台台面。
1.3、在超净工作台中按次序摆放好消过毒的离心管、吸管、培养瓶等等。
2、取出冻存管及迅速解冻：2.1、根据细胞冻存记录按标签找到所需细胞的编号。
2.2、从液氮罐中取出细胞盒，取出所需的细胞，同时核对管外的编号。
2.3、迅速将冻存管投入到已经预热的水浴锅中迅速解冻，并要不断的摇动，使管中的液体迅速融化，约1-2min后冻存管内液体完全溶解，取出用酒精棉球擦拭冻存管的外壁，再拿入超净台内。
3、平衡离心将细胞悬液吸到离心管中，1000～1500rpm离心3分钟；4、制备细胞悬液吸去上清液，加入10 ml培养液，用吸管轻轻吹打均匀，使细胞悬浮；5、细胞计数细胞浓度以5×105/ml为宜。
6、培养细胞将复合细胞计数要求的细胞悬液吸到培养瓶中，将培养瓶放入37℃和5％CO2的培养箱内培养（略微拧松培养瓶盖），换液的时间由细胞情况而定。
通常，除少数特别注明对DMSO 敏感的细胞外，绝大部分细胞株（包括悬浮性细胞），在解冻之后，可直接放入含有10-15ml（5－10倍）新鲜培养基的培养角瓶中，待隔天再置换新鲜培养基以去除DMSO 即可，如此可避免大部分解冻后细胞无法生长或贴附的问题。
二、细胞的传代：培养的细胞生长至一定密度之后，由于培养液中营养逐渐消耗、代谢物逐步积累（可见到培养液变黄），而且细胞的生长空间也受到限制，就会影响到细胞的继续生存。
这时就需要分离出一部分细胞和更新培养液，这一过程就叫做传代。
1、贴壁细胞的传代具体操作如下：1.1、传代前准备：1.1.1、预热培养用液：把装有培养液、PBS和胰蛋白酶的瓶子放入37℃水浴锅内预热。
1.1.2、用75％酒精擦拭双手和经过紫外线照射的超净工作台1.1.3、正确摆放使用的器械：保证足够的操作空间，不仅便于操作而且可减少污染。
1.1.4、点燃酒精灯：注意火焰不能太小。
1.1.5、准备好将要使用的已灭菌的空培养瓶。
1.1.6、取出已经预热好的培养用液，用酒精棉球擦拭好后方能放入超净台内。
1.1.7、从培养箱内取出细胞，注意取出细胞时要旋紧瓶盖，用酒精棉球擦拭显微镜的台面，再在镜下观察细胞，并做好记录。
1.1.8、细胞培养瓶经用75％酒精擦拭后，再放入超净台。
1.2、胰蛋白酶消化：1.2.1、将瓶盖过酒精灯火焰消毒后，打开瓶盖，靠近酒精灯，小心吸出旧培养液，用PBS清洗2－3次，沿壁（无细胞的一面）缓缓加入适量消化液（胰蛋白酶液），轻轻摇晃。
注意消化液的量以盖住细胞最好，最佳消化温度是37℃。
1.2.2、显微镜下观察细胞：倒置显微镜下观察消化细胞，若胞质回缩，细胞之间不再连接成片，表明此时细胞消化适度。
1.3、吹打分散细胞：1.3.1、弃去大部分消化液（仅留少量在瓶内），并轻轻拍打培养瓶，使细胞分散，然后加入新鲜的培养液，再用吸管轻轻吹打成细胞悬液（尽可能不要出现泡沫，否则对细胞有损伤〕1.4、分装稀释细胞1.4.1、将细胞悬液吸出分装至2-3个培养瓶中，加入适量培养基旋紧瓶盖。
1.4.2、倒置显微镜下观察细胞量，必要时计数。
注意密度过小会影响传代细胞的生长，传代细胞的密度应该不低于5×105/ml。
最后在瓶上做好标记，如细胞代数、日期及姓名等。
1.5、继续培养：1.5.1、用酒精棉球擦拭培养瓶，适当旋松瓶盖，放入CO2培养箱中继续培养。
传代细胞2小时后开始贴附在瓶壁上。
当生长细胞铺展面积占培养瓶底面积25％时为一个＋，占50％为＋＋，占75％时为＋＋＋。
2、悬浮细胞的传代悬浮细胞可以直接将培养瓶中的液体吸掉，只留下少量，然后加入新鲜培养液即可。
当细胞悬液中碎片或颗粒物较多，感觉到比较脏时，可以将悬液移到离心管内，1000～1500rpm离心3分钟，弃上清，加入约2ml培养液，吹打至均匀，滴加2-3滴至已加入新鲜培养液的培养瓶中。
然后置于二氧化碳培养箱中培养（拧松培养瓶盖）。
三、细胞的冻存细胞冻存的原则是要逐步缓慢降温，以避免细胞内部形成冰晶对细胞造成伤害。
1、具体操作如下：1.1、从增值期到形成致密单层以前的细胞都可以用于冻存，但最好选择对数增长期细胞，已长满的细胞冻存复苏后生存率低。
在冻存前一天最好换一次培养液。
1.2、贴壁细胞经消化、离心（1000～1500rpm，5min）收集，悬浮细胞经离心收集；1.3、大约106个细胞加入1ml冻存液（10％DMSO+90%血清），用吸管吹打，使细胞分散成单细胞悬液；1.4、加入到冻存管中，每个冻存管加1－1.5ml的细胞悬液；密封；1.5、在冻存管上标明细胞名称及冻存日期；1.6、将冻存管直立放置于塑料盒或纸盒内，管置于4℃半小时，然后置于-20℃两小时，再置于-70℃两小时，然后置于液氮上方过夜；第二天将细胞置于液氮中；1.7、记下冻存管存放的位置，作好冻存记录（冻存的细胞名称、代数、冻存日期等）。
2、注意事项：2.1、使用DMSO前，不需要进行高压灭菌，它本身就有灭菌的作用。
高压灭菌反而会破华它的分子结构，以至于降低冷冻保护效果。
在常温下，DMSO对人体有害，故在配制时最好戴上手套操作。
2.2、不宜将冻存细胞放置在0℃～-60℃这一温度范围内过久，低温损伤主要发生在这一温度区内，是“危险温区”。
2.3、注意定期检查液氮罐内液氮量，及时添加。
2.4、细胞在液氮中贮存的时间理论上是无限的。
但为妥善起见，特别是很多未被冻存过的细胞在首次冻存后要在短期内复苏一次，观察细胞对冻存的适应性。
已建系的细胞最好也每年取一支复苏一次后，再继续冻存。
四、细胞计数实验原理：当待测细胞悬液中细胞均匀分布时，通过测定一定体积悬液中的细胞的数目，即可换算出每毫升细胞悬液中细胞的细胞数目。
具体操作如下：1、准备工作：取一瓶传代的细胞，按上述二的传代方法繁殖细胞，待长成单层后以使用。
2、细胞悬液制备：细胞悬液的制备方法：用0.25％的胰蛋白酶液消化、PBS液洗涤后，加入培养液（或Hanks液或PBS等平衡盐溶液），吹打制成待测单细胞悬液。
3、细胞计数：2.1、盖好盖玻片：取一套血球计数板，将特制的盖玻片盖在血球计数槽上。
2.2、制备计数用的细胞悬液：用吸管吸适量细胞悬液（如5滴）到一离心管中，加入等体积台盼蓝染液（0.4％）或苯胺黑，活细胞不会被染色，加入染液后就可以在显微镜下区别活细胞和死细胞。
若仅是单纯的进行细胞计数，不考虑细胞的活力，则可省略台盼蓝染色步骤。
2.3、、将细胞悬液滴入计数板：将待测细胞悬液吹均匀，然后吸取少量悬液沿盖片边缘缓缓滴入，要保证盖片下充满悬液，注意盖片下不要有气泡，也不能让悬液流入旁边槽中。
2.4、统计四个大格的细胞数：将血球计数板放于显微镜的低倍镜下观察，并移动计数板，当看到镜中出现计数方格后，数出四角的四个大格（每个大格含有16个中铬）中没有被染液染上色的细胞数目。
2.5、计算原细胞悬液的细胞数:按照下面公式计算细胞密度：（细胞悬液的细胞数）/ml＝（四个大格子细胞数/4) ×2×104说明：公式中除以4因为计数了4个大格的细胞数。
公式中乘以2因为细胞悬液于染液是1：1稀释。
公式中乘以104因为计数板中每一个大格的体积为：1.0mm（长）×1.0mm（宽）×0.1mm（高）＝0.1mm3 ；而1ml＝1000mm3细胞计数要点：①进行细胞计数时，要求悬液中细胞数目不低于104个/ml，如果细胞数目很少要进行离心再悬浮于少量培养液中；②要求细胞悬液中的细胞分散良好，否则影响计数准确性。
③取样计数前，应充分混匀细胞悬液，尤其时多次取样计数时更要注意每次取样都要混匀，以求计数准确；④数细胞的原则是只数完整的细胞，若细胞聚集成团时，只按照一个细胞计算。
如果细胞压在格线上时，则只计上线，不计下线，只计右线，不计左线。
⑤操作时，注意盖片下不能有气泡，也不能让悬液流入旁边槽中，否则要重新计数。
注：4％台盼蓝母液的配制：称取4克台盼蓝，加入少量蒸馏水研磨，加双蒸水至100毫升，用滤纸过滤，4℃保存。
使用时，用PBS稀释至0.4％。
五、细胞活力的测定1.染料排斥试验：其原理是细胞损伤或死亡时，某些染料可穿透细胞膜，与解体的DNA结合，使其着色。
而活细胞则能阻止该染料进入细胞内。
借此可鉴别死细胞和活细胞。
常用的染料有台盼蓝、伊红Y和苯胺黑等。
以台盼蓝染色为例。
步骤同上述细胞计数的操作步骤。
注意以下几点:①计数：在3－10min内，用血球计数板分别计数活细胞和死细胞（死细胞被染成淡蓝色，活细胞则拒染）。
②台盼蓝染色时，时间不宜太长，否则活细胞也会着色，从而干扰计数。
③活细胞率（％）＝活细胞总数/(活细胞总数＋死细胞总数)×100％2、MTT比色实验：可测定测药物或病毒的IC50原理：活细胞线粒体琥珀酸脱氢酶催化四甲基偶氮唑盐(MTT)，还原成紫色不溶性结晶物，沉积于细胞中。
用酸性异丙醇或DMSO溶解后，于酶标仪上测定光吸收值。
紫色不溶性结晶物形成的多少与活细胞数目和功能状态相关。
2.1、将细胞接种于96孔板上，密度为大约105个/ml，每孔接种100μl；2.2、培养至对数生长期加入待测样品；2.3、作用一定的时间之后，加入三蒸水配制的5μg/ml的MTT溶液，每孔20μl；2.4、37℃温育4小时；2.5、取出培养板，小心吸去上清，注意不要吸掉底部的蓝紫色沉淀；如果是悬浮细胞则用板离心机离心后除去上清；2.6、每孔加入100μl的DMSO，摇床上摇动30分钟以使沉淀溶解；2.7、用酶联免疫检测仪（DNA Expert）在595nm（或490nm）波长处检测96孔平板中每孔细胞的光密度值（OD值），按下列公式计算药物或病毒对细胞生长的抑制率：细胞存活率（％）＝治疗组OD值/ 对照组OD值×100％2.8、求出各药物（或病毒）浓度下的OD值占对照OD值的百分比，用此百分比对药物（或病毒）浓度作图；在所得的曲线上，百分比值为50时所对应的浓度就是IC50值。
或根据各浓度下细胞的存活率，采用Logit法计算IC50。
六、细胞的运输装运细胞的方法有两种：1、冷冻贮存运输即利用特殊内内盛液氮或干冰冻存，保存效果较好，但较麻烦，且不能长时间运输，多需空运。
2、充液法2.1、选生长状态良好的细胞，去掉培养液，充满新培养液，液量要达到培养瓶颈部，拧紧螺帽或塞以胶塞，保留微量空气。