构建重组质粒基本方法解析

构建重组质粒基本方法

1. cDNA编码区片段的PCR扩增

50ul ×2

模版 1

5‘引物 1

3‘引物 1

dNTP 1

10×buffer 5

Taq 1

Milliq H2O 40

2．PCR产物纯化

1、加5倍体积的PB

2、将Spin柱放于2ml收集管上

3、加样液，14Krpm，离心1min

4、弃去排出液

5、加0.75ml PE, 14Krpm，离心1min

6、弃去排出液,14Krpm,离心1min

7、将Spin柱放在洁净1.5ml的Epp管中

8、往Spin柱的膜中央加入50μl的EB(或milliq H2O,静置2min, 14Krpm，离

心1min

3．双酶切

载体和PCR产物分别用一下条件进行双酶切（反应体系均为30ul，37℃，酶切n 小时）：

载体10ul PCR产物20ul

10x buffer3ul10x buffer3ul

100xBSA0.3ul100xBSA0.3ul

酶11ul酶11ul

酶21ul酶21ul

MilliQ H2O14.7ul MilliQ H2O 4.7ul

4．双酶切后的载体用试剂盒割胶回收

1. 割胶并称重，加3倍体积的QG（胶块每100mg约合100μl的体积）

2. 50℃，恒温10min，等到胶完全被溶解

3. 将一个Spin柱放在一个2ml的收集管中

4. 加样液，14Krpm，离心1min

5. 弃去排出液

6. 加0.75ml PE, 14Krpm，离心1min

7. 弃去排出液,14Krpm,离心1min

8. 将Spin柱放在洁净1.5ml的Epp管中

9. 往Spin柱的膜中央加入50μl的EB(或milliq H2O,静置2min, 14Krpm，离心

1min

5．连接

上述双酶切产物经过纯化（其中载体酶切产物割胶回收，PCR片段酶切后纯化步骤与上述PCR产物纯化步骤相同），在T4 DNA连接酶作用下16℃连接过夜。连接体系如下：

载体 2ul

PCR 片段 6ul

10xT4 buffer 1ul

T4 DNA ligase 1ul

6．转化

取上述连接液5μl转化到预先制备的DH5α化学感受态细胞中，冰浴30分钟，42℃热激2min,置冰上5min，加入1mlLB培养液37℃摇床45min，离心5000rpm，1-5min（不要离心太久，以免太实），最后均匀涂布在含有100 ng/ml 抗生素的LB平板上（100-150 ul）。将平板在37℃倒置培养过夜。挑取阳性克隆菌落转划到另一块含有100 ng/ml抗生素的LB平板上，并对之进行编号，37℃倒置培养过夜。

7．菌落原位PCR

挑取转划后长出的阳性克隆菌落，加入3ul细菌DNA提取液破细胞。将细菌裂解液作为PCR模板，其他PCR组分及PCR条件同上。PCR产物在2%凝胶上进行电泳分析。

8. QIAGEN试剂盒抽提质粒

1 用1.5ml管离心收集细菌，两次，共3ml左右。

2 加入250ul的预冷的P1，打匀后在震荡仪上高速震荡1min。

3 加入250ul P2，温和颠倒数次混匀。

4 （在5min内）加入冰上预冷的溶液 N3 350ul，迅速温和颠倒混匀，至出现

分散的絮状沉淀。

5 冰上静置2min后离心，13，000rpm，10min。

6 小心吸取上清于蓝色的spin柱中（勿吸到沉淀）

7 离心13，000rpm，1min，弃流出液

8 加入750ul PE，离心13，000rpm，1min，弃流出液

9 再离心一次，离心13，000rpm，1min，弃流出液。以让管内彻底干燥。

10 将spin柱拿出，置于一干净的1.5ml管中，小心的在spin柱中央加入30ul

MilliQ H2O，或者Elution Buffer，室温静置2min。

11 离心13，000rpm，1min，收集质粒，测浓度，电泳检测。