构建质粒经验
学会构建质粒这一招，你可以靠卖质粒发家致富啦！
学会构建质粒这一招，你可以靠卖质粒发家致富啦！你是否曾遇到这样的问题，老板让你研究一个新的基因，你需要用到这个基因的质粒，可是实验室没有师兄师姐研究过，所以光靠换载体这点技能已经不足以让你构建出你所需要的质粒了，然而公司的报价特别高，一千两千还是便宜的，甚至还有报价上万的质粒，并且货期很长，老板催促你要结果，或者不愿意花那么多钱给你买质粒，这时候你该怎么办？今天教的这一招，你以后都可以自己动手从零开始构建质粒啦。
构建质粒，最重要的是两样东西，一个是这个基因的CDS片段，另一个是空载，对于常做分子克隆的实验室，空载是肯定有的啦，没有的话去隔壁实验室借一点也是没问题的，所以问题的重心就是CDS 片段怎么来！！RNA大家都提取过吧，做QPCR之前要先从处理过的细胞中提取RNA，然后逆转录成CDNA。
想到了吧，我们的CDS片段就可以从这一堆CDNA里挑出来，我们用来构建质粒的CDNA与用来做QPCR的CDNA唯一的不同在于，我们逆转录用的酶不一样，在这里给大家推荐一款：全式金的AT321TransScriptTM II All-in-One First-Strand cDNASynthesis SuperMix for PCR用你手上有的细胞提取RNA，接着用此酶进行逆转录获得CDNA，之后就可以用这个CDNA作为模板来进行后面的实验了。
有时候可能在某个细胞株中你所需要的基因恰好是有突变的，这时候你可以换个细胞株试试，也可以尝试把突变的地方再突变回来。
接着我们以KLF4基因为例来构建质粒：1、首先在PUBMED中找到KLF4的CDS序列，在GENE中搜索KLF4，选择HOMO，点击进入2、进入下面这个页面之后，一直往下拉，3、拉到这个位置，选择自己需要的转录本，在这里我选择第一个，点击进入4、页面如下，往下拉，看见CDS，点击CDS可以使此基因的CDS序列显示为高亮文本，如图5、为了可以完整的把CDS序列P出来，所以我们的引物应该设计在高亮文本以外的区域，打开Primer-BLAST来设计引物6、将刚才查到的所有的序列复制粘贴入输入框中，输入引物的范围，产物的大小，最小为CDS的长度，最大为贴入这段序列的长度7、点击GET Primers8、挑选一对副产物少的引物就好了9、引物合成后，就可以以CDNA为模板P出你想要的片段了。
同源重组构建质粒原理及方法
同源重组构建质粒原理及方法一、引言同源重组构建质粒是基因工程领域的关键技术，它通过将外源基因片段与适当的质粒DNA相连接，实现外源基因的表达和遗传转移。
本文将详细介绍同源重组构建质粒的原理和方法，以及常用的实验步骤和注意事项。
二、原理同源重组构建质粒的原理是通过内切酶在两个同源DNA片段上切割，然后连接起来形成一个新的质粒DNA。
同源DNA片段通常由外源基因和质粒DNA提供，通过互补的粘性末端序列将它们连接起来。
三、方法以下是同源重组构建质粒常用的方法和步骤：1. 选择合适的质粒和酶切位点首先，需要选择一个适合的质粒，根据实验需要选择带有合适酶切位点的质粒。
同时，还需要选择适合的内切酶用于切割质粒和外源基因片段。
2. 切割质粒和外源基因片段将选择好的质粒和外源基因片段与相应的内切酶一起反应，将其切割为互补的粘性末端序列。
切割后的质粒和外源基因片段会留下粘性末端。
3. 进行连接反应将切割好的质粒和外源基因片段加入连接反应中，可以使用DNA连接酶来催化连接。
4. 转化宿主细胞将连接好的质粒转化到宿主细胞中，常用的方法有热擦法、电穿孔法和化学法等。
宿主细胞可以是大肠杆菌等常用的实验宿主细胞。
5. 筛选转化子将转化到宿主细胞中的质粒进行筛选，可以通过选择性培养基或进行基因标记（如荧光蛋白等）来筛选转化子。
四、注意事项在同源重组构建质粒过程中，需要注意以下事项：1. 同源重组效率同源重组的效率是影响质粒构建成功率的关键因素。
需要合理选择酶切位点，确保质粒和外源基因片段有足够的同源性。
2. DNA连接酶的选择DNA连接酶的选择也是非常重要的。
不同的DNA连接酶在连接效率和酶切位点的要求上有所区别，选择适合的连接酶能提高连接效率。
3. 转化宿主细胞选择转化宿主细胞的选择也会影响质粒构建的成功率。
不同的宿主细胞对质粒的转化效率和表达能力有所不同，需要根据实验要求选择合适的宿主细胞。
4. 合理设计实验对照组为确保实验结果的可靠性和准确性，需要设计适当的对照组，验证质粒构建的成功性和外源基因的表达情况。
两大方法帮你搞定质粒构建
两大方法帮你搞定质粒构建质粒构建是分子生物学研究中最常用的实验技术。
原理依赖于限制性核酸内切酶，dna连接酶和其他修饰酶的作用，分别对目的基因和载体dna进行适当切割和修饰后，将二者连接在一起，再导入宿主细胞，实现目的基因在宿主细胞内的正确表达。
一.t4dnaligase即t4dna连接酶，可以催化粘端或平端双链dna或rna的5’-p末端和3’-oh末端之间以磷酸二酯键结合，该催化反应需atp作为辅助因子。
1.质粒载体的制备既可以选择单酶切也可以选择双酶切，一般推荐使用双酶切。
其实目的就只有一个，尽量使载体的末端具有特异性，防止自连。
[附加酶乌体系]vector3ugcutsmartbuffer5ul限制性内乌酶11ul限制性内乌酶21ul酶切体系一般选择50ul，试剂加好之后37°c孵育6~8小时，或适度延长时间，确保质粒酶乌全然。
内要一段时间震荡一下并Vergt以免液滴冷却至管盖上。
酶乌后载体通过切胶废旧线性化载体。
2.根据目的序列构建引物后，引物设计原则简单总结一下:（1）前向引物：5’端-保护碱基序列+限制性内切酶1酶切位点序列+基因正向引物序列-3’端（2）逆向引物：5’端的-维护碱基序列+限制性内乌酶2酶切位点序列+基因逆向引物序列-3’端的如果目的基因片段较长的话，可以选择pcr方式扩增目的基因片段[附加pcr扩充体系]ddh2o：14ul10xtaqbuffer：2ul10umdntp：1ul10umprimerf：0.5ul10umprimerr：0.5ul模板dna：1ultaq酶：1ul[可选pcr扩增条件](1)95℃：5min(2)35cycle95℃：30s55℃：30s（退火温度可以根据目的引物tm值决定，一般退火温度根据引物tm值降低5度）72℃：40s(3)72℃：10min(4)16℃：hold引物扩充之后，首先必须展开琼脂糖凝胶电泳检验条带大小，然后通过胶废旧，赢得提纯目的片段产物.由于重新加入维护碱基，废旧产物须要展开双酶乌，双酶乌方法与质粒酶乌方法相同。
重组质粒的构建经验 [技巧]
![重组质粒的构建经验 [技巧]](https://img.taocdn.com/s3/m/f026746187c24028915fc3fa.png)
重组质粒的构建经验 [技巧]重组质粒的构建经验~~~昨天我在版中我看很多谷友询问重组质粒的构建问题，有些谷友说构建质粒需要一个月，甚至更长时间，这让我联想我刚做分子生物学时候的曲折。
重组质粒构建是常用的分子生物学手段，其实只是最基本的方法，一般一个星期同时构建三二个组质粒是没有问题的。
在国内先进的实验中，也大都是由实验员搞定。
但是其中还是有些基本的技巧需要掌握。
在这里将我的心得分享于大家，这也是我本人几年来一线工作时的经验积累，以期能为谷友提供借鉴，让大家在实验中少走弯路。
所涉及内容如下: 1) 克隆基因的酶切位点问题 2) 载体酶切的问题 3) 连接片段浓度比的问题在阐明上述问题同时，本人尽可能举些实验中的问题案例予以说明。
一、克隆基因的酶切位点问题 1、克隆位点选择的问题。
首先要对目标基因进行酶切位点扫描分析，列出其所含酶切位点清单。
然后对照质粒多克隆位点，所选择的克隆位点必须是目标基因所不含的酶切位点。
这是常识，不赘述。
2、保护碱基数目的问题。
在设计PCR引物时，引入酶切位点后，常常要加入保护碱基，这是大家所熟知的。
但是保护碱基数量多少，可能被新手所忽视。
这种忽视碰可能会大大影响后续的实验进展。
一般情况下，普通的内切酶只加入两个保护碱基，其内切反应就可以正常进行;而有一类，仅仅只加入两个保护碱基，其内切反应就不能正常进行，这是因为内切酶不能正常结合DNA片段上。
如NdeI就属这类，需要加入至少6个保护碱基，常用的HindIII也要三个。
下面是我提供这类酶的列表及其所需最少的保护碱基数，相信下列将有助于大这家的实验设计。
NcoI 4 NdeI 6 NheI 3 NotI 8 PmeI 6SacI 3 SalI 3 SmaI 3 HindIII 3 BstI 8 SphI 4XhoI 3 XbaI 3 SmaI 4 案例分析一:本人最初曾选用NdeI克隆位点，未注意到保护碱基数目的问题，设计PCR引物时，引入NdeI酶切位点后，只加上两个保护碱基，一个月内没有进展，始终不能成功构建重组载体。
质粒构建中 DNA片段与载体连接的经验
在排除了其他问题后，我做了摩尔比的调整，需要做OD260的测量。
不要怕浪费回收的载体和片段因为实际用量非常少，看了下面我们的实验实例就知道了。
摩尔比是指载体和插入片段，在连接时的摩尔比。
1 比例应该在1:2-6之间（载体：片段；片段要多）。
2 连接体系如果是20微升，载体和片段的总质量（微克）要在0.02微克~0.2微克之间。
如果是10微升，则在0.01~0.1微克之间。
我一般都用到接近上限。
3 EDTA不能太多。
否则可能影响连接酶。
附加：如何计算摩尔数和微克数（用20微升的链接体系，NEB的T4 DNA ligase）公式：pmol数*kb数（双链）*0.65=微克数实例：片段大小=555bp=0.555kb，浓度=0.19微克/微升载体大小=4.969kb，浓度=0.115微克/微升选取：载体0.04pmol；片段0.12pmol（载体：片段=1:3）代入公式：pmol数*kb数（双链）*0.65=微克数；载体用0.129微克（1.12微升）；片段用0.043微克（0.23微升）：：：注意20微升体系得出：载体和片段的总质量=0.043+0.129=0.172微克（在20微升体系所要求的0.02~0.2微克之间）连接体系：体积按需调整，我们喜欢用20ul的体系。
你如果要用10ul的，把上述用量减半。
20ul体系：3d水15.65 ul，片段0.23 ul，载体 1.12 ul，将上面三个液体混匀，45摄氏度水浴5min，迅速插入冰中，2min保持在冰浴中，加入10×buffer 2 ulT4 DNA ligase 1 ul混匀，4℃连接过夜另外一种推算结果设x1为DNA片段pmol数，x2为其ug数；设y1为载体pmol数，y2为载体ug数，a为DNA片段的kb数，b为载体的kb数，并且假定摩尔比为DNA片段：载体=3:1，则有x1·a·0.65=x2y1·b·0.65=y2x1：y1=3x2+y2=0.2（总质量）最后提示：不要怕测OD260浪费了回收的载体和片段，因为实际上用的很少（见上述）。
质粒载体的构建
四、连接 很多公司都有快速连接试剂盒和普通试剂盒。一般都是 16 度数个小时或者过夜，或者 4 度 过夜，不一而同。曾在园子里看到一个高人的文章，认为是时间越长越好，甚至建议 4 度放 几天，我没有试过。16 度可以用 PCR 仪创造，或者找一个泡沫盒，加上冰，水搞到 15 度 左右，放入 4 度冰箱即可。我用的 TAKARA 的快速连接试剂盒，4 度过夜。 菜鸟体贴提示： 1、 通过电泳，粗略判定质粒和 DNA 的浓度比例。一般加入连接液的 DNA:质粒＝9：1 2、 放入质粒和 DNA 的总量要适当，不可超过说明书，宁少不要多。
质粒载体的构建－菜鸟入门手册
dongkey 制作
本人刚刚完成质粒载体的构建，总结了一下，以方便要做这方面的菜鸟同学借鉴一下，希望 老鸟同学批评指教。 一、确定插入的基因片段。 首先要确定自己要插入载体中的基因片段，比如要做蛋白表达和功能，可以选择 CDS 区进 行插入。然后自然是如何得到这段基因片段的问题了。最常见的是 PCR 解决了。那么就涉 及到引物的设计。插入 CDS 基因片段的例子：找到 CDS，根据 CDS 设计全长引物，然后 加上内切酶的碱基片段（这要根据自己手头上有的质粒的内切酶位点来决定了），注意，前 面要加上保护碱基！然后进行 PCR。 PCR 后要跑电泳确定目的基因的长度是正确的。 用乙醇沉淀法纯化 PCR 产物（具体见分子克隆一书） 菜鸟体贴提示：要在质粒上找到两个最好不是连续在一起的内切酶，然后分别添加在两条引 物的 5‘端，当然内切酶的温度最好是一致的，而且可以能够同时切开的（双酶切）。这可 以在试剂公司的限制性内切酶的列表上找到有没有共同的 BUFFER 及其双酶切时的活性如 何（当然是越大越好了）。内切酶的公司一般可以找 NEB, TAKARA, TOYOBO 等公司，本 人用的是 TAKARA。 二、酶切 将质粒和基因片段分别进行酶切。最省事的是同时双酶切了。一般酶切温度都是 37 度。 菜鸟体贴提示： 1、 确定质粒和基因片段的量！！（宁少不多），根据说明书加样，一般是 DNA＋BUFFER＋
如何构建质粒？
如何构建质粒？一、引物设计1.选择合适的载体。
酶切位点及其顺序（酶切位点的顺序一定不能颠倒）。
2.在NCBI上再次确认目的片段的碱基序列。
①. 使用word排除目的片段里含有的酶切位点，最后确定所使用的酶。
②. 设计引物：primer-up：保护碱基4个,上游酶切位点,首位20个碱基;Primer-down：保护碱基4个,下游酶切位点,末尾20个碱基的反向互补碱基;③. 核对----送去合成。
④. 对合成的引物离心，10000rpm、5-10min、4℃，在超净台按照管子上标注的体积加入高压水（2dH2O），再把上游引物和下游引物混在一起，4℃保存。
二、 PCR（P出目的片段）（一）、从菌液里P出目的片段：1，揺菌过夜。
15ml离心管：2ul实验室菌液，Xul相应的抗生素，3ml LB2,pcr。
Pcr(50ul)反应体系：菌液1ul，2x PFU mix 25ul ，Primer 1ul；2d H2O 23ul。
Pcr温度体系：94℃ 30sec，94℃ 30sec 33cycles，58℃ 30sec 33cycles，72℃ X min；72℃ 5min。
（X是根据片段的长度设定，500-1000bp/min，退火温度根据Tm值来计算，一般低于Tm值2℃）3，跑胶、回收。
（1），配胶：1%的琼脂糖胶大块：称0.6g的琼脂糖，加入60ml的1X TAE，加入0.6ul的EB(待温度降到50-60℃左右时)煮沸3次；25分钟后，即可点样跑胶。
（2），跑胶：130-150V、25-30分钟左右。
（3），紫外灯下观察，切胶（要带防护手套和口罩）4，做胶回收（天根{TIANGEN}公司的DNA纯化回收试剂盒）:按照试剂盒的protocol来做，在胶回收的最后一步，Elution Buffer预先在55-65℃温箱中水浴，并且在加过EB后，放在37℃温箱中2min。
对胶回收的产物跑胶验证。
可建立10ul的体系：回收产物2ul、10xloading buffer 2ul、2d H2O 6ul。
质粒构建从入门到精通
质粒构建从入门到精通今天我们就来说说质粒构建——一名合格「快递员」的养成记。
质粒构建的原理外源 DNA 经 PCR 扩增后，用限制性内切酶分别切割载体和外源DNA 片段，DNA 连接酶将二者进行连接，然后转入宿主细菌，通过筛选鉴定获得重组克隆。
经过一系列的操作，「快递员」质粒就完成了呈递目标片段的工作。
质粒构建流程示意图质粒构建的步骤「快递」目标片段的过程主要有三个步骤：▼▼▼01PCR 扩增「快递」准备，首先要对目标片段进行扩增富集。
PCR 即聚合酶链式反应，它是一种用于扩增复制特定 DNA 片段的常用分子生物学技术。
PCR 的最大特点是能将微量的DNA 大幅扩增，在克隆前获得大量的目标基因片段。
PCR 扩增简要步骤：利用引物设计软件如 Primer 5 或 NCBI Primer-BLAST 在线设计引物并合成后，配制PCR 反应体系：将模板、引物、dNTP、酶、反应缓冲液和 ddH₂O 按比例加入，加好后轻微点离，放入 PCR 仪中扩增目的片段，扩增后通过琼脂糖凝胶检测目的片段大小是否正确。
Tips▼扩增过程中的关键点▼QPCR 扩增中随着拷贝数的增加经常会出现二聚体、非特异性条带（大小不对）的现象。
答案点击下方空白处获得答案A：通过降低模板和引物浓度、降低镁离子浓度、适当减少酶量，提高退火温度，可以提高扩增特异性。
此外引物设计的好坏是关键。
除了按照常规引物设计规则外，构建载体时通常会在引物序列上添加酶切位点和保护碱基。
常规引物设计原则1.引物长度：18-30bp，常用 20-22bp 左右。
2.引物 Tm 值最好在60℃ 左右，两条引物间 Tm 值要保持接近，最好不超过5°C。
3.GC 含量 40%-60%，45-55% 为佳。
4.引物自身不应有连续4 个及以上碱基的互补，避免形成发卡结构。
5.引物之间不应有连续4 个及以上碱基的互补，避免形成引物二聚体。
6.3' 端避免连续碱基的重复，如 GGG 或 CCC 会导致错配的发生。
质粒构建的原理及方法
质粒构建的原理及方法质粒构建的原理及方法是指通过研究DNA片段的特征，以及其在生物学实验中的复制、表达、合成和移植的原理及方法，来构建质粒。
质粒是一类由DNA片段组成的可重复使用的基因工程载体，用于转移和表达外源基因，广泛应用于基因工程和生物技术研究中。
质粒构建的原理主要是根据DNA片段的周期性结构形成的，即质粒的结构是由DNA片段组成的，而不是其他的物质。
在质粒构建中，首先要明确需要构建的质粒的目的和功能，然后根据此目的和功能，从DNA片段库中选择合适的片段，将其组装成质粒，以达到预期的效果。
质粒构建的方法有几种，常用的有PCR扩增法、等位子构筑法、同源克隆法和限制性内切酶构建法等。
1 PCR扩增法：PCR扩增法是一种用于构建质粒的有效方法，其原理是利用特定酶，如Taq DNA聚合酶，对DNA 片段进行反复扩增，从而获得大量的DNA片段。
该方法的优点是快速、灵敏，可以构建任意大小的质粒，但也有一定的缺点，例如扩增的精确性和准确性较差，可能会引入噪声，影响质粒的质量。
2 等位子构建法：等位子构建法是指在特定的位置插入预先准备好的DNA片段，即将DNA片段配对到等位子上，从而构建质粒。
该方法的优点是可以以高精度构建质粒，精度可达99.9%，但是缺点是时间较长，构建大型质粒时耗时较长。
3 同源克隆法：同源克隆法是指将DNA片段插入到一种特定的质粒中，从而形成新的质粒。
该方法的优点是可以用于构建任意大小的质粒，但缺点是构建的质粒的精确性较差，可能会引入噪声，影响质粒的质量。
4 限制性内切酶构建法：限制性内切酶构建法是指将DNA片段插入到限制性内切酶识别序列中，从而形成质粒。
该方法的优点是可以快速构建质粒，而且可以构建任意大小的质粒，但缺点是质粒的精确性较差，可能会引入噪声，影响质粒的质量。
以上就是质粒构建的原理及方法，质粒构建的方法也不断发展壮大，未来还有可能推出更多的质粒构建方法，以满足更多的应用需求。
质粒构建注意事项
质粒构建注意事项质粒构建是一种常用的分子生物学技术，用于将特定DNA序列插入质粒中，并通过转染等方法引入到目标细胞中。
质粒构建需要注意许多方面的因素，以确保构建的成功和高效性。
以下是质粒构建的一些主要注意事项。
1. 选择适当的质粒载体：选择适合实验需求的质粒载体非常重要。
质粒载体应该具有合适的大小、来源和特定的有效启动子、选择性标记物等，以满足实验要求。
2. 选择正确的限制酶：限制酶用于切割DNA序列，提供黏性末端，从而实现目标DNA序列的插入。
选择适当的限制酶是质粒构建的关键步骤。
要考虑限制酶切位点的数目和位置，确保目标序列的正确插入。
3. 合成或提取目标DNA序列：目标DNA序列可以通过化学或生物合成的方法获得，也可以从已知来源中提取。
合成DNA序列时需要根据质粒载体的长度和需求进行优化，并考虑到靶标DNA序列的引物设计、序列纯化等方面的因素。
4. 选择合适的连接方式：插入DNA序列和质粒载体的连接方式有多种，如内切酶消化连接、PCR扩增连接等。
选择合适的连接方式可以减少不必要的连接失败和背景。
5. 考虑相关启动子和报告基因：在质粒构建中，为了确保插入DNA序列可以正常表达，可以选择适当的启动子来驱动目标基因的转录。
同时，可以在质粒中添加报告基因，以便在转染后检测转染效率和表达情况。
6. 使用无菌技术：在质粒构建过程中，应注意使用无菌技术，以防止外源DNA 的污染。
所有操作应在洁净实验室中进行，并使用消毒剂处理实验器具，避免细菌和真菌的感染。
7. 分子鉴定和纯化：完成质粒构建后，通过酶切鉴定、PCR扩增、测序等方法进行质粒鉴定，确认是否成功插入目标DNA序列。
同时，可以通过DNA凝胶电泳和质粒提取等方法纯化目标质粒。
8. 选择合适的细胞染色体导入方式：质粒构建完成后，需要将其导入到目标细胞中。
可以选择不同的方法，如热冲击法、电穿孔法、化学转染法等。
根据实验目的选择合适的方法，并进行优化，以提高质粒转染效率。
质粒构建之从入门到精通
TRIzol法抽提RNA提取RNA比较成熟的方法便是TRIzol法抽提，Invitrogen的TRIzol 是比较稳定且广泛应用的，当然现在一些国产的TRIzol类产品也能满足大部分情况下的RNA抽提。
ABOUT TRIzol注意事项及原理注意事项：1、RNA酶（RNase）非常稳定，是导致RNA降解最主要的物质。
它在一些极端的条件可以暂时失活，但限制因素去除后又会迅速复性。
用常规的高温高压蒸汽灭菌法和蛋白抑制剂都不能使RNase完全失活。
它广泛存在于人的皮肤上，因此，在与RNA制备有关的分子生物学实验时，必须戴手套。
RNase的又一污染源是取液器，一般情况下采用用DEPC配制的70%乙醇擦洗取液器的内部和外部。
提取RNA时使用专门的RNase-free的枪头和离心管。
2、TRIzol试剂具有较强毒性，如沾到皮肤立刻用大量的清洁剂和水冲洗！溶液配方及原理：1、TRIzol试剂：TRIzol能在破碎细胞、溶解细胞内含物的同时保持RNA的完整。
其主要成分是苯酚和异硫氰酸胍。
苯酚的主要作用是裂解细胞，使细胞中的蛋白、核酸物质解聚得到释放。
异硫氰酸胍，是一种强力的蛋白质变性剂，可溶解蛋白质并使蛋白质二级结构消失，导致细胞结构降解，核蛋白迅速与核酸分离。
2、氯仿：氯仿可增强TRIzol中的8-羟基喹啉对RNase的抑制作用。
另外氯仿作为有机溶剂，加入氯仿后离心可使溶液分层，上层为水相，下层为有机相。
苯酚为弱酸性，酸性条件下（一般为Ph5.0）DNA和蛋白质进入有机相，而RNA留在水相；反之亦然，弱碱性（Ph8.0）时DNA留在水相。
3、异丙醇、无水乙醇、70%乙醇：异丙醇和乙醇能与水任意比例互溶，因此加入异丙醇能够夺取RNA周围的水分，使其脱水沉淀。
4、DEPC水：DEPC是RNase的化学修饰剂，它与RNase的活性基团组氨酸的咪唑环反应而抑制其活性。
DEPC有毒性，操作时应小心。
谁说是最优秀的；谁是最自由的，谁也就是最优秀的，在他们身上，才会有最大的美。
同源重组构建质粒步骤
同源重组构建质粒步骤
同源重组构建质粒是一种常用的基因工程技术，用于将外源基因插入到质粒中。
以下是同源重组构建质粒的一般步骤：
1. 选择合适的质粒载体：根据实验需要选择适当的质粒载体，通常选择含有适当多个限制酶切位点的质粒。
2. 执行酶切反应：将选定的质粒载体进行限制酶切反应，使用限制酶切酶将质粒切割为线性片段。
3. 扩增外源基因：使用PCR等技术扩增所需的外源基因片段，同时设计引物使得其两端带有与质粒载体的酶切位点相同的序列。
4. 接头连接：将扩增的外源基因片段与酶切后的质粒片段进行连接，使用连接酶将二者进行连接。
连接酶可以是T4 DNA连接酶等。
5. 转化宿主细胞：将连接后的质粒导入到合适的宿主细胞中，常用的宿主细胞包括大肠杆菌等。
6. 选取转化子：利用筛选法选择成功转化质粒的宿主细胞，可以使用抗生素等抗性筛选方法。
7. 确认质粒插入：通过PCR、酶切等方法对转化细胞进行筛
选和验证，确认质粒中外源基因的插入情况。
8. 提取质粒：从筛选验证通过的细胞中提取质粒，通常使用质粒提取试剂盒等方法进行质粒提取。
9. 验证质粒：通过测序等方法验证质粒中外源基因的序列，确认构建成功。
以上步骤仅为一般的同源重组构建质粒步骤，具体实验操作可能因实验设计和需求的不同而有所差异。
质粒构建经验收集
质粒构建经验收集2011-03-03 14:04:31| 分类：生物技术| 标签：学习|字号大（1）构建的质粒克隆载体应该是能在转化的受体细胞中进行有效的复制，并且作为质粒克隆载体，希望在受体细胞中有较多的拷贝数。
为此，构建的质粒克隆载体必须含有能在受体细胞内有效复制的质粒复制起始位点（ori），最好是松弛型质粒的复制起始位点。
（2）构建的质粒克隆载体必须含有允许外源DNA片段克隆的位点，并且这样的克隆位点应尽可能多。
作为克隆位点的限制性核酸内切酶的识别序列一般在质粒克隆载体上只有一个。
为了便于多种类型末端的DNA片段的克隆，克隆载体往往组装一个含多种限制性核酸内切酶识别序列的多克隆位点（MCS）连杆。
（3）构建的质粒克隆载体必须含有供选择克隆子的标记基因。
一个质粒克隆载体最好有两种选择标记基因，并且在选择标记基因区内有合适的克隆位点。
当外源DNA片段插入克隆位点后，标记基因失活，成为选择克隆子的依据。
常用的选择标记基因，主要有根据克隆子抗药性提高进行筛选的Apr或Ampr 、Cmr或Cmpr 、Kmr或Karnr 、Smr 或Strr、Tcr 或Tetr等抗性基因；有根据克隆子蓝白颜色进行筛选的lacZ'基因。
（4）构建的质粒克隆载体DNA分子应尽可能的小。
由于质粒转化受体细胞的效率同质粒DNA分子大小相关，小分子质粒的转化效率高，大于15kb的质粒转化效率明显下降。
质粒克隆载体DNA分子小，意味着可承载较大的外源DNA片段。
（5）根据特殊需要，使构建的质粒克隆载体中组装各种“元件”（小DNA片段），构建成不同用途的质粒克隆载体。
如在克隆位点上游组装强的启动子，下游组装相应的终止子，成为强表达质粒克隆载体；或者在质粒克隆载体的合适位置组入受体细胞染色体DNA的同源序列，成为基因整合平台系统的供体质粒克隆载体。
重组质粒构建是常用的分子生物学手段，其实只是最基本的方法，一般一个星期同时构建三二个重组质粒是没有问题的。
如何构建质粒克隆
如何构建质粒克隆质粒克隆是一种常用的生物学实验技术，它可以用来将外源DNA片段插入到质粒DNA中，实现基因的克隆和表达。
下面将详细介绍如何构建质粒克隆。
1.选择目标质粒：根据实验需要和应用场景，选择合适的质粒。
质粒通常是环状的双链DNA，在细菌细胞中能够稳定复制和传递。
2.准备目标DNA片段：目标DNA片段通常来自于已知序列的基因、片段或合成的DNA。
目标DNA片段可以通过PCR扩增、酶切、合成等方法得到。
如果需要避免气相副本数效应或者需要稳定的表达，可以选择线性载体。
3.酶切和连接：选取适当的限制性内切酶切剪目标质粒和目标DNA片段，以生成具有互补单链末端的DNA片段。
然后，使用DNA连接酶将目标DNA片段与质粒连接起来，形成重组质粒。
4.转化和筛选：将重组质粒转化到宿主细胞中，通常是大肠杆菌等。
转化可以通过热激冷冻、电穿孔等方法实现。
随后，将细菌培养在含有抗生素的培养基上，以筛选出含有目标质粒的细菌克隆。
5.确认质粒：通过提取细菌中的质粒DNA进行限制性内切酶切割、测序等方法，确保质粒的正确性和目标片段的插入位点。
6.大规模扩增：从确认为正的细菌克隆中提取质粒DNA，进行液体培养或者固体培养，扩增出大量的目标质粒。
7. 应用和分析：扩增获得的净质粒可用于诸如基因表达、蛋白表达、分子克隆、DNA测序等多种应用。
此外，还可以通过Western blotting、Southern blotting、原位杂交等技术对质粒进行进一步的分析和验证。
在实际操作中，还有一些注意事项可以避免错误和提高效率：1.酶切和连接条件的优化：在酶切操作中，要选择适当的限制性内切酶，并确定最佳的酶切条件。
在连接操作中，要检查连接酶的活性和最佳的连接温度和时间。
2.质粒选择和提取：为了避免质粒丢失或不稳定的情况，可以选择高拷贝数的质粒，或者使用专门的质粒提取试剂盒来提取质粒DNA。
3.合理设计引物：在PCR扩增目标DNA片段时，要合理设计引物，充分考虑引物的特异性和特征序列，以避免非特异扩增或产生假阳性结果。
同源重组构建质粒原理及方法
同源重组构建质粒原理及方法
同源重组构建质粒是一种常见的分子生物学技术，旨在构建具有特定序列或基因的质粒，以用于基因克隆、基因表达和蛋白质表达等领域。
这种技术利用了同源重组在细胞中的自然发生机制，而不需要DNA 修饰或特殊的酶切酶或连接酶。
同源重组构建质粒的基本原理是将目的 DNA 片段与载体 DNA 片段
的两端引入相同的特定序列，然后将两者共同转化至宿主细胞中，利用同源重组的机制完成质粒的重组。
在重组过程中，同源序列的两端会通过基因重组的方式将目的 DNA 片段与载体 DNA 片段连接起来，形成具有目的基因或 DNA 片段的质粒。
由于同源重组构建质粒不涉及酶切酶或连接酶的使用，因此成本低廉，操作简便，因此被广泛应用于生物学、医学和农业等领域。
同源重组构建质粒的方法主要有两种：一种是利用 PCR 技术扩增目的 DNA 片段和载体 DNA 片段的两端同源序列，将两者共同转化至宿主细胞中，完成质粒的构建。
另一种是将目的 DNA 片段和载体 DNA 片段的两端同源序列合成，并利用 DNA 合成技术将其连接在一起，然后将构建好的质粒转化至宿主细胞中，完成重组。
需要注意的是，同源重组构建质粒的成功率受到多种因素影响，包括同源序列的长度、同源序列与非同源序列之间的比例、转化效率、质
粒长度等。
因此，在进行同源重组构建质粒之前，需要对实验条件进行优化和控制，以提高质粒构建的成功率。
总之，同源重组构建质粒是一种简便、低成本、高效的基因克隆技术，被广泛应用于生物学、医学和农业等领域。
随着分子生物学技术的不断发展，同源重组构建质粒的应用前景将更加广阔。
干货分享~如何让你构质粒拥有火箭般的速度！
干货分享~如何让你构质粒拥有火箭般的速度！小伙伴们，你们有没有深受够质粒的困扰？有没有满怀期待，却看到平板上空空如也？有没有做了无数的酶切鉴定，却总也找不到自己想要的结果？要想真正的拥有火箭般的质粒构建的速度，不要让自行车如何更新，而是让自己坐在火箭上！今天小程给大家讲解快速多片段构建方法!快速拼接多个DNA片段在合成生物学中扮演重要的角色，对于构建微生物工厂生产药物，生物燃料等起到至关重要的作用。
目前有多种方法可以被用来构建多片段连接，包括overlap PCR，nicking酶方法，Golden gate方法，Gibson assembly等，in vivo的DNA拼接方法也非常有用。
然而开发序列不依赖的快速便宜方法，也非常急需。
受到LCR等方法的启发同时基于DNA polymerase的exonuclease 活性，来自中国的科学家们，开发了全新的序列不依赖型的DNA拼接方法。
“DATEL”科学家们，使用Taq酶的5’-3’ 外切酶活性，和pfu的3‘-5‘外切酶活性以及Taq连接酶。
细节上，所有5‘ 磷酸化的DNA片段，首先设计上各个片段间要求一定的overlap。
经过变性和重新anneal后，两边的片段，以两种类型的overhang进行重叠。
之所以需要5‘ 磷酸化，是因为在第一种类型中，pfu产生的3’ OH 需要和下游的进行连接。
经过多重的退火 anneal循环，所有的片段都会最终连接起来。
为了探究不同的参数，科学家们使用GFP基因作为demo。
科学家们观察到不同的chew时间对于不同长度有着不同的优化条件：可以看到30bp的overlap长度，35min的延伸时间最为合适。
然后科学家们，将方法应用于多片段的拼装上，可以看到对于传统使用的Gibson拼接方法，Gibson在大于4个片段后，效率显著下降，但是对于多到10个片段，DATEL的效率仍然非常高。
质粒构建：从入门到精通之初窥门径
质粒构建：从入门到精通之初窥门径来源：科研小助手公众号编者按很多人的科研生涯中都会绕不开质粒构建这个坎，那么质粒如何而来呢？前人遗留？实验室没人做过这个基因怎么办？公司购买？周期长、成本高还不一定靠谱怎么破？找相关文章作者索取？耗时费力却不一定得到回音如何是好？正所谓自己动手丰衣足食！所以还是自己构建吧！啥？不会！没关系，本文正合适啥都不会的实验小白！嗯？我已经会了！没关系，相信你读完本文之后也会受益良多的！（Note：因本系列文章主要面向实验小白，所以写的非常详细，已经掌握所述技能的可以略过）好了，小编就不在废话了，让我们简单粗暴的直接进入主题吧！读完本文您将获得以下技能0. 学会获取目的基因的CDS序列；1. 学会设计引物；2. 掌握Primer Premier 5的使用方法；3. 懂得如何选择以及在引物上添加酶切位点；4. 获取cDNA的多种渠道；5. 初步掌握质粒构建的技能；6. 获得快速构建质粒的高逼格技能引物设计通常我们要通过PCR获取目的基因片段，所以质粒构建第一步就是设计引物。
首先大体了解一下引物设计的一些通用原则：1. 引物长度一般在15~30 bp，最常用的是18~27bp；2. 引物GC含量在40%~60%之间，Tm值最好在72℃左右。
Tm 值简单粗暴的计算方法为Tm=4×(G+C)+2×(A+T)，或在此基础上减5℃；3. 引物3’端不能选择A，最好选择T，G/C的错配率介于A/T之间；4. 以上为最主要的原则，另外还要注意引物的特异性、引物内部不能形成二级结构等原则，具体可以百度之；当然以上原则并不一定非要完全符合，但是作为一个新手而言初期最好是严格遵守为妙。
下面就以构建人源PD1(PDCD1)为例为大家讲解。
CDS的获取要设计引物自然要知道这个基因的CDS序列了。
获取一个基因CDS序列的方法如下：打开NCBI（），如下图，按照顺序，在1处选择Nucleotide，在2处输入“PDCD1”，点击3处的Search，等出来结果之后点击4处的“Homo Sapiens”进行进一步筛选（如果你要做鼠源的就选Mus musculus，其他种属选择相应的名称即可进一步筛选了）然后第一条就是我们需要的序列信息，点击进去，往下拉，直到看到CDS（如下图）点击CDS，就出现了下图中所示内容，其中加了底色的部分序列便是我们需要的序列了，可以看到这段序列开头是ATG起始密码子，最后三位是TGA终止密码子。
蛋白质序列构建质粒的方法
蛋白质序列构建质粒的方法蛋白质序列构建质粒是一种重要的分子生物学技术，在生物工程和基因工程领域得到广泛应用。
下面我将详细介绍蛋白质序列构建质粒的方法。
质粒是一种环状双链DNA分子，常见于细菌中，并且具有自主复制能力。
质粒构建是将感兴趣的蛋白质的编码序列插入到质粒DNA中的过程。
这样构建出的质粒可以被细菌或其他真核生物细胞摄取并进行表达，使得该蛋白质在细胞中大量产生。
蛋白质序列构建质粒的方法主要包括以下几个步骤：1. 选择合适的质粒载体：质粒载体是质粒构建的基础。
根据具体需求，可以选择适合的宿主细胞和质粒类型。
常用的质粒载体有pUC、pET等。
2. 扩增目标蛋白质基因：使用PCR或其他扩增方法，将目标蛋白质基因从其来源中扩增出来。
PCR反应需要设计适当的引物，其中一个引物需包含与目标质粒载体相对应的序列。
3. 限制性内切酶切割：购买适当的限制性内切酶，根据目标蛋白质基因和质粒载体的序列设计合适的酶切位点。
将扩增的目标基因和质粒载体经过双酶切，形成互补的粘性末端。
4. 连接反应：将切割后的目标蛋白质基因和质粒载体进行连接反应。
在此步骤中，需要使用DNA连接酶将两者进行连接，并生成一个新的DNA分子。
5. 转化：将连接后的质粒DNA转移到适当的宿主细胞中。
其中，常用的宿主细胞包括大肠杆菌（E. coli）等。
转化方法有化学转化、电转化等。
6. 识别和筛选：将转化后的细菌进行培养和筛选。
在培养基中加入适当的抗生素，只有带有质粒的细菌能够在该培养基中生存，通过抗生素的筛选，可以筛选出带有目标质粒的细菌。
7. 验证和纯化：对得到的带有目标质粒的细菌进行验证和纯化。
验证可以通过PCR或测序等方法进行。
纯化则可以使用柱层析等技术进行。
总之，蛋白质序列构建质粒是一项复杂而重要的分子生物学技术。
通过适当的实验设计和操作，可以高效地构建出带有目标蛋白质编码序列的质粒，为进一步的蛋白质表达和功能研究打下基础。
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重组质粒构建是常用的分子生物学手段，其实只是最基本的方法，一般一个星期同时构建三二个组质粒是没有问题的。
在国内先进的实验中，也大都是由实验员搞定。
所以其中其中还是有基本的技巧需要掌握。
在这里决定将我的心得分享于大家，以期能提供借鉴，让大家在实验中少走弯路。
在本帖及之后继帖中将以一段PCR获得基因，以NdeI和HindIII位点克隆进入质粒为例来系统剖析重组质粒的构建中基本策略与技巧。
这作的经验积累与心得。
所涉及内容如下：
1) 克隆基因的酶切位点问题
2) 载体酶切的问题
3) 连接片段浓度比的问题
以上阐明上述问题同时，本人尽可能引入实验时会各种出现的问题予以说明。
一、克隆基因的酶切位点问题
1 对目标基因进行酶切位点扫描分析，列出其所含酶切位点清单。
对照质粒多克隆位点，所选择的克隆位点必须是目标基因所不含的酶切位点。
这是常识不赘述。
这里对NdeI和HindIII 为例。
2 设计PCR引物时的保护碱基数目。
这可能是初涉入未引起注意与重视问题。
NdeI需加入6个以上的保护碱基，而HindIII则要三个就可以。
一般情况下，普通的内切酶只加入两个保护碱基，其内切反应就可以正常进行；而有一类，只加入两个保护碱基，其内切反应就不能正常进行，这是因为内切酶不能正常结合DNA 片段上。
如NdeI就属这类。
下面是我提供这类酶的列表及其所需最少的保护碱基数：
NcoI 4
NdeI 6
NheI 3
NotI 8
PmeI 6
SacI 3
SalI 3
SmaI 3
HindIII 3
BstI 8
SphI 4
XhoI 3
XbaI 3
SmaI 4
案例分析：本人最初用NdeI酶，未注意到该问题，只与普通酶一样引入两个保护碱基，一个月内没有进展。
后查文献得知症结所在，加下六个后，迎刃而解。
大家引以为戒啊。
现在普通酶我都引入三个保护碱基，现在合成价格不贵，为保证酶切充分，连接顺利，不用节约那点钱，再说若一次不成功，重要实验花费时间与金钱更多，孰利孰弊，不言自明。
呵呵。
二、载体酶切的问题
1单切鉴定。
这个问题实是简单，但我认为很有着重强调之必要。
现在大家手头的质粒都是转来转去的，其中的各酶切位点状况如何，是否能被有效地切开，在实验开始之前对质粒载体很有作单切鉴定之必要。
现在我每次构建之前，对所要用的酶切位点都作一一鉴定，比如要用到NdeI和HindIII，我就先对质粒该两个酶进行鉴定。
有效地切开后，再将引物发出合成；若不能，就按“一”中原则进行调换。
2 质粒双切后对照连接。
实验中这是连接步骤，但实质还是质粒酶切问题。
一般情况下，都在通用缓冲液中进行双酶切，但两种酶在通用缓冲液中中酶切效率不一样，可能导致部分只是单切缺口的质粒片段存在，这样，连接的对照实验在不加入外源片段时，质粒就会自连，长出菌斑，这种情况下，质粒酶切片段是不可能用于下一步真正连接实验。
案例分析：本人曾用XhoI和HindIII酶切位点构建重组质粒，对质粒进行双酶切后，直接就做连接，未上述两步鉴定，每次结果满板的菌斑。
但就是没有阳性。
后来对质粒进行单酶要鉴定后，发现XhoI酶切位点损坏。
又是一个月没有进展，浪费精力和药品。
血的教训啊。
因为当时没有注意到：单切质粒是一条带，双切质粒也是一条带，电泳行为上是一样的，分辨不出。
如果做上述任何一个鉴定就会知道问题出在那儿，呵呵。
案例分析：本实验室一个号称实验严谨的大博士，有KpnI和HindIII构建重组质粒，一个月未果，只得阴性斑，不得阳性斑，后怀疑KpnI酶失效。
迁怒KpnI,在我不知情下扔掉实验室所满管KpnI酶。
我得知后，问他做过上述两鉴定实验后，他支吾着说没有，反而责备本人不早说出问题原因所在。
呵呵，他不自责自己只是闷头做实验，不早问，反倒咬一口解铃人。
呵呵，你说冤不冤？版主你的类似的冤可能更多吧，辛苦了!
两星期前写了前两问题后，终于能抽时间写第三个问题，在做好前述两个方面工作后，这个问题相对简单。
三、连接时两片段浓度比问题
一般实验指导手册上都说质粒：片段＝1：3（摩尔比），在实际操作中我以为在1：5甚至1：10为宜。
做好“一、二”，16℃10小时后，每次都能有效地连接上。
当然还有感觉态问题，我们以前自己做，现在懒得做了，都用“天为时代公司”的产品，还不错（注明我不是天为公司内线，呵呵）。
这里介绍一个估测处DNA浓度的方法：DNA可以用紫外法检测，也可以电泳对比marker 估测，在要求不是很精确情况下，大家不妨试试下面方法：
1．取一平皿。
2．薄薄倒一层含有EB的琼脂糖胶，凝固(4 ℃可以存一个星期)。
3．平皿背面可以画成小方格。
4．一小格中点1 ul样品。
5．另一小格格点1 ul DNA标准品(我一般用Takara 2000 DNA lander，1 ul相当60 ng) 6．凉干后，紫外灯下根据亮度就可以估测了。
OK，我连接时这么估测浓度，5分钟就要可以知道两片段浓度。
其实连接片段浓度比可以充许在一个范围内，1：5至1：10都可以，所以上述估测方法在这种情况下是行得能的。