质粒构建
构建质粒原则
质粒构建原则
质粒构建是一个多步骤的过程，涉及选择适当的质粒骨架、插入基因、筛选和表征重组质粒。
遵循以下原则可提高构建质粒的效率和成功率：
选择适当的质粒骨架：
•根据克隆目的选择具有适当复制起源、选择标记和克隆位点的质粒骨架。
•考虑目的基因的大小和表达需要。
•选择具有低复制数和稳定复制特性的大肠杆菌质粒骨架，以减少重组事件。
插入基因：
•使用适当的限制性内切酶和连接酶将目的基因插入克隆位点。
•确保限制性内切酶位点与插入片段兼容，并且不会破坏质粒骨架中重要的功能。
•使用连接缓冲液进行连接，并确保连接酶和片段浓度合适。
筛选重组质粒：
•使用抗生素或其他选择标记对重组质粒进行筛选。
•将转化的细菌接种到含有选择标记的培养基中，并选择在该培养基上生长的菌落。
表征重组质粒：
•对筛选出的菌落进行质粒提取，并使用限制性内切酶消化或测序来验证插入物的正确性。
•测序还可以检测插入位点附近是否有突变或其他错误。
其他注意事项：
•使用高质量的试剂和酶。
•保持无菌条件，以防止污染。
•优化反应条件，包括温度、时间和酶浓度。
•仔细遵循实验方案并记录所有步骤。
•考虑使用克隆试剂盒，这些试剂盒提供预先优化和标准化的反应条件。
•获得有经验的研究人员或专家的帮助。
酵母菌表面展示操作步骤之质粒构建和转化
酵母菌表面展示操作步骤之质粒构建和转化质粒构建和转化是进行酵母菌表面展示的重要步骤之一。
在这一过程中，我们需要合成包含目标基因序列的质粒，并将其转化到酵母菌细胞中。
下面是酵母菌表面展示操作步骤之质粒构建和转化的详细描述。
1. 质粒构建质粒是一种带有自主复制序列的DNA分子。
在酵母菌表面展示中，我们需要构建一种质粒，其中包含用于表达和展示目标蛋白的基因序列。
a. 选择适合的质粒载体：选择合适的质粒载体，例如pYD1或pPICZα，这些载体在酵母菌表面展示中被广泛使用。
b. 插入目标基因：根据目标基因的序列设计引物，通过PCR扩增目标基因，并在引物的末端添加限制酶切序列，以便后续的质粒构建。
c. 酶切和连接：将PCR扩增产物与质粒载体进行酶切，并使用连接酶将两者连接起来。
此步骤需要选择合适的限制酶，并优化酶切和连接的条件。
d. 转化大肠杆菌：将连接好的质粒转化到大肠杆菌中，并通过培养和筛选获得含有目标质粒的克隆。
2. 酵母菌质粒转化在完成质粒构建之后，我们需要将质粒转化到酵母菌细胞中。
转化是指将质粒导入到细胞内，并使其在细胞内复制和表达。
a. 制备质粒：从大肠杆菌培养物中提取包含目标质粒的质粒DNA。
使用质粒提取试剂盒按照厂家说明书进行质粒提取。
b. 酵母菌预处理：用含有酵母菌培养基预处理酵母菌细胞。
这一步骤可以增加酵母菌细胞对质粒的转化效率。
c. 质粒转化：将预处理后的酵母菌细胞与质粒DNA一起孵育。
孵育温度和时间依据具体的实验要求进行设置。
质粒转化的方法包括热激冷冻法、锂乙酸法等，选择合适的方法进行转化。
d. 筛选阳性克隆：将经过转化的酵母菌细胞转移到含有适当选择压力的培养基中，并在培养基上筛选出带有目标质粒的阳性克隆。
这些步骤是进行酵母菌表面展示的质粒构建和转化的基本操作流程。
在每个步骤中，实验者需要采取严谨的操作、选择合适的试剂和工具，并根据实验要求进行优化。
通过这一步骤，可以成功构建和导入目标质粒，为后续的酵母菌表面展示实验奠定基础。
质粒构建 (2)
质粒构建1. 引言质粒是一种重要的实验工具，广泛应用于基因工程、遗传学和生物学研究中。
质粒构建是指将感兴趣的DNA片段插入到质粒中的过程，用于进一步研究DNA序列的功能和相互作用。
本文将介绍质粒构建的基本原理和步骤。
2. 质粒构建的基本原理质粒构建需要以下几个基本要素：•质粒：质粒是一种环状的DNA分子，可存在于细菌、酵母等生物体内。
•DNA片段：DNA片段是质粒构建中要插入质粒的感兴趣DNA序列，可以通过PCR扩增、基因合成等方法得到。
•限制酶：限制酶是一种特殊的酶，能够识别和切割DNA的特定序列。
•连接酶：连接酶是一种酶，能够将DNA片段与质粒连接起来。
基于以上要素，质粒构建的基本原理如下：1.将质粒和目标DNA片段分别进行限制性内切酶切割。
限制酶切割会产生粘性末端或平滑末端的DNA片段。
2.使用连接酶将目标DNA片段与质粒连接起来。
连接酶能够将两条DNA片段的末端连接起来，形成一个完整的质粒。
3.利用转化或转染等方法将质粒导入到宿主细胞中。
质粒在宿主细胞中进行复制和表达。
3. 质粒构建的步骤质粒构建的具体步骤如下：3.1 质粒提取从质粒宿主细胞中提取质粒是质粒构建的第一步。
常用的质粒提取方法包括碱裂解法、盐溶解法、商业提取试剂盒等。
质粒提取的目的是获取纯度较高的质粒样本，便于后续实验操作。
3.2 目标DNA片段的获取目标DNA片段可以通过PCR扩增、基因合成等方法得到。
PCR扩增需要设计引物，引物的序列与目标DNA片段的两端相互衔接。
基因合成则需要将目标DNA序列依照设定的序列进行化学合成。
3.3 DNA片段与质粒的连接将目标DNA片段与质粒进行连接，需要使用连接酶。
连接酶则需要根据DNA片段和质粒的不同情况选择合适的连接酶和反应条件。
连接酶反应通常包括连接酶、DNA片段和质粒的混合体系，以及一定的温度和时间。
3.4 转化或转染将连接好的质粒导入到宿主细胞中，以使质粒在宿主细胞中进行复制和表达。
质粒构建课件
Digestion & ligation
PCR product or vector Enzyme 1 Enzyme 2 10XBuffer 100XBSA(?) ddH2O
37°C 2~3 h
PCR product Vector T4 DNA ligase 10Xligase buffer ddH2O
pCS2(GFP)
……
/vectordb/
Gene cloning
Target gene: hBex2 Vector selection Primer design Amplification, digestion & ligation Transformation & Identification
AAT TCG AAG
CGG TG
EcoR I/BamHI digestion
BamH I GAT CCA CCG
GFP
G AAT TCG AAG
insert
CTT CG A ATT C
GCG GAT CCA CCG
CGG TGG ATC CGC
GFP
Gene cloning
Target gene: hBex2 Vector selection Primer design Amplification, digestion & ligation Transformation & Identification
质粒构建
孟庆明 2019-04-09
1
1
主要内容
质粒的概念及特点 质粒构建的基本步骤和原理
一、质粒的概念
载体（vector;carrier;vehicle） 可以插入核酸片段、能携带外源核酸进入宿主细胞，并在其中进行 独立和稳定的自我复制的核酸分子。基因工程中广泛应用的载体多 来自人工改造的细菌质粒、噬菌体或病毒核酸等。多数载体是DNA 分子，但某些RNA分子也能用做载体。
质粒的构建原理
质粒的构建原理质粒是一种环状的DNA分子，常用于基因工程和基因转移研究中，具有无菌发酵的能力。
质粒构建是将外源基因插入质粒中，形成重组质粒，然后通过转化等方法将重组质粒导入目标细胞中，实现外源基因的表达。
质粒构建主要包括质粒选择、外源基因克隆、质粒复制源的选择和质粒验证等步骤。
首先，质粒选择是质粒构建的第一步。
常用的质粒有pUC、pBR322、pET等。
质粒的选择主要考虑质粒的大小、拷贝数和复制源。
较小的质粒易于操作，而高拷贝质粒有更高的表达效率；复制源是质粒复制和稳定维持的关键元件，常用的复制源有p15A、pMB1和ColE1等。
其次，外源基因克隆是质粒构建的核心步骤。
一般来说，先从源细胞中提取目标基因的DNA序列，然后使用PCR扩增或酶切方法将目标基因插入质粒的多克隆位点（多克隆位点是质粒上的一段特定区域，用于插入外源基因）。
在PCR扩增中，引物可以根据目标基因序列设计，将目标基因扩增出来；在酶切中，则需要使用一对限制酶切酶切剪目标基因和质粒，生成具有互补末端的片段，然后通过连接将目标基因与质粒连接起来，形成重组质粒。
质粒复制源的选择是质粒构建的重要一环。
质粒复制源是指负责质粒复制的DNA序列，可以使质粒在宿主细胞中进行自主复制。
不同的宿主细胞可能对不同的质粒复制源有不同的适应性。
此外，质粒复制源还涉及到质粒的拷贝数和稳定性。
通常来说，高拷贝质粒（如pUC）能够在细胞中形成较高的拷贝数，适合对外源基因进行高效表达；而低拷贝质粒（如p15A）则适合用于负载大片段DNA。
最后，质粒构建的最后一步是质粒验证。
质粒验证是为了确认重组质粒是否成功构建。
一种常见的验证方法是限制性酶切分析，通过对重组质粒进行限制酶切检测，可以观察到目标基因的大小变化，从而判断是否成功插入外源基因；另一种验证方法是测序分析，通过将重组质粒进行测序，可以得到目标基因的序列信息，验证插入的正确性。
总而言之，质粒构建的原理是将外源基因插入质粒中，通过质粒选择、外源基因克隆、质粒复制源的选择和质粒验证等步骤，构建出重组质粒。
质粒的构建
① 复制起点 ori pMB1系列（来源于ColE1）的 高拷贝型复制起点
② Ampr基因 pSF2124质粒的Ampr基因
③ Tetr基因 pSC101的Tetr 基因。
第6页，共29页。
（2）长度 4363bp
（3）选择标记
氨苄青霉素和四环素抗性。
（4）克隆位点
24个克隆位点。
其中9个会导致Tetr基因失活（如 BamH I、Hind Ⅲ、Sal I）； 3个会导致Ampr基因失活（Sca I、 PvuI、Pst I）。
从pBR322上切去HaeII片断，既除去 了mob识别位点，又增加质粒的拷贝数。
第12页，共29页。
② 改造EcoR I 位点 pBR325： 使EcoRI 也成为插入失活型位点。 在pBR322位点上接入一段来自噬菌体 PICm的HaeII酶切片断（带有氯霉素抗性 基因cmlr）。 cmlr上也带一个EcoRI位点。
§ 视已知蛋白的cDNA序列为诱饵(bait)，将其与DNA结合域融合， 构建成诱饵质粒。
§ 将待筛选蛋母细胞中。
§ 酵母细胞中，已分离的DNA结合域和转录激活域不会相互作用， 但诱饵蛋白若能与待筛选的未知蛋白特异性地相互作用，则可激 活报告基因的转录；反之，则不能。利用4种报告基因的表达， 便可捕捉到新的蛋白质。
第20页，共29页。
③ lacZ的肽互补
1）-肽（ lacZ’ ）：
-半乳糖苷酶N端的一段氨基酸片断（11-41 氨基酸）。
4聚体
N端的11-41aa N端的11-41aa N端的11-41aa N端的11-41aa
C端大部分 C端大部分 C端大部分 C端大部分
lacZ只有在29页。
载体lacZ’与互补
酵母菌表面展示操作步骤之质粒构建
酵母菌表面展示操作步骤之质粒构建质粒构建是酵母菌表面展示技术的关键步骤之一。
通过质粒构建，可以将目标蛋白基因与表面展示载体进行连接，实现对目标蛋白在酵母菌表面的展示。
以下是酵母菌表面展示操作步骤之质粒构建的具体内容。
第一步：目标蛋白基因与表面展示载体设计根据目标蛋白的特性和所需实验目的，选择合适的表面展示载体。
常用的载体有pCTCON2、pYD1、pYD2等。
此外，还需要根据质粒构建所需的连接酶切位点，设计引物对目标蛋白基因进行扩增。
第二步：目标蛋白基因扩增利用PCR方法，使用设计好的引物对目标蛋白基因进行扩增。
扩增条件可以根据目标片段的长度和GC含量进行优化。
扩增后，通过琼脂糖凝胶电泳鉴定扩增产物的大小，并使用纯化试剂盒纯化产物。
第三步：表面展示载体线性化将表面展示载体进行限制性酶切，选择合适的限制性酶对载体进行切割。
切割产生的末端可以根据所需进行处理。
线性化的表面展示载体可以提高质粒的转化效率和稳定性。
第四步：目标蛋白基因与表面展示载体连接将线性化的表面展示载体与目标蛋白基因进行连接。
连接可以通过多种方法进行，如PCR法、接头连接法等。
连接方法的选择应根据实验需求进行。
第五步：连接产物转入宿主酵母菌将连接好的质粒转化到酵母菌宿主细胞中。
转化可以选择化学法或电转法进行。
转化后，将细胞均匀涂布在含有适当选择性的培养基上，利用培养基中的选择性条件筛选转化成功的菌落。
第六步：筛选和鉴定质粒对于转化成功的菌落，进行筛选和鉴定。
首先通过酵母菌表面展示的方法对菌落进行初步筛选。
初步筛选后的菌落进行PCR扩增，使用测序方法对扩增产物的序列进行验证。
第七步：质粒抽提和进一步分析对于验证成功的酵母菌菌株，进行质粒抽提。
常用的质粒抽提方法有碱裂解法、按序列分析法等。
抽提得到的质粒可以进行进一步分析，如限制性酶切、测序等。
以上就是酵母菌表面展示操作步骤之质粒构建的内容。
通过以上步骤，我们可以构建目标蛋白的表面展示载体，并将其成功转化到酵母菌中，为后续的酵母菌表面展示实验打下基础。
质粒构建全过程范文
质粒构建全过程范文质粒构建是分子生物学实验中的一项重要技术，用于将目标基因插入到质粒中，进而导入到宿主细胞中。
下面将详细介绍质粒构建的全过程。
第一步：设计引物在质粒构建之前，需要设计引物，包括引物序列的选择和设计。
引物是用于在PCR反应中扩增目标基因的特定序列。
引物的选择应考虑到目标基因的特点，如长度、GC含量、互补性及其它特异性需求。
第二步：PCR扩增目标基因通过PCR反应扩增目标基因，此过程中，使用上一步设计的引物。
PCR反应的条件和周期取决于目标基因的特点，如长度和GC含量。
扩增后的DNA片段可以通过琼脂糖凝胶电泳检测。
第三步：准备载体质粒选择一个合适的载体质粒，根据实验需求选择质粒的构型、大小及适用宿主细胞。
将质粒提取并进行消毒处理，以去除可能的污染物。
第四步：限制性内切酶切质粒与目标基因通过在特定位点使用限制性内切酶切割载体质粒和PCR扩增得到的目标基因，以生成互补的黏性末端。
第五步：连接目标基因与载体质粒将切割后的载体质粒与目标基因进行连接。
此时，两者的黏性末端会互相连接，形成短暂的连接体。
可以使用连接酶、盐溶液等辅助物质来增强连接效果。
连接后的质粒可以通过琼脂糖凝胶电泳检测。
第六步：转化宿主细胞将连接后的质粒转化到宿主细胞中，以使宿主细胞具有新质粒。
转化的方法有多种，包括化学法、电渗透法、热冲击法等。
选择合适的转化方法要考虑到宿主细胞的特点。
第七步：宿主细胞筛选与鉴定转化完成后，宿主细胞需要进行筛选与鉴定。
一般来说，可以利用抗生素抗性基因选择含有质粒的细胞。
通过培养在含有抗生素的培养基上，只有含有质粒的细胞能够生长。
第八步：验证目标基因的插入通过PCR扩增或测序等方法验证目标基因是否成功插入到质粒中，并且在宿主细胞中表达。
可以使用特异性引物扩增目标基因，然后进行琼脂糖凝胶电泳检测。
测序可以进一步验证目标基因的正确性。
第九步：扩增检测阳性菌落通过原核培养使阳性菌落扩增，以获得足够大量的质粒实验使用。
质粒构建的原理及方法
质粒构建的原理及方法质粒构建的原理及方法是指通过研究DNA片段的特征，以及其在生物学实验中的复制、表达、合成和移植的原理及方法，来构建质粒。
质粒是一类由DNA片段组成的可重复使用的基因工程载体，用于转移和表达外源基因，广泛应用于基因工程和生物技术研究中。
质粒构建的原理主要是根据DNA片段的周期性结构形成的，即质粒的结构是由DNA片段组成的，而不是其他的物质。
在质粒构建中，首先要明确需要构建的质粒的目的和功能，然后根据此目的和功能，从DNA片段库中选择合适的片段，将其组装成质粒，以达到预期的效果。
质粒构建的方法有几种，常用的有PCR扩增法、等位子构筑法、同源克隆法和限制性内切酶构建法等。
1 PCR扩增法：PCR扩增法是一种用于构建质粒的有效方法，其原理是利用特定酶，如Taq DNA聚合酶，对DNA 片段进行反复扩增，从而获得大量的DNA片段。
该方法的优点是快速、灵敏，可以构建任意大小的质粒，但也有一定的缺点，例如扩增的精确性和准确性较差，可能会引入噪声，影响质粒的质量。
2 等位子构建法：等位子构建法是指在特定的位置插入预先准备好的DNA片段，即将DNA片段配对到等位子上，从而构建质粒。
该方法的优点是可以以高精度构建质粒，精度可达99.9%，但是缺点是时间较长，构建大型质粒时耗时较长。
3 同源克隆法：同源克隆法是指将DNA片段插入到一种特定的质粒中，从而形成新的质粒。
该方法的优点是可以用于构建任意大小的质粒，但缺点是构建的质粒的精确性较差，可能会引入噪声，影响质粒的质量。
4 限制性内切酶构建法：限制性内切酶构建法是指将DNA片段插入到限制性内切酶识别序列中，从而形成质粒。
该方法的优点是可以快速构建质粒，而且可以构建任意大小的质粒，但缺点是质粒的精确性较差，可能会引入噪声，影响质粒的质量。
以上就是质粒构建的原理及方法，质粒构建的方法也不断发展壮大，未来还有可能推出更多的质粒构建方法，以满足更多的应用需求。
质粒的构建
质粒的构建一、质粒构建的基本原理1.1 质粒结构质粒是一种环状DNA分子，通常大小在1-200 kb之间，其中包含了一个或多个基因编码序列，以及与复制、表达等相关的功能序列。
质粒通常由多个功能区域组成，包括基因插入位点、选择标记、复制起点、多克隆位点等。
1.2 质粒构建方法质粒构建一般分为以下几个步骤：基因克隆、质粒挑选、连接反应、转化、筛选，这些步骤通常需要借助于PCR、限制性内切酶、DNA连接酶、转化试剂等。
1.3 质粒的应用质粒构建技术广泛应用于基因工程、蛋白质表达、基因敲除、基因组编辑等领域。
通过构建特定功能的质粒，可以实现对基因的操控和调控，对生物学功能进行研究。
二、质粒构建的方法与步骤2.1 基因克隆质粒构建的第一步通常是通过PCR扩增目的基因，得到目的基因片段。
基因片段的选择根据实验需要，可以是全长基因、部分序列、突变体等。
2.2 质粒挑选选择合适的质粒载体是质粒构建的关键一步。
通常质粒载体的选择考虑到基因插入位点、复制起点、选择标记等功能。
常用的质粒载体有pUC19、pBR322、pET等。
2.3 连接反应将基因片段与质粒载体进行连接反应，通常需要利用DNA连接酶将两者连接起来。
连接反应后，通过热激酶等方法将连接产物转化到大肠杆菌等宿主细胞中。
2.4 转化转化是将连接后的质粒DNA导入到宿主细胞中的过程，通常采用化学转化、电穿孔转化、热激等方法进行。
2.5 筛选通过选择标记或多克隆位点等方法对转化后的细胞进行筛选，筛选出含有目的质粒的阳性克隆。
通常可以利用抗生素抗性筛选、荧光报告基因筛选等方法。
三、质粒构建的应用3.1 基因工程质粒构建技术可以用于将外源基因导入到宿主细胞中，实现基因的操控和表达。
通过构建携带感兴趣基因的质粒，可以实现对基因编码蛋白质的表达和研究。
3.2 蛋白质表达利用质粒携带外源基因序列，在宿主细胞中进行蛋白质表达。
通过构建携带目的基因的质粒，可以实现对特定蛋白质的大量表达和纯化。
构建质粒的步骤
构建质粒的步骤构建质粒是一种重要的实验技术，用于在细菌或其他生物体中携带和复制外源DNA。
下面将介绍构建质粒的步骤。
1. 选择质粒载体：首先需要选择适合的质粒载体。
质粒载体是一种环状DNA分子，可以自主复制并在宿主细胞中表达外源基因。
常用的质粒载体有pUC18、pBR322等。
选择适合的质粒载体需要考虑载体大小、复制起点、抗生素抗性基因等因素。
2. 获得外源DNA片段：外源DNA片段可以是来自其他生物体的DNA序列，也可以是人工合成的。
获得外源DNA片段的方法有PCR扩增、限制性内切酶切割等。
3. 切割质粒和外源DNA：使用限制性内切酶将质粒和外源DNA切割成互补的黏性末端。
确保切割后的DNA末端与质粒载体互补，以便进行连接。
4. 连接质粒和外源DNA：通过DNA连接酶将切割后的质粒和外源DNA连接起来，形成重组质粒。
连接时需要考虑连接缓冲液的条件和酶的适宜温度。
5. 转化宿主细胞：将重组质粒导入宿主细胞中，使其能够复制和表达外源基因。
常用的转化方法有热激转化、电击转化等。
转化后，需要在含有抗生素的培养基上筛选出含有质粒的转化子。
6. 确认质粒的构建：通过PCR扩增、限制性内切酶切割或测序等方法，确认质粒是否成功构建，并验证外源基因是否正确插入。
7. 大规模培养质粒：如果质粒构建成功，可以进行大规模培养，以获得足够的质粒量。
培养条件需要根据质粒载体的特性进行调整。
8. 提取质粒：使用质粒提取试剂盒等方法，从大规模培养的细菌中提取质粒。
提取的质粒可以用于进一步的实验研究或应用。
通过以上步骤，就可以成功构建质粒。
构建质粒是分子生物学研究中常用的技术手段，可以用于基因克隆、基因表达、基因敲除等研究中。
同时，构建质粒也是基因工程和生物工程的重要基础。
质粒构建
PCR（多聚酶链式反应）一、实验原理PCR用于扩增位于两端已知序列之间的DNA区段，即通过引物延伸而进行的重复双向DNA合成。
基本原理及过程如下：PCR循环过程中有三种不同的事件发生：（1）模板变性；（2）引物退火；（3）热稳定DNA聚合酶进行DNA合成。
1、变性：加热使模板DNA在高温下（94-95℃）变性，双链间的氢键断裂而形成两条单链，即变性阶段。
2、退火：在体系温度降至37-65℃，模板DNA与引物按碱基配对原则互补结合，使引物与模板链3’端结合，形成部分双链DNA，即退火阶段。
3、延伸：体系反应温度升至中温72℃，耐热DNA聚合酶以单链DNA为模板，在引物的引导下，利用反应混合物中的4种脱氧核苷三磷酸（dNTP），按5’到3’方向复制出互补DNA，即引物的延伸阶段。
上述3步为一个循环，即高温变性、低温退火、中温延伸3个阶段。
从理论上讲，每经过一个循环，样本中的DNA量应该增加一倍，新形成的链又可成为新一轮循环的模板，经过25～30个循环后DNA可扩增106～109倍。
典型的PCR反应体系由如下组分组成：DNA模板、反应缓冲液、dNTP、MgCl2、两条合成的DNA引物、耐热DNA Taq聚合酶。
二、按下列组份配制PCR 反应液TaKaRa LA Taq（5 U/μl）0.5 μl10×LA PCR Buffer II（Mg2+ Plus） 5 μldNTP Mixture（各2.5 mM）8 μl模板DNA（λDNA）* 2.5 ng引物1（10 μM） 2 μl引物2（10 μM） 2 μl灭菌蒸馏水up to 50 μl*【50 μl PCR反应体系中模板DNA 推荐使用量】人基因组DNA 0.1 μg～1 μg大肠杆菌基因组DNA 10 ng～100 ngλDNA 0.5 ng～5 ng质粒DNA 0.1 ng～10 ng三、PCR 反应条件。
以λDNA 为模板，扩增 1 kbp、35 kbp 的DNA片段的PCR 反应条件如下：【1 kbp】95℃ 5 min.95℃30 sec.55℃30 sec. 35 Cycles72℃ 1 min.72℃10 min.【35 kbp】94℃ 5 min.98℃10 sec.68℃15 min. 35 Cycles72℃10 min.常用循环：95℃ 5 min.95℃45 sec.55℃45 sec. 35 Cycles72℃ 2 min.72℃10 min.四、可能出现的问题与解决方案：1、假阴性，不出现扩增条带PCR反应的关键环节有①模板核酸的制备，②引物的质量与特异性，③酶的质量，④PCR循环条件。
构建质粒详细步骤
构建质粒详细步骤在基因工程中，构建质粒是一项基础且关键的任务，以下是构建质粒的详细步骤。
1.目的基因获取首先，需要获取目的基因。
目的基因可以通过引物设计和克隆载体构建的方法获得。
引物设计是根据目标基因的序列，通过软件辅助设计出一对特异性引物。
克隆载体构建则是根据目标基因的特点，选择或构建一个适合的克隆载体，以便于目的基因的获取和后续操作。
2.载体质粒选择在获取目的基因之后，需要选择一个合适的载体质粒。
载体质粒的选择应考虑以下几个因素：质粒来源（如细菌、酵母等）、质粒大小（合适的大小能够确保插入的目的基因稳定存在并且可复制）、质粒序列（序列应清晰、稳定，以确保质粒的准确性）。
3.酶切质粒和目的基因获取到的质粒和目的基因需要进行酶切处理。
这一步骤主要是为了将目的基因插入到质粒中。
通常使用限制性内切酶对质粒和目的基因进行酶切，并且需要控制酶切时间和温度，以确保酶切效果良好且不会对DNA造成损伤。
4.T4DNA连接酶连接酶切后的质粒和目的基因需要通过T4DNA连接酶进行连接。
T4DNA连接酶能够将具有互补黏性末端的DNA片段连接起来。
在这个过程中，需要控制DNA的浓度、缓冲液的选择、反应温度以及是否过夜连接等条件，以确保连接的有效性和正确性。
5.转化受体细胞连接完成的质粒需要转化入受体细胞中。
常见的受体细胞包括细菌、酵母、昆虫等。
转化过程需要考虑受体细胞的类型、数量、转化效率和筛选策略等因素。
例如，对于细菌转化，需要选择感受态细胞作为受体细胞，并控制转化温度和时间以确保转化效率。
6.克隆筛选及鉴定转化后的受体细胞需要进行克隆筛选和鉴定，以找出含有正确插入目的基因的克隆。
筛选和鉴定可以通过菌液制备、抗体制备、筛选策略和鉴定方法等步骤实现。
例如，可以通过菌落PCR或抗药性筛选策略筛选出阳性克隆，并采用DNA测序等技术对阳性克隆进行鉴定。
7.质粒大量制备最后，需要对筛选出的阳性克隆进行大量制备质粒的操作。
这一步骤通常采用碱裂解法或热法等常规方法制备质粒。
质粒构建 关键技术
质粒构建1.简介在分子生物学研究中，质粒构建是常用的技术手段之一。
质粒是一种圆环状的DNA分子，可被用于在细胞中传递和复制外源基因。
通过将外源基因插入质粒中，研究者可以实现基因的表达、检测和传递等多种目的。
质粒构建包括质粒的选择、基因片段的插入、转化和筛选等步骤，是进行基因工程研究的基础。
2.质粒的选择质粒的选择是质粒构建的第一步，不同的实验目的和研究要求需要选择不同的质粒。
常用的质粒有载体质粒和表达质粒两类。
2.1 载体质粒载体质粒是研究中最常使用的质粒类型之一。
它们通常具有高复制数和选择性。
常见的载体质粒有pUC18、pBR322等。
选择载体质粒时需要考虑质粒的大小、复制数、选择标记和聚合酶启动子等因素。
2.2 表达质粒表达质粒是用于表达外源基因的质粒。
它们通常具有启动子、翻译子和终止子等功能元件，能够在宿主细胞中高效地转录和翻译目标蛋白。
常见的表达质粒有pET、pGEX等。
3.基因片段的插入在质粒构建中，将外源基因片段插入质粒是重要的一步。
这通常通过酶切和连接技术完成。
3.1 酶切酶切是将DNA分子按照特定序列切割成片段的过程。
常用的酶切酶有限制性内切酶。
通过选择合适的酶切酶，可以切割目标基因和质粒的DNA，生成粘性或平滑的末端。
在酶切时，需要考虑酶切位点的位置和酶切反应的条件。
3.2 连接连接是将切割好的质粒和目标基因片段连接在一起的过程。
这通常通过DNA连接酶完成，如T4 DNA连接酶。
连接成功后，可以通过转化技术将重组质粒导入宿主细胞。
4.转化和筛选转化是将质粒导入宿主细胞的过程。
在一般情况下，大肠杆菌是常用的宿主细胞。
转化技术通常包括热激、电穿孔和化学法等。
转化后，通过筛选可以获得含有目标基因的细胞。
4.1 筛选标记筛选标记是通过在质粒中引入某个选择标记来实现对转化细胞的选择。
常用的筛选标记有抗生素抗性基因、荧光蛋白基因等。
通过在培养基中添加相应的选择性抗生素，只有含有质粒的转化细胞能够生长。
构建质粒原理
构建质粒原理
质粒原理是指质粒的特性和功能原理，质粒作为一种圆环状的DNA分子，常存在于细菌和其他一些生物体中。
质粒含有自
我复制的基因序列，通常可以独立于细菌染色体复制和遗传。
质粒的构建主要包括以下几个步骤：
1. DNA提取：从某个生物体中提取目标DNA序列，可以通过PCR扩增等方法得到所需基因片段。
2. 寻找适合的质粒：根据目标基因片段的大小、复制起始位点以及所需表达的细菌菌株等条件，选择合适的质粒。
3. 质粒预处理：将质粒以及目标DNA片段进行酶切，选择适
当的限制酶将目标DNA片段插入到质粒的多克隆位点上。
4. 连接：通过DNA连接酶将目标DNA插入到质粒上，得到
重组质粒。
5. 质粒转化：将重组质粒导入到一种适合的宿主细菌中，通过热激冷冻法、电穿孔法等方法使质粒在细菌中稳定复制。
6. 表达：通过适当的诱导剂或选择性培养基，促使质粒在细菌中大量复制和表达目标基因。
通过质粒构建，可以实现目标基因的研究和表达。
质粒原理的核心是质粒的自主复制和传递，通过构建重组质粒，可以将外源基因有效地导入到宿主细菌中，实现目标基因的放大和表达。
质粒构建流程
质粒构建流程质粒构建是分子生物学实验中常见的一项重要技术，它可以用于基因克隆、蛋白表达、基因编辑等多个领域。
在本文中，我们将介绍质粒构建的基本流程，希望能够帮助大家更好地理解和掌握这一技术。
第一步，设计引物。
质粒构建的第一步是设计引物。
引物是一小段单链DNA，它们的序列与目标DNA的两端相互补。
在构建质粒时，我们需要设计两对引物，分别用于扩增目标DNA的两端。
引物设计的好坏将直接影响到后续的实验效果，因此需要仔细选择引物的序列，确保其具有高度的特异性和稳定性。
第二步，PCR扩增。
设计好引物后，接下来就是进行PCR扩增。
PCR是一种体外合成DNA的方法，通过PCR扩增可以在短时间内获得大量目标DNA。
在PCR反应中，我们需要将待扩增的DNA模板、引物、DNA聚合酶和反应缓冲液混合，然后进行一系列的温度循环，最终得到目标DNA的扩增产物。
第三步，酶切和连接。
获得PCR产物后，接下来需要进行酶切和连接。
酶切是利用限制性内切酶在特定的酶切位点上切割DNA分子，从而得到特定的DNA片段。
在质粒构建中，我们通常会选择两种不同的限制性内切酶，分别用于酶切目标DNA和质粒载体。
然后将酶切后的目标DNA 片段与质粒载体连接，形成重组质粒。
第四步，转化和筛选。
最后一步是将重组质粒转化至宿主细胞中，然后进行筛选。
转化是利用化学方法或电穿孔法将质粒导入宿主细胞内，使其在细胞内进行复制和表达。
然后通过对转化后的细胞进行抗生素筛选或荧光筛选，筛选出含有目标重组质粒的细胞克隆。
总结。
质粒构建是一项复杂而又重要的实验技术，它涉及到许多分子生物学的基本原理和实验操作。
通过本文的介绍，相信大家对质粒构建的流程有了更清晰的认识。
当然，质粒构建的具体操作还需要根据实验的具体要求和目的进行调整和优化。
希望本文能够为大家在质粒构建实验中提供一些帮助和指导。
质粒构建流程1(总7页)
质粒构建流程1(总7页)质粒构建是现代分子生物学研究中非常关键的一步。
在细菌中将需要表达的外源基因通过质粒表达，已经被广泛应用于蛋白表达、基因功能分析和疫苗研究等方面。
下面我们将详细介绍质粒构建的流程。
一、质粒选择在进行质粒构建之前，首先要根据实验需求选择适合的质粒。
目前常用的质粒有pUC19、pET系列、pcDNA3.1等。
选择质粒时需要考虑以下因素：1. 质粒大小：不同质粒大小不同，承载的基因段数也不同，需要根据实验需要选择适合的大小。
2. 引物、酶切位点：质粒上的引物和酶切位点需要考虑是否符合实验设计，方便后面的操作。
3. 表达宿主：质粒表达需要宿主细胞，不同宿主细胞适合表达的质粒不同，需要根据实验需要选择适合的宿主细胞。
4. 表达标签：如果需要通过表达检测蛋白质，可以选择带有表达标签的质粒，如His 标签、Flag标签等。
5. 细菌抗性标记：质粒需要选择带有适当的细菌抗性标记，方便后续筛选。
二、PCR扩增目的基因在选择了适合的质粒之后，需要将需要表达的目的基因进行PCR扩增，以得到DNA模板，方便后续质粒构建过程。
PCR扩增需要根据实验目的设计合适的引物，引物需要选择在基因片段两端的序列上。
一般情况下，引物序列长度为18-30bp，并且需要避免序列间存在重复。
此外，引物需要考虑跨越的酶切位点，方便后续克隆操作。
PCR反应体系一般包括模板DNA、引物、Taq DNA聚合酶、缓冲液和dNTPs等。
反应条件为94℃预变性2-5min，94℃变性30s，温度根据引物长度而定，一般为55-65℃，延伸时间1-3min，72℃合成外显子，最后72℃固定3-5min。
扩增反应可以根据需求选择合适的引物、反应体系和行程。
三、酶切质粒酶切质粒是将已有质粒经过酶切后得到的线性化质粒。
酶切需要选择适合的内切酶切割质粒，切割后的末端需要具有互补的序列，以方便后续的连接操作。
酶切反应需要同时加入酶和反应缓冲液，反应条件需要根据不同酶而定。
基因编辑中的质粒构建技术
基因编辑中的质粒构建技术基因编辑已经成为现代生物技术中的重要工具，它可以通过改变生物体的基因组，实现对其基因信息的精确修饰。
而在基因编辑的过程中，质粒构建技术起着关键作用。
本文将探讨基因编辑中的质粒构建技术及其应用。
质粒是一种环状DNA分子，可以在细菌等生物体内复制和传递，它是基因编辑工具的重要载体。
质粒构建技术是指将目标基因组的DNA片段与质粒DNA连接，形成新的质粒分子。
质粒构建技术的基本步骤包括目标DNA的获取、质粒DNA的选择、DNA片段连接和质粒构建的验证。
首先，在基因编辑中，目标DNA可以通过不同的方法获得，如PCR扩增、基因合成或DNA库筛选。
这些方法可以从已知基因组中特异性扩增出目标DNA片段，提供进一步编辑的基础。
其次，选择适当的质粒也是质粒构建技术的重要一环。
质粒通常具有细菌选择标记、启动子、终止子和特定的多克隆位点。
它们可以导入宿主细胞，使质粒表达目标基因。
然后，将目标DNA片段与选定的质粒进行连接。
连接方法主要有限制性内切酶切割法、PCR重叠延伸法和基因合成法等。
限制性内切酶切割法是最常用的方法，通过DNA酶切及黏性末端连接实现DNA片段的连接。
PCR重叠延伸法则是利用PCR反应扩增出具有重叠部分的DNA片段，并通过PCR重组连接两个片段。
基因合成法则通过人工合成DNA序列，直接获得目标DNA片段。
最后，质粒构建的验证是确保基因编辑工作顺利进行的重要一步。
常用的方法包括限制性内切酶切割检测、PCR检测、测序及功能鉴定等。
这些验证手段可以检测质粒的正确性和稳定性，确保质粒构建的可靠性和可行性。
基因编辑中的质粒构建技术在许多生物研究领域得到了广泛的应用。
例如，在基因敲除研究中，质粒构建技术可以用来构建sgRNA（single guide RNA）序列，以引导Cas9蛋白靶向特定基因位点，实现基因组插入或缺失。
在基因敲入研究中，质粒构建技术则可用于引入外源DNA或基因片段至目标基因组。
scramble质粒构建
scramble质粒构建Scramble质粒构建是一种基因工程技术，用于改变DNA序列，从而实现对目标基因的研究和应用。
在这种技术中，通过将不同的DNA片段随机组合，生成一个新的质粒序列，从而产生多样性和变异性。
Scramble质粒构建的基本步骤包括：1. 选择目标基因：首先需要确定要研究或应用的目标基因。
这个基因可以来自任何生物体，包括细菌、植物、动物等。
2. 分离DNA：将目标生物体中的DNA提取出来，并进行纯化和浓缩。
3. 切割DNA：使用限制性内切酶将DNA切成小片段，并进行电泳分离。
这样可以得到多个不同大小的DNA片段。
4. 随机组合：将不同大小的DNA片段随机组合，并使用连接酶连接它们。
这样可以得到一个新的质粒序列。
5. 转化宿主细胞：将新构建的质粒转化到宿主细胞中。
宿主细胞可以是大肠杆菌等常见实验室细菌。
6. 筛选正常克隆：通过PCR、限制性内切酶切割等方法筛选出正常克隆，确认新构建的质粒序列。
Scramble质粒构建的优点是可以产生多样性和变异性，从而扩大了基因工程的应用范围。
例如，在药物研发中，可以通过Scramble质粒构建来寻找新的药物靶点；在农业领域中，可以通过Scramble质粒构建来改良作物品种等。
然而，Scramble质粒构建也存在一些缺点。
首先，由于随机组合的过程是不可控的，可能会产生无用或有害的序列。
其次，在转化宿主细胞时，新构建的质粒可能会与宿主细胞染色体发生重组，导致不稳定性和不可预测性。
总之，Scramble质粒构建是一种有潜力的基因工程技术，可以用于改变DNA序列，并产生多样性和变异性。
在应用中需要注意其缺点，并采取相应措施来减少风险。
鉴定质粒构建是否成功的方法
鉴定质粒构建是否成功的方法
鉴定质粒构建是否成功的方法主要有以下几点：
1.PCR检测：通过检测目标基因是否存在于质粒中，可以初步判断质粒构建
是否成功。
如果能够扩增出目标基因的特异性条带，说明质粒中含有目的基因。
2.酶切鉴定：对质粒进行限制性内切核酸酶消化，如果能够产生特定的DNA
片段，则说明质粒构建成功。
酶切鉴定可以进一步验证目的基因是否正确插入到质粒中。
3.测序鉴定：对质粒进行全序列测序，与已知的目的基因序列进行比对，如
果完全一致，则说明质粒构建成功。
测序鉴定是验证质粒构建是否成功的最准确方法。
4.表达功能检测：如果质粒构建的目的是为了表达特定蛋白，可以通过
Western blot等方法检测表达的蛋白是否符合预期。
如果能够检测到特异的蛋白条带，则说明质粒构建成功并且能够在宿主细胞中表达目标蛋白。
5.抗性筛选：如果质粒带有抗性基因，可以通过抗性筛选来验证质粒构建是
否成功。
将质粒转化到大肠杆菌等受体细胞中，如果能够筛选到带有抗性的菌落，则说明质粒构建成功。
需要注意的是，这些方法各有优缺点，根据实际情况选择适合的方法进行验证。
如果一种方法无法确定质粒构建是否成功，可以结合多种方法进行综合判断。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
PCR（多聚酶链式反应）一、实验原理PCR用于扩增位于两端已知序列之间的DNA区段，即通过引物延伸而进行的重复双向DNA合成。
基本原理及过程如下：PCR循环过程中有三种不同的事件发生：（1）模板变性；（2）引物退火；（3）热稳定DNA聚合酶进行DNA合成。
1、变性：加热使模板DNA在高温下（94-95℃）变性，双链间的氢键断裂而形成两条单链，即变性阶段。
2、退火：在体系温度降至37-65℃，模板DNA与引物按碱基配对原则互补结合，使引物与模板链3’端结合，形成部分双链DNA，即退火阶段。
3、延伸：体系反应温度升至中温72℃，耐热DNA聚合酶以单链DNA为模板，在引物的引导下，利用反应混合物中的4种脱氧核苷三磷酸（dNTP），按5’到3’方向复制出互补DNA，即引物的延伸阶段。
上述3步为一个循环，即高温变性、低温退火、中温延伸3个阶段。
从理论上讲，每经过一个循环，样本中的DNA量应该增加一倍，新形成的链又可成为新一轮循环的模板，经过25～30个循环后DNA可扩增106～109倍。
典型的PCR反应体系由如下组分组成：DNA模板、反应缓冲液、dNTP、MgCl2、两条合成的DNA引物、耐热DNA Taq聚合酶。
二、按下列组份配制PCR 反应液TaKaRa LA Taq（5 U/μl）0.5 μl10×LA PCR Buffer II（Mg2+ Plus） 5 μldNTP Mixture（各2.5 mM）8 μl模板DNA（λDNA）* 2.5 ng引物1（10 μM） 2 μl引物2（10 μM） 2 μl灭菌蒸馏水up to 50 μl*【50 μl PCR反应体系中模板DNA 推荐使用量】人基因组DNA 0.1 μg～1 μg大肠杆菌基因组DNA 10 ng～100 ngλDNA 0.5 ng～5 ng质粒DNA 0.1 ng～10 ng三、PCR 反应条件。
以λDNA 为模板，扩增 1 kbp、35 kbp 的DNA片段的PCR 反应条件如下：【1 kbp】95℃ 5 min.95℃30 sec.55℃30 sec. 35 Cycles72℃ 1 min.72℃10 min.【35 kbp】94℃ 5 min.98℃10 sec.68℃15 min. 35 Cycles72℃10 min.常用循环：95℃ 5 min.95℃45 sec.55℃45 sec. 35 Cycles72℃ 2 min.72℃10 min.四、可能出现的问题与解决方案：1、假阴性，不出现扩增条带PCR反应的关键环节有①模板核酸的制备，②引物的质量与特异性，③酶的质量，④PCR循环条件。
寻找原因亦应针对上述环节进行分析研究。
模板：①模板中含有Taq酶抑制剂，②在提取制备模板时丢失过多，或吸入酚。
③模板核酸变性不彻底。
在酶和引物质量好时，不出现扩增带，有可能是模板核酸提取过程出了毛病，可使用阳性对照的DNA模板配合检查模板质量。
酶失活：需更换新酶，或新旧两种酶同时使用，以分析是否因酶的活性丧失或不够而导致假阴性。
引物：引物质量、引物的浓度、两条引物的浓度是否对称，是PCR失败或扩增条带不理想、容易弥散的常见原因。
有些批号的引物合成质量有问题，两条引物一条浓度高，一条浓度低，造成低效率的不对称扩增，对策为：①选定一个好的引物合成单位。
②引物的浓度不仅要看OD值，更要注重引物原液做琼脂糖凝胶电泳，一定要有引物条带出现，而且两引物带的亮度应大体一致，如一条引物有条带，一条引物无条带，此时做PCR有可能失败，应和引物合成单位协商解决。
如一条引物亮度高，一条亮度低，在稀释引物时要平衡其浓度。
③引物应高浓度小量分装保存，防止多次冻融或长期放冰箱冷藏，导致引物变质降解失效。
④引物设计不合理，如引物长度不够，引物之间形成二聚体等。
Mg2+浓度：Mg2+离子浓度对PCR扩增效率影响很大，浓度过高可降低PCR 扩增的特异性，浓度过低则影响PCR扩增产量甚至使PCR扩增失败而不出扩增条带。
反应体积的改变：通常进行PCR扩增采用的体积为20ul、30ul、50ul、或100ul，应用多大体积进行PCR扩增，是根据科研和临床检测不同目的而设定，在做小体积如20ul 后，再做大体积时，一定要模索条件，否则容易失败。
物理原因：变性对PCR扩增来说相当重要，如变性温度低，变性时间短，极有可能出现假阴性;退火温度过低，可致非特异性扩增而降低特异性扩增效率，退火温度过高影响引物与模板的结合而降低PCR扩增效率。
有时还有必要用标准的温度计，检测一下扩增仪或水溶锅内的变性、退火和延伸温度，这也是PCR 失败的原因之一。
靶序列变异：如靶序列发生突变或缺失，影响引物与模板特异性结合，或因靶序列某段缺失使引物与模板失去互补序列，其PCR扩增是不会成功的。
2、假阳性出现的PCR扩增条带与目的靶序列条带一致，有时其条带更整齐，亮度更高。
引物设计不合适：选择的扩增序列与非目的扩增序列有同源性，因而在进行PCR扩增时，扩增出的PCR产物为非目的性的序列。
靶序列太短或引物太短，容易出现假阳性。
需重新设计引物。
靶序列或扩增产物的交叉污染：这种污染有两种原因：一是整个基因组或大片段的交叉污染，导致假阳性。
这种假阳性可用以下方法解决：①操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外。
②除酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或器材均应高压消毒。
所用离心管及样进枪头等均应一次性使用。
③必要时，在加标本前，反应管和试剂用紫外线照射，以破坏存在的核酸。
二是空气中的小片段核酸污染，这些小片段比靶序列短，但有一定的同源性。
可互相拼接，与引物互补后，可扩增出PCR产物，而导致假阳性的产生，可用巢式PCR方法来减轻或消除。
3、出现非特异性扩增带PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大或小，或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带。
非特异性条带的出现，其原因：一是引物与靶序列不完全互补、或引物聚合形成二聚体。
二是Mg2+离子浓度过高、退火温度过低，及PCR循环次数过多有关。
其次是酶的质和量，往往一些来源的酶易出现非特异条带而另一来源的酶则不出现，酶量过多有时也会出现非特异性扩增。
其对策有：①必要时重新设计引物。
②减低酶量或调换另一来源的酶。
③降低引物量，适当增加模板量，减少循环次数。
④适当提高退火温度或采用二温度点法(93℃变性，65℃左右退火与延伸)。
4、出现片状拖带或涂抹带PCR扩增有时出现涂抹带或片状带或地毯样带。
其原因往往由于酶量过多或酶的质量差，dNTP浓度过高，Mg2+浓度过高，退火温度过低，循环次数过多引起。
其对策有：①减少酶量，或调换另一来源的酶。
②减少dNTP的浓度。
③适当降低Mg2+浓度。
④增加模板量，减少循环次数。
酶切（主要是针对NEB品牌的酶）1. 单酶切1.1一般反应体系DNA* ≤1ug ≤2ug10×NEB缓冲液2ul 5ul100×BSA 0.2ul 0.5ul内切酶0.5ul 1ul灭菌双蒸水至20ul 至50ul*酶切2ug以上的DNA，请根据上诉体系进行调整。
2. 双酶切同步双酶切是一种省时省力的常用方法。
选择能让两种酶同时作用的最佳缓冲液并避免星号活性是非常重要的一步。
2.1 双酶切体系的建立选择最大程度上保证两种酶活性的缓冲液用于双酶切。
只要其中一种酶需要添加BSA，则应在双酶切反应体系中加入BSA（BSA 不会影响任何内切酶活性）。
按推荐条件建立反应体系。
反应体系中甘油的终浓度应< 5% 以避免星号活性。
例如，50 μl 反应体系中总酶量不> 5 μl。
按推荐温度温育。
为避免星号活性不建议温育过夜做双酶切反应。
如果需要两种不同温育温度，先选择理想的反应缓冲液，加入第一种酶在适合的温度下反应，热失活第一种酶后再加入第二种酶按推荐温度温育。
在非优化反应缓冲液中反应时，根据每种酶在非最优缓冲液中的具体活性相应调整酶量和反应时间。
特殊缓冲液双酶切反应信息，请登陆及 网站利用双酶切分析软件选择合适的双酶切反应条件。
利用此在线工具可查询用两种NEB 限制性内切酶进行双酶切的建议反应条件。
双酶切注释：只要其中一种酶需要添加BSA，则应在双酶切反应系统中加入BSA。
BSA 不会影响任何内切酶的活性。
某些内切酶的组合不能进行同步双酶切，只能采用分步法进行双酶切。
上表中这些组合以“seq”标注。
这些数据来源于1－2 小时的酶切实验。
避免过夜进行双酶切，以防止可能出现的星活性。
BsgI 需要添加SAM。
加入SAM 不会对其它酶的活性产生负面影响。
SmaI 反应温度为25℃，可以将温度提高到37℃再进行第二个酶的消化。
SmaI 在两次酶切反应之间应热失活。
高保真内切酶通过基因工程减低其星号活性，在NEBuffer 4 中活性为100%，方便双酶切。
3. 分步酶切体系的建立分步酶切应从推荐缓冲液盐浓度低的酶开始，温育至酶切完毕。
调整缓冲液中盐浓度（用小体积浓缩盐溶液）直至满足第二种酶的要求。
加入第二种酶完成双酶切反应。
也可在第二步酶切反应前过柱纯化DNA。
限制性内切酶实验问题指南连接1. 实验原理1.1 DNA的连接策略质粒具有稳定可靠和操作简便的优点。
如果要克隆较小的DNA片段(＜10kb)且结构简单，质粒要比其它任何载体都要好。
在质粒载体上进行克隆，从原理上说是很简单的，先用限制性内切酶切割质粒DNA和目的DNA片段，然后体外使两者相连接，再用所得到重组质粒转化细菌，即可完成。
外源DNA片段和质粒载体的连接反应策略有以下几种：（1）互补性粘性末端的连接单一限制性内切酶或两种限制性内切酶（为同尾酶，如BamHI和BglII）分别处理载体和外源DNA，得到的粘性末端为互补性突出末端，在连接反应中外源片段和质粒载体DNA均可能发生自身环化或几个分子串连形成寡聚物，且正反两种连接方向都可能有。
为了降低载体的自身环化，使正确的连接产物数量达到最高水平，一般载体DNA和外源DNA的分子数比（浓度比）为1：3～1：10之间。
同时，为了最大限度地抑制质粒DNA的自身环化，还可将载体DNA的5’磷酸基团用碱性磷酸酯酶去掉，防止其自身环化。
而带5’端磷酸的外源DNA片段可有效地与去磷酸化的载体相连，产生一个带有两个缺口的开环分子，在转入E.coli受体菌后该种缺口可在DNA复制过程种自动修复。
（2）非互补粘性末端的连接用两种不同的限制性内切酶进行消化可以产生带有非互补的粘性末端，这DNA重组中最容易克隆的DNA片段。
一般情况下，常用质粒载体均带有多个不同限制酶的识别序列组成的多克隆位点，因而几乎总能找到与外源DNA片段末端匹配的限制酶切位点的载体，从而将外源片段定向地克隆到载体上。
也可在PCR扩增时，在DNA片段两端人为加上不同酶切位点以便与载体相连。