质粒构建

PCR（多聚酶链式反应）
一、实验原理
PCR用于扩增位于两端已知序列之间的DNA区段，即通过引物延伸而进行的重复双向DNA合成。

基本原理及过程如下：
PCR循环过程中有三种不同的事件发生：（1）模板变性；（2）引物退火；（3）热稳定DNA聚合酶进行DNA合成。

1、变性：加热使模板DNA在高温下（94-95℃）变性，双链间的氢键断裂而形
成两条单链，即变性阶段。

2、退火：在体系温度降至37-65℃，模板DNA与引物按碱基配对原则互补结合，
使引物与模板链3’端结合，形成部分双链DNA，即退火阶段。

3、延伸：体系反应温度升至中温72℃，耐热DNA聚合酶以单链DNA为模板，
在引物的引导下，利用反应混合物中的4种脱氧核苷三磷酸（dNTP），
按5’到3’方向复制出互补DNA，即引物的延伸阶段。

上述3步为一个循环，即高温变性、低温退火、中温延伸3个阶段。

从理论上讲，每经过一个循环，样本中的DNA量应该增加一倍，新形成的链又可成为新一轮循环的模板，经过25～30个循环后DNA可扩增106～109倍。

典型的PCR反应体系由如下组分组成：DNA模板、反应缓冲液、dNTP、MgCl2、两条合成的DNA引物、耐热DNA Taq聚合酶。

二、按下列组份配制PCR 反应液
TaKaRa LA Taq（5 U/μl）0.5 μl
10×LA PCR Buffer II（Mg2+ Plus） 5 μl
dNTP Mixture（各2.5 mM）8 μl
模板DNA（λDNA）* 2.5 ng
引物1（10 μM） 2 μl
引物2（10 μM） 2 μl
灭菌蒸馏水up to 50 μl
*【50 μl PCR反应体系中模板DNA 推荐使用量】
人基因组DNA 0.1 μg～1 μg
大肠杆菌基因组DNA 10 ng～100 ng
λDNA 0.5 ng～5 ng
质粒DNA 0.1 ng～10 ng
三、PCR 反应条件。

以λDNA 为模板，扩增 1 kbp、35 kbp 的DNA片段的PCR 反应条件如下：【1 kbp】
95℃ 5 min.
95℃30 sec.
55℃30 sec. 35 Cycles
72℃ 1 min.
72℃10 min.
【35 kbp】
94℃ 5 min.
98℃10 sec.
68℃15 min. 35 Cycles
72℃10 min.
常用循环：
95℃ 5 min.
95℃45 sec.
55℃45 sec. 35 Cycles
72℃ 2 min.
72℃10 min.
四、可能出现的问题与解决方案：
1、假阴性，不出现扩增条带
PCR反应的关键环节有①模板核酸的制备，②引物的质量与特异性，③酶的质量，④PCR循环条件。

寻找原因亦应针对上述环节进行分析研究。

模板：①模板中含有Taq酶抑制剂，②在提取制备模板时丢失过多，或吸入酚。

③模板核酸变性不彻底。

在酶和引物质量好时，不出现扩增带，有可能是模板核酸提取过程出了毛病，可使用阳性对照的DNA模板配合检查模板质量。

酶失活：需更换新酶，或新旧两种酶同时使用，以分析是否因酶的活性丧失或不够而导致假阴性。

引物：引物质量、引物的浓度、两条引物的浓度是否对称，是PCR失败或扩增条带不理想、容易弥散的常见原因。

有些批号的引物合成质量有问题，两条引物一条浓度高，一条浓度低，造成低效率的不对称扩增，对策为：①选定一个好的引物合成单位。

②引物的浓度不仅要看OD值，更要注重引物原液做琼脂糖凝胶电泳，一定要有引物条带出现，而且两引物带的亮度应大体一致，如一条引物有条带，一条引物无条带，此时做PCR有可能失败，应和引物合成单位协商解决。

如一条引物亮度高，一条亮度低，在稀释引物时要平衡其浓度。

③引物应高浓度小量分装保存，防止多次冻融或长期放冰箱冷藏，导致引物变质降解失效。

④引物设计不合理，如引物长度不够，引物之间形成二聚体等。

Mg2+浓度：Mg2+离子浓度对PCR扩增效率影响很大，浓度过高可降低PCR 扩增的特异性，浓度过低则影响PCR扩增产量甚至使PCR扩增失败而不出扩增条带。

反应体积的改变：通常进行PCR扩增采用的体积为20ul、30ul、50ul、或100ul，应用多大体积进行PCR扩增，是根据科研和临床检测不同目的而设定，在做小体积如20ul 后，再做大体积时，一定要模索条件，否则容易失败。

物理原因：变性对PCR扩增来说相当重要，如变性温度低，变性时间短，极有可能出现假阴性;退火温度过低，可致非特异性扩增而降低特异性扩增效率，退火温度过高影响引物与模板的结合而降低PCR扩增效率。

有时还有必要用标准的温度计，检测一下扩增仪或水溶锅内的变性、退火和延伸温度，这也是PCR 失败的原因之一。

靶序列变异：如靶序列发生突变或缺失，影响引物与模板特异性结合，或因靶序列某段缺失使引物与模板失去互补序列，其PCR扩增是不会成功的。

2、假阳性
出现的PCR扩增条带与目的靶序列条带一致，有时其条带更整齐，亮度更高。

引物设计不合适：选择的扩增序列与非目的扩增序列有同源性，因而在进行PCR扩增时，扩增出的PCR产物为非目的性的序列。

靶序列太短或引物太短，容易出现假阳性。

需重新设计引物。

靶序列或扩增产物的交叉污染：这种污染有两种原因：一是整个基因组或大片段的交叉污染，导致假阳性。

这种假阳性可用以下方法解决：①操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外。

②除酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或器材均应高压消毒。

所用离心管及样进枪头等均应一次性使用。

③必要时，在加标本前，反应管和试剂用紫外线照射，以破坏存在的核酸。

二是空气中的小片段核酸污染，这些小片段比靶序列短，但有一定的同源性。

可互相拼接，与引物互补后，可扩增出PCR产物，而导致假阳性的产生，可用巢式PCR方法来减轻或消除。

3、出现非特异性扩增带
PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大或小，或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带。

非特异性条带的出现，其原因：一是引物与靶序列不完全互补、或引物聚合形成二聚体。

二是Mg2+离子浓度过高、退火温度过低，及PCR循环次数过多有关。

其次是酶的质和量，往往一些来源的酶易出现
非特异条带而另一来源的酶则不出现，酶量过多有时也会出现非特异性扩增。

其对策有：①必要时重新设计引物。

②减低酶量或调换另一来源的酶。

③降低引物量，适当增加模板量，减少循环次数。

④适当提高退火温度或采用二温度点法(93℃变性，65℃左右退火与延伸)。

4、出现片状拖带或涂抹带
PCR扩增有时出现涂抹带或片状带或地毯样带。

其原因往往由于酶量过多或酶的质量差，dNTP浓度过高，Mg2+浓度过高，退火温度过低，循环次数过多引起。

其对策有：①减少酶量，或调换另一来源的酶。

②减少dNTP的浓度。

③适当降低Mg2+浓度。

④增加模板量，减少循环次数。

酶切
（主要是针对NEB品牌的酶）
1. 单酶切
1.1一般反应体系
DNA* ≤1ug ≤2ug
10×NEB缓冲液2ul 5ul
100×BSA 0.2ul 0.5ul
内切酶0.5ul 1ul
灭菌双蒸水至20ul 至50ul
*酶切2ug以上的DNA，请根据上诉体系进行调整。

2. 双酶切
同步双酶切是一种省时省力的常用方法。

选择能让两种酶同时作用的最佳缓冲液并避免星号活性是非常重要的一步。

2.1 双酶切体系的建立
选择最大程度上保证两种酶活性的缓冲液用于双酶切。

只要其中一种酶需要添加BSA，则应在双酶切反应体系中加入BSA（BSA 不会影响任何内切酶活性）。

按推荐条件建立反应体系。

反应体系中甘油的终浓度应< 5% 以避免星号活性。

例如，50 μl 反应体系中总酶量不> 5 μl。

按推荐温度温育。

为避免星号活性不建议温育过夜做双酶切反应。

如果需要两种不同温育温度，先选择理想的反应缓冲液，加入第一种酶在适合的温度下反应，热失活第一种酶后再加入第二种酶按推荐温度温育。

在非优化反应缓冲液中反应时，根据每种酶在非最优缓冲液中的具体活性相应调整酶量和反应时间。

特殊缓冲液双酶切反应信息，请登陆及 网站利用双酶切分析软件选择合适的双酶切反应条件。

利用此在线工具可查询用两种NEB 限制性内切酶进行双酶切的建议反应条件。

双酶切注释：
只要其中一种酶需要添加BSA，则应在双酶切反应系统中加入BSA。

BSA 不会影响任何内切酶的活性。

某些内切酶的组合不能进行同步双酶切，只能采用分步法进行双酶切。

上表中这些组合以“seq”标注。

这些数据来源于1－2 小时的酶切实验。

避免过夜进行双酶切，以防止可能出现的星活性。

BsgI 需要添加SAM。

加入SAM 不会对其它酶的活性产生负面影响。

SmaI 反应温度为25℃，可以将温度提高到37℃再进行第二个酶的消化。

SmaI 在两次酶切反应之间应热失活。

高保真内切酶通过基因工程减低其星号活性，在NEBuffer 4 中活性为100%，方便双酶切。

3. 分步酶切体系的建立
分步酶切应从推荐缓冲液盐浓度低的酶开始，温育至酶切完毕。

调整缓冲液中盐浓度（用小体积浓缩盐溶液）直至满足第二种酶的要求。

加入第二种酶完成双酶切反应。

也可在第二步酶切反应前过柱纯化DNA。

限制性内切酶实验问题指南
连接
1. 实验原理
1.1 DNA的连接策略
质粒具有稳定可靠和操作简便的优点。

如果要克隆较小的DNA片段(＜10kb)且结构简单，质粒要比其它任何载体都要好。

在质粒载体上进行克隆，从原理上说是很简单的，先用限制性内切酶切割质粒DNA和目的DNA片段，然后体外使两者相连接，再用所得到重组质粒转化细菌，即可完成。

外源DNA片段和质粒载体的连接反应策略有以下几种：
（1）互补性粘性末端的连接
单一限制性内切酶或两种限制性内切酶（为同尾酶，如BamHI和BglII）分别处理载体和外源DNA，得到的粘性末端为互补性突出末端，在连接反应中外源片段和质粒载体DNA均可能发生自身环化或几个分子串连形成寡聚物，且正反两种连接方向都可能有。

为了降低载体的自身环化，使正确的连接产物数量达到最高水平，一般载体DNA和外源DNA的分子数比（浓度比）为1：3～1：10之间。

同时，为了最大限度地抑制质粒DNA的自身环化，还可将载体DNA的5’磷酸基团用碱性磷酸酯酶去掉，防止其自身环化。

而带5’端磷酸的外源DNA片段可有效地与去磷酸化的载体相连，产生一个带有两个缺口的开环分子，在转入E.coli受体菌后该种缺口可在DNA复制过程种自动修复。

（2）非互补粘性末端的连接
用两种不同的限制性内切酶进行消化可以产生带有非互补的粘性末端，这DNA重组中最容易克隆的DNA片段。

一般情况下，常用质粒载体均带有多个不同限制酶的识别序列组成的多克隆位点，因而几乎总能找到与外源DNA片段末端匹配的限制酶切位点的载体，从而将外源片段定向地克隆到载体上。

也可在PCR扩增时，在DNA片段两端人为加上不同酶切位点以便与载体相连。

该种粘性末端的连接载体DNA和外源DNA的分子数比（浓度比）通常为为1：1。

（3）平头末端的连接
是由产生平末端的限制酶或核酸外切酶消化产生，或由DNA聚合酶补平所致。

由于平端的连接效率比粘性末端要低得多，故在其连接反应中，T4 DNA连接酶的浓度和外源DNA及载体DNA浓度均要高得多。

通常还需加入低浓度的聚乙二醇（PEG 8000）以促进DNA分子凝聚成聚集体的物质以提高转化效率。

特殊情况下，外源DNA分子的末端与所用的载体末端无法相互匹配，则可以在
线状质粒载体末端或外源DNA片段末端接上合适的接头（linker）或衔接头（adapter）使其匹配，也可以有控制的使用E. coli DNA聚合酶Ⅰ的klenow大片段部分填平3’凹端，使不相匹配的末端转变为互补末端或转为平末端后再进行连接。

1.2 DNA连接酶类型
能用于连接DNA的酶有2种：大肠杆菌连接酶和大肠杆菌T4噬菌体所编码的T4-DNA连接酶。

前者的反应需要NAD+参与催化，而T4连接酶的反应则需要ATP参与催化。

最初的研究表明，大肠杆菌连接酶只能催化粘端的连接，现在发现在PEG或聚蔗糖存在的条件下，也能进行平端的连接。

相比较而言，T4-DNA连接酶并不需要PEG等的存在就能进行平端的连接，所以现在实验中绝大多数情况下使用T4-DNA连接酶。

1.3 DNA连接的影响因素
连接反应的影响因素包括温度，时间，酶量，缓冲体系，DNA末端的性质（见1.1）及浓度，DNA片段的大小等。

（1）温度与时间
连接反应的一项重要参数是温度，理论上连接反应的最佳温度是37℃，此时连接酶的活性最高。

但37℃时粘性末端分子形成的氢键配对结构极不稳定，因此人们找到了一个既可最大限度地发挥连接酶的活性，又有助于短暂配对结构稳定的最适温度即12~16℃。

一般粘性末端的连接在此温度下，反应30min即可取得较好的效果，如时间充裕的话连接过夜则更完全些，为了实验方便有时也在4℃条件下连接过夜。

而对于平头末端的连接，建议在37℃条件下连接，并且时间适当延长。

（2）酶量
酶单位的定义在宝生物工程公司提供的T4-DNA连接酶中是指在20ml的连接发应体系中，6mg的l DNA-HindIII的分解物在16℃下发应30min时，有90%以上的DNA片段进行连接的酶量为1U。

由以上的定义可知，日常连接实验中的DNA的浓度比酶量定义的状态下低很多10～20倍，所以实际酶量是过量的。

平头末端的连接酶的用量要比粘性末端连接所需酶量大10~100倍，因此厂商提供的连接酶浓度往往是高浓度的（宝生物的T4-DNA连接酶浓度350U/ml）。

故从这个意义上分析，常规的粘性末端的连接反应体系中酶量的加入往往是过量的。

（3）缓冲体系
不同公司的连接酶缓冲液大部分含有Tris-HCl（pH 7.5）提供连接所需的合适pH值。

另外在缓冲液中还有两种主要成份非常重要：DTT和ATP。

前者提供一定的还原能力，而后者能促进连接反应的有效进行。

但是在实验中缓冲液使用时的反复冻融会引起ATP的分解，从而影响连接效率。

为了保证实验的顺利进行，一般大剂量的缓冲液可以分装成小管保存并使用，另外可考虑使用一段时间的缓冲液定期更新一下。

（4）DNA浓度
DNA连接反应中建议的DNA连接浓度为0.1~1pmol/ml，，而为了降低载体分子间的环化，载体DNA的浓度不宜过高，外源DNA的投入量则依据连接类型不同投入3～10倍。

2. 在微量离心管中制备下列连接反应液。

DNA 片段* 约0.3 pmol
载体DNA** 约0.03 pmol
T4 DNA Ligase 1 μl
10×T4 DNA Ligase Buffer 2.5 μl
dH2O up to 25 μl
* DNA 片段的摩尔数应控制在载体DNA 摩尔数的3～10 倍。

（一般载体量为2μl左右，目的片段10μl左右，具体得看片段亮度）
** 平滑末端的载体与DNA 片段进行连接时，应首先将载体进行去磷酸化处理，以防止其自身环化。

3. 16℃过夜反应。

转化
感受态是指细菌处于容易吸收外源DNA的状态。

转化是指质粒DNA或以它为载体构建的重组子导人细菌的过程。

其原理是细菌处于0℃，CaCl2低渗溶液中，菌细胞膨胀成球形。

转化混合物中的DNA形成抗DNA酶的羟基—钙磷酸复合物粘附于细胞表面，经42℃短时间热击处理，促进细胞吸收DNA复合物。

将细菌放置在非选择性培养基中保温一段时间，促使在转化过程中获得的新的表型(如Amp r等)得到表达，然后将此细菌培养物涂在含有氨苄青霉素的选择性培养基上。

1. 操作方法
1.1 取50 μl冰浴上融化的感受态细胞，加入目的DNA，轻轻混匀，在冰浴中
放置30分钟。

1.2 42℃水浴中热激45秒，然后快速将管转移到冰浴中2分钟，该过程不要摇
动离心管。

1.3 向每个离心管中加入500μl 无菌的SOC 或LB 培养基（不含抗生素），
混匀后置于37℃，200 转/ 分钟培养 1 小时，使细菌复苏。

1.4 根据实验要求（质粒，重组连接产物转化），吸取不同体积已转化的感受态
细胞加到含相应抗生素的LB或SOC琼脂培养基上，将细胞均匀涂开。

也可以将已转化的感受态细胞5000r、离心10min，弃掉部分上清，留下100ul 左右上清重悬细胞，然后将其全部均匀涂到相应抗生素的培养基上。

将平板置于37℃至液体被吸收，倒置平板，37℃过夜培养。

2. 注意事项
2.1 所加入的目的DNA，连接产物一般为10~15ul，质粒为1ul左右或者用枪头
蘸一下即可，同时质粒转化可以免去步骤3，不需要复苏直接涂板培养
2.2 刚刚化冻的细胞，转化效率最高。

2.3 避免反复化冻。

2.4 避免移液枪吹吸。

2.5 整个操作过程要轻柔。

质粒
1. 简介
质粒(Plasmid)是一种染色体外的稳定遗传因子，大小从1-200kb不等，为双链、闭环的DNA分子，并以超螺旋状态存在于宿主细胞中。

质粒主要发现于细菌、放线菌和真菌细胞中，它具有自主复制和转录能力，能在子代细胞中保持恒定的拷贝数，并表达所携带的遗传信息。

质粒的复制和转录要依赖于宿主细胞编码的某些酶和蛋白质，如离开宿主细胞则不能存活，而宿主即使没有它们也可以正常存活。

质粒的存在使宿主具有一些额外的特性，如对抗生素的抗性等。

F质粒(又称F因子或性质粒)、R质粒(抗药性因子)和Col质粒(产大肠杆菌素因子)等都是常见的天然质粒。

该名词由J.莱德伯格在1952年提出的，但现在习惯上已用来专指细菌、酵母菌和放线菌等生物中染色体以外的单纯的DNA分子。

某些既能独立地存在于细胞质中又能整合在染色体上的质粒称为附加体。

2. 质粒在细胞内的复制
质粒在细胞内的复制一般有两种类型:紧密控制型(Stringent control )和松弛控制型(Relaxed control)。

前者只在细胞周期的一定阶段进行复制，当染色体不复制时，它也不能复制，通常每个细胞内只含有 1 个或几个质粒分子，如F 因子。

后者的质粒在整个细胞周期中随时可以复制，在每个细胞中有许多拷贝，一般在20个以上，如Col E1质粒。

在使用蛋白质合成抑制剂-氯霉素时，细胞内蛋白质合成、染色体DNA 复制和细胞分裂均受到抑制，紧密型质粒复制停止，而松驰型质粒继续复制，质粒拷贝数可由原来20多个扩增至1000-3000个，此时质粒DNA占总DNA的含量可由原来的2%增加至40-50%。

利用同一复制系统的不同质粒不能在同一宿主细胞中共同存在，当两种质粒同时导入同一细胞时，它们在复制及随后分配到子细胞的过程中彼此竞争，在一些细胞中，一种质粒占优势，而在另一些细胞中另一种质粒却占上风。

当细胞生长几代后，占少数的质粒将会丢失，因而在细胞后代中只有两种质粒的一种，这种现象称质粒的不相容性(Incompatibility)。

但利用不同复制系统的质粒则可以稳定地共存于同一宿主细胞中。

质粒通常含有编码某些酶的基因，其表型包括对抗生素的抗性，产生某些抗生素，降解复杂有机物，产生大肠杆菌素和肠毒素及某些限制
性内切酶与修饰酶等。

3. 质粒载体
把一个有用的目的DNA片段通过重组DNA技术，送进受体细胞中去进行繁殖和表达的工具叫载体(Vector)。

细菌质粒是重组DNA 技术中常用的载体。

质粒载体是在天然质粒的基础上为适应实验室操作而进行人工构建的。

与天然质粒相比，质粒载体通常带有一个或一个以上的选择性标记基因(如抗生素抗性基因)和一个人工合成的含有多个限制性内切酶识别位点的多克隆位点序列，并去掉了大部分非必需序列，使分子量尽可能减少，以便于基因工程操作。

大多质粒载体带有一些多用途的辅助序列，这些用途包括通过组织化学方法肉眼鉴定重组克隆、产生用于序列测定的单链DNA、体外转录外源DNA序列、鉴定片段的插入方向、外源基因的大量表达等。

一个理想的克隆载体大致应有下列一些特性：（1）分子量小、多拷贝、松驰控制型；（2）具有多种常用的限制性内切酶的单切点；（3）能插入较大的外源DNA片段；（4）具有容易操作的检测表型。

常用的质粒载体大小一般在1kb至10kb之间，如PBR322、PUC系列、PGEM系列和pBluescript（简称pBS）等。

4. 从细菌中分离质粒DNA
从细菌中分离质粒DNA的方法都包括3个基本步骤：培养细菌使质粒扩增；收集和裂解细胞；分离和纯化质粒DNA。

采用溶菌酶可以破坏菌体细胞壁，十二烷基磺酸钠(SDS)和TritonX-100可使细胞膜裂解。

经溶菌酶和SDS或Triton X-100处理后，细菌染色体DNA会缠绕附着在细胞碎片上，同时由于细菌染色体DNA比质粒大得多，易受机械力和核酸酶等的作用而被切断成不同大小的线性片段。

当用强热或酸、碱处理时，细菌的线性染色体DNA变性，而共价闭合环状DNA(Covalently closed circularDNA，简称cccDNA)的两条链不会相互分开，当外界条件恢复正常时，线状染色体DNA片段难以复性，而是与变性的蛋白质和细胞碎片缠绕在一起，而质粒DNA双链又恢复原状，重新形成天然的超螺旋分子，并以溶解状态存在于液相中。

在细菌细胞内，共价闭环质粒以超螺旋形式存在。

在提取质粒过
程中，除了超螺旋DNA外，还会产生其它形式的质粒DNA。

如果质粒DNA 两条链中有一条链发生一处或多处断裂，分子就能旋转而消除链的张力，形成松驰型的环状分子，称开环DNA(Open circularDNA，简称ocDNA)；如果质粒DNA的两条链在同一处断裂，则形成线状DNA(LinearDNA)。

当提取的质粒DNA电泳时，同一质粒DNA其超螺旋形式的泳动速度要比开环和线状分子的泳动速度快。

5. 质粒小提步骤
5.1 将带有质粒的E.col i接种于5m1 LB/抗生素培养液中（一般4ml即可：
3ml小提，1ml保菌），370C摇床培养12~16 h;
5.2 取1.0~5.0ml的菌液（一般3ml即可），室温10000×g离心lmin收集细
菌。

5.3 倒弃培养基。

加入250u1 Solution I/RNaseA混和液，漩涡振荡或者移
液枪吹打使细胞完全悬浮。

5.4 往重悬混和液中加入250u1 Solution II，轻轻颠倒混匀4-6次。

此操作
避免剧烈混匀裂解液且裂解反应不要超过5 min。

5.5 加入350ul Solution III，温和颠倒数次至形成白色絮状沉淀。

5.6 室温下，≥10000×g离心10min。

5.7 转移上清液至套有2m1收集管的HiBind DNA结合柱中，室温下，
10000×g离心lmin，倒去收集管中的滤液。

5.8 把柱子重新装回收集管，加入500ul HB Buffer，按上述条件离心，弃
去滤液。

5.9 把柱子重新装回收集管，加入700ul DNA Wash Buffer，按上述条件离
心，弃去滤液。

注意:浓缩的DNA Wash Buffer在使用之前必须按标签的提示用无水乙醇稀释。

5.10 弃去滤液，重复第9步骤一次。

5.11 弃去滤液，把柱子重新装回收集管，10000×g离心空柱2min以甩干
柱子基质。

注意:不要忽略此步——这对去除柱子中残留的乙醇至关重要。

5.12 把柱子装在干净的1.5m1离心管上，加入30-50u1 Elution Buffer到柱
子基质中，静置1~2min，10000×g离心lmin洗脱出DNA。

6. 质粒大提步骤
我们课题组的大提试剂盒有两种：TIANGEN和QIGEN，具体操作步骤参见试剂盒说明书。