质粒载体的构建

三、感受态大肠杆菌的制备。 这里建议按照分子克隆的 CaCl 方法进行制备（书上已经详细列出了步骤，菜鸟也能做的）。 感受态的好坏关系到转化效率，因此要认真对待。不过貌似也不是很难。 保存要在－80 度保存，也有某位仁兄告诉我 4 度放一放效果更好，没有试过，书上都是－ 80 度的。当然，放的太久转化效率会随时间而减弱。 如果有钱的同学就不需要费那么多功夫了，直接买就是了。本人是买 TAKARA 的，300 大 洋，10 支。
四、连接 很多公司都有快速连接试剂盒和普通试剂盒。一般都是 16 度数个小时或者过夜，或者 4 度 过夜，不一而同。曾在园子里看到一个高人的文章，认为是时间越长越好，甚至建议 4 度放 几天，我没有试过。16 度可以用 PCR 仪创造，或者找一个泡沫盒，加上冰，水搞到 15 度 左右，放入 4 度冰箱即可。我用的 TAKARA 的快速连接试剂盒，4 度过夜。 菜鸟体贴提示： 1、 通过电泳，粗略判定质粒和 DNA 的浓度比例。一般加入连接液的 DNA:质粒＝9：1 2、 放入质粒和 DNA 的总量要适当，不可超过说明书，宁少不要多。
质粒载体的构建－菜鸟入门手册
dongkey 制作
本人刚刚完成质粒载体的构建，总结了一下，以方便要做这方面的菜鸟同学借鉴一下，希望 老鸟同学批评指教。 一、确定插入的基因片段。 首先要确定自己要插入载体中的基因片段，比如要做蛋白表达和功能，可以选择 CDS 区进 行插入。然后自然是如何得到这段基因片段的问题了。最常见的是 PCR 解决了。那么就涉 及到引物的设计。插入 CDS 基因片段的例子：找到 CDS，根据 CDS 设计全长引物，然后 加上内切酶的碱基片段（这要根据自己手头上有的质粒的内切酶位点来决定了），注意，前 面要加上保护碱基！然后进行 PCR。 PCR 后要跑电泳确定目的基因的长度是正确的。 用乙醇沉淀法纯化 PCR 产物（具体见分子克隆一书） 菜鸟体贴提示：要在质粒上找到两个最好不是连续在一起的内切酶，然后分别添加在两条引 物的 5‘端，当然内切酶的温度最好是一致的，而且可以能够同时切开的（双酶切）。这可 以在试剂公司的限制性内切酶的列表上找到有没有共同的 BUFFER 及其双酶切时的活性如 何（当然是越大越好了）。内切酶的公司一般可以找 NEB, TAKARA, TOYOBO 等公司，本 人用的是 TAKARA。 二、酶切 将质粒和基因片段分别进行酶切。最省事的是同时双酶切了。一般酶切温度都是 37 度。 菜鸟体贴提示： 1、 确定质粒和基因片段的量！！（宁少不多），根据说明书加样，一般是 DNA＋BUFFER＋
加内切酶。注意 BUFFER 的比例，有的是 1×，有的是 1.5×。 2、 确定内切的时间。这是比较讨厌的环节。切的时间不能短，也不能太长。最好是做一个
梯度。注意，说明书的内切时间不一定就是标准的！！（本人经验是可以稍微切的时间长 一点，也不用短了） 3、 确定酶切成功了。 对于质粒，可以将空质粒和切开的质粒同时电泳跑，对比一下就知道了 对于目的基因，很难，因为切开的是几个碱基而已，不过一般如果质粒切开，目的基因 应该也会被切开的。 酶切完成后，有两种方法回收 1、 电泳跑胶回收 2、 不跑胶，直接用纯化试剂盒回收。 根据 N 多种理论，很多人建议用第一种方法较好。理由这里就不罗列了。
五、转化 按照分子克隆的步骤来。 如果是买公司的感受态，根据公司的说明书。 菜鸟提示： 1、复苏的时间一定要掌握好，还有是装感受态的管子要薄，以有利于温度的传导。一般用 恒温水浴。 2、涂抹在培养皿上的时候，可以做一个梯度，200ul，300ul，400ul，一定要晾干。
六、确定测序的克隆。 一般在培养皿上挑 10－30 个左右的单克隆。加入培养液（含抗生素）过夜培养，后用 2ul 的培养液，加上步骤一的引物，进行 PCR，电泳，看有没有目的基因的条带。 然后将有条带的培养液提取质粒，双酶切，电泳看看有没有目的基因的条带。如果有的话， 可以送去测序了。 菜鸟提示： 1、 可以绕过 PCR 直接提取质粒酶切（如果挑的克隆太多的话，建议还是先 PCR 以缩小范
围）。 2、 如果目的基因较小的话（如 100－300bp），那么酶切后电泳加样要尽量多一点，因为切
下来的目的基因的亮度对比质粒的亮度是 100－330/数千 bp 分之一。
七、测序结果的分析 可以使用多种软件。这里不罗列了。 菜鸟方法：一般公司发回来的有记事本或者 WORD 的排列好测序结果的序列。将它们复制 到一个新的 WORD 文档中，调整好格式，如全部大写，没有空格，没有回车符号等。然后， 将目的基因全长 COPY，使用查找功能，看是否全符合。