重组质粒的构建经验 [技巧]
同源重组构建质粒原理及方法
同源重组构建质粒原理及方法一、引言同源重组构建质粒是基因工程领域的关键技术，它通过将外源基因片段与适当的质粒DNA相连接，实现外源基因的表达和遗传转移。
本文将详细介绍同源重组构建质粒的原理和方法，以及常用的实验步骤和注意事项。
二、原理同源重组构建质粒的原理是通过内切酶在两个同源DNA片段上切割，然后连接起来形成一个新的质粒DNA。
同源DNA片段通常由外源基因和质粒DNA提供，通过互补的粘性末端序列将它们连接起来。
三、方法以下是同源重组构建质粒常用的方法和步骤：1. 选择合适的质粒和酶切位点首先，需要选择一个适合的质粒，根据实验需要选择带有合适酶切位点的质粒。
同时，还需要选择适合的内切酶用于切割质粒和外源基因片段。
2. 切割质粒和外源基因片段将选择好的质粒和外源基因片段与相应的内切酶一起反应，将其切割为互补的粘性末端序列。
切割后的质粒和外源基因片段会留下粘性末端。
3. 进行连接反应将切割好的质粒和外源基因片段加入连接反应中，可以使用DNA连接酶来催化连接。
4. 转化宿主细胞将连接好的质粒转化到宿主细胞中，常用的方法有热擦法、电穿孔法和化学法等。
宿主细胞可以是大肠杆菌等常用的实验宿主细胞。
5. 筛选转化子将转化到宿主细胞中的质粒进行筛选，可以通过选择性培养基或进行基因标记（如荧光蛋白等）来筛选转化子。
四、注意事项在同源重组构建质粒过程中，需要注意以下事项：1. 同源重组效率同源重组的效率是影响质粒构建成功率的关键因素。
需要合理选择酶切位点，确保质粒和外源基因片段有足够的同源性。
2. DNA连接酶的选择DNA连接酶的选择也是非常重要的。
不同的DNA连接酶在连接效率和酶切位点的要求上有所区别，选择适合的连接酶能提高连接效率。
3. 转化宿主细胞选择转化宿主细胞的选择也会影响质粒构建的成功率。
不同的宿主细胞对质粒的转化效率和表达能力有所不同，需要根据实验要求选择合适的宿主细胞。
4. 合理设计实验对照组为确保实验结果的可靠性和准确性，需要设计适当的对照组，验证质粒构建的成功性和外源基因的表达情况。
重组质粒的构建
重组质粒的构建重组质粒的构建是基因工程的核心步骤之一，其目的是将目的基因插入到质粒载体中，以实现目的基因的稳定表达和克隆化。
以下是重组质粒构建的主要步骤：1.目的基因获取首先需要获取目的基因。
目的基因可以从基因文库、PCR、基因组测序等方法中获取。
根据需要选择合适的方法，将目的基因克隆到质粒载体中。
2.载体质粒选择选择适合的质粒载体是重组质粒构建的关键步骤之一。
根据目的基因的特点和表达要求，选择适合的质粒载体。
常见的质粒载体有pET、pUC、pBluescript等。
3.限制性酶切限制性酶切是重组质粒构建的重要步骤之一。
通过限制性酶切，将目的基因和质粒载体分别切开，露出粘性末端，以便于连接反应。
4.连接反应将切好的目的基因和质粒载体的粘性末端连接在一起，形成重组质粒。
连接反应需要使用T4DNA连接酶或其它连接酶进行催化。
连接反应需要在适宜的温度和pH 条件下进行一定时间，以确保重组质粒的正确构建。
5.转化宿主细胞将连接反应得到的重组质粒转化到宿主细胞中。
常见的宿主细胞有细菌、酵母、昆虫等。
转化方法有多种，如电穿孔法、化学转化法等。
转化后需要在适宜的培养条件下进行培养，以获得大量的重组质粒。
6.克隆筛选克隆筛选是重组质粒构建的重要步骤之一。
通过克隆筛选，可以确定重组质粒是否正确构建。
常见的克隆筛选方法有蓝白斑筛选、酶切法等。
7.序列验证最后需要对重组质粒进行序列验证，以确保目的基因的正确插入和序列的准确性。
序列验证可以通过Sanger测序等方法进行。
构建重组质粒基本方法
构建重组质粒基本方法1.cDNA编码区片段的PCR扩增50ul ×2模版 15‘引物 13‘引物 1dNTP 110×buffer 5Taq 1Milliq H2O 402．PCR产物纯化1、加5倍体积的PB2、将Spin柱放于2ml收集管上3、加样液，14Krpm，离心1min4、弃去排出液5、加0.75ml PE, 14Krpm，离心1min6、弃去排出液,14Krpm,离心1min7、将Spin柱放在洁净1.5ml的Epp管中O),静置2min, 14Krpm，8、往Spin柱的膜中央加入50μl的EB(或milliq H2离心1min3．双酶切载体和PCR产物分别用一下条件进行双酶切（反应体系均为30ul，37℃，酶切n4．双酶切后的载体用试剂盒割胶回收1.割胶并称重，加3倍体积的QG（胶块每100mg约合100μl的体积）2.50℃，恒温10min，等到胶完全被溶解3.将一个Spin柱放在一个2ml的收集管中4.加样液，14Krpm，离心1min5.弃去排出液6.加0.75ml PE, 14Krpm，离心1min7.弃去排出液,14Krpm,离心1min8.将Spin柱放在洁净1.5ml的Epp管中9.往Spin柱的膜中央加入50μl的EB(或milliq HO),静置2min, 14Krpm，2离心1min5．连接上述双酶切产物经过纯化（其中载体酶切产物割胶回收，PCR片段酶切后纯化步骤与上述PCR产物纯化步骤相同），在T4 DNA连接酶作用下16℃连接过夜。
连接体系如下：载体 2ulPCR 片段 6ul10xT4 buffer 1ulT4 DNA ligase 1ul6．转化取上述连接液5μl转化到预先制备的DH5α化学感受态细胞中，冰浴30分钟，42℃热激2min,置冰上5min，加入1mlLB培养液37℃摇床45min，离心5000rpm，1-5min（不要离心太久，以免太实），最后均匀涂布在含有100 ng/ml 抗生素的LB平板上（100-150 ul）。
重组质粒构建注意事项
重组质粒构建注意事项重组质粒构建是现代生物学中常用的技术手段，其能够利用DNA重组技术将感兴趣的基因片段插入到质粒中，从而探究基因的功能、调控及其在生物体中的作用。
下面是重组质粒构建中需要注意的一些关键问题。
1.选择合适的质粒载体：质粒是一种能够自主复制的小型DNA分子，其可以含有多个对基因表达有重要影响的元件，如启动子、终止子、选择性标记基因等。
因此，选择合适的质粒载体对于重组质粒构建至关重要。
一般而言，常用的质粒载体有pUC19、pBR322、pBluescript等，根据实验需要选择适合的质粒载体。
2.选择合适的限制性内切酶：限制性内切酶是能够识别特定的DNA序列并具有切割作用的酶。
在重组质粒构建中，常需要利用限制性内切酶切割质粒载体和目标基因片段的DNA，从而产生互补的粘性末端，便于二者连接。
因此，选择适合的限制性内切酶对于重组质粒的构建是非常重要的。
3.设计合适的引物：引物是在PCR扩增反应中用于识别目标DNA序列的短小DNA片段。
在重组质粒构建中，利用引物扩增目标基因片段是必不可少的步骤。
因此，设计合适的引物非常重要。
引物应具有良好的特异性，能够特异性地扩增目标基因片段，并且不会与质粒载体序列发生非特异性扩增。
此外，引物还可以设计一些限制性内切酶切割位点，以便于后续的连接工作。
4.进行寡核苷酸连接反应：连接反应是指将质粒载体和目标基因片段进行连接的步骤。
常用的方法有T4 DNA连接酶的连接反应和PCR引物连接法。
在连接反应中，需要注意合适的反应条件，例如连接反应的时间、反应体系的pH值、温度等，对连接效果有重要影响。
5.转化宿主细胞：转化是指将重组质粒导入宿主细胞中。
在进行转化实验时，需要注意选择合适的宿主细胞，例如大肠杆菌（E. coli）等，以及适当的培养基、适宜的温度和容器。
此外，还需要注意进行适当的筛选压力，如在含有选择性抗生素的培养基中进行培养，筛选能够稳定带有重组质粒的转化子。
重组质粒的构建
连接酶催化DNA连接的最佳反应温度是37℃
▪ DNA重组技术中的核心是DNA片段之间的体外连接方案
DNA连接酶及连接机制
1 ） ATP 通 过 磷 酸 基 团 与 T4 DNA连接酶中的亮氨酸形成 磷酸-氨基键，从而形成酶ATP复合物；
限制性内切酶
具备多个限制酶的 识别位点（多克隆位 点） ，以便外源DNA的 插入与截取。
多种酶切口 单一酶切口 多克隆位点
或具备特异的重组 位点
11
载体的选择与改造应具备的条件
3.具有合适的筛选标记
具有遗传表型或筛选 标记，以区别阳性重组分子 和阴性重组分子，主要有抗 药性基因、酶基因、营养缺 陷型及形成噬菌斑的能力等。
二、基础知识
2. 重组DNA技术的基本过程
（1）目的基因的获得 （2）载体的选择与制备 （3）目的基因与载体的结合（DNA分子的体外连接） （4）重组DNA导入受体 （5）重组体筛选和鉴定 （6）目的基因表达 （7）基因产物的分离纯化
DNA重组操作过程
ab
剪切
载体
重组
B
引入宿 主细胞
Ab
抗性筛选
T载体
▪ 一般采用的方法是先把载体用某种限制性内切酶消化成平 头，再在70℃或72℃下在只加入dTTP的反应体系中用Taq DNA聚合酶处理半小时（也有人报道处理1～2小时能提高克隆效 率，这样加T反应会更彻底）。也可以用末端转移酶来完成加T 反应。载体自连、PCR产物串连可以忽略。
▪ 如果使用ddTTP，效果会更好。
实验二 重组质粒的构建
一、实验目的
▪通过本实验学会琼脂糖凝胶DNA回收和重组 DNA连接的方法。
两大方法帮你搞定质粒构建
两大方法帮你搞定质粒构建质粒构建是分子生物学研究中最常用的实验技术。
原理依赖于限制性核酸内切酶，DNA 连接酶和其他修饰酶的作用，分别对目的基因和载体 DNA 进行适当切割和修饰后，将二者连接在一起，再导入宿主细胞，实现目的基因在宿主细胞内的正确表达。
质粒构建方式多样，常规的 T4 连接酶，以及最近更受欢迎的重组酶方式。
下面小编就总结一下 T4 连接酶与重组酶构建质粒方法，通过比较，其最大的不同点可能在于目的基因的设计以及连接体系。
壹一. T4 DNA Ligase 即 T4 DNA 连接酶，可以催化粘端或平端双链 DNA 或 RNA 的5’-P 末端和3’-OH 末端之间以磷酸二酯键结合，该催化反应需 ATP 作为辅助因子。
1. 质粒载体的制备既可以选择单酶切也可以选择双酶切，一般推荐使用双酶切。
其实目的就只有一个，尽量使载体的末端具有特异性，防止自连。
[可选酶切体系]VECTOR 3 ugCutSmart Buffer 5 ul限制性内切酶 1 1 ul限制性内切酶 2 1 ul酶切体系一般选择 50ul，试剂加好之后37°C 孵育 6~8 小时，或适当延长时间，保证质粒酶切完全。
每隔一段时间振荡一下并离心以防液滴蒸发至管盖上。
酶切后载体通过切胶回收线性化载体。
2.根据目的序列构建引物后，引物设计原则简单总结一下:（1）前向引物：5’ 端-保护碱基序列+限制性内切酶 1 酶切位点序列+基因正向引物序列 -3’ 端（2）反向引物：5’ 端-保护碱基序列+限制性内切酶 2 酶切位点序列+基因反向引物序列 -3 ’端如果目的基因片段较长的话，可以选择 PCR 方式扩增目的基因片段[可选 PCR 扩增体系]ddH2O：14ul10xTaq buffer：2ul10um DNTP：1ul10um primer F：0.5ul10um primer R：0.5ul模板 DNA：1ulTaq 酶：1ul[可选 PCR 扩增条件](1)95℃：5min(2) 35cycle95℃：30s55℃：30s（退火温度可以根据目的引物TM值决定，一般退火温度根据引物TM值降低5度）72℃：40s(3)72℃：10min(4)16℃：hold引物扩增之后，首先要进行琼脂糖凝胶电泳验证条带大小，然后通过胶回收，获得纯化目的片段产物.由于加入保护碱基，回收产物需要进行双酶切，双酶切方法与质粒酶切方法相同。
构建重组质粒基本方法
构建重组质粒基本方法重组质粒是一种重要的遗传工程工具，用于将外源基因导入到宿主细胞中，从而实现特定基因的表达与功能研究。
构建重组质粒的基本方法可以概括为：选择质粒骨架、引物设计与合成、PCR扩增外源基因片段、DNA连接与重组、质粒扩增与提取、质粒鉴定与筛选，以下分别进行详细介绍。
一、选择质粒骨架在构建重组质粒时，首先需要选择一个合适的质粒骨架。
质粒骨架是指一个可复制的质粒DNA分子，常见的质粒骨架有pUC、pBR322、pET等。
质粒骨架上通常包含有宿主细胞可以识别的起始子和起始子附近的终止子，用于启动和终止转录过程，同时还包含选择标记基因，如抗生素抗性基因，以及其他在分子克隆中常用的诸如多克隆位点、限制酶切位点等。
二、引物设计与合成在构建重组质粒时，需要利用引物来扩增并克隆外源基因片段。
引物一般是两条DNA可控引物，其中一条是正向引物，另一条是反向引物。
引物的设计需要注意以下几点：引物的长度通常为15-30个碱基对，引物应该具有合适的Tm值，并且在引物双链的末端至少有2个碱基对是纯G或纯C。
引物可以使用商业引物合成公司合成。
三、PCR扩增外源基因片段使用引物扩增外源基因片段是构建重组质粒的一个关键步骤。
PCR反应一般包括DNA模板、引物、dNTPs和DNA聚合酶。
根据需要，可以使用特异性引物对目标基因进行PCR扩增，然后通过凝胶电泳检查PCR产物长度和纯度，并使用PCR产物进行下一步处理。
四、DNA连接与重组将PCR扩增得到的外源基因片段与质粒骨架进行连接和重组。
连接通常通过使用限制酶切和连接酶来实现。
限制酶切是利用限制酶切剪切DNA，生成具有互补粘性末端的DNA片段，然后将外源基因片段与质粒骨架进行连接。
连接酶可以使DNA片段之间的末端骨架参与phosphodiester结合反应，从而形成连体分子。
五、质粒扩增与提取将重组质粒转化到宿主细胞中，通过培养和培养基筛选来扩增质粒。
质粒扩增一般在含有抗生素的琼脂糖平板上进行，抗生素可以选择对宿主细胞有毒作用但不对重组质粒有毒的抗生素。
原核表达重组质粒pUC57-CTP-PTEN的构建及鉴定
原核表达重组质粒pUC57-CTP-PTEN的构建及鉴定
质粒是一种常见的DNA分子，在分子生物学研究中被广泛应用。
本文旨在介绍如何构建和鉴定一种基于原核表达重组质粒pUC57-CTP-PTEN。
1. 构建方法
该质粒的构建主要包含四个步骤：
1）设计引物。
设计包含目标肽段的引物用于PCR扩增。
2）PCR扩增。
使用目标肽段的DNA模板，利用引物进行PCR扩增，生成包含目标肽段的DNA片段。
3）连接。
将PCR扩增产物与pUC57-CTP质粒进行连接，得到重组质粒pUC57-CTP-PTEN。
4）转化。
使用化学方法将重组质粒转化到大肠杆菌中。
2. 鉴定方法
接下来需要对重组质粒进行鉴定，主要包括以下几个方面：
1）限制性内切酶切割。
使用限制性内切酶对重组质粒进行酶切，验证重组质粒的存在。
2）PCR鉴定。
利用引物对重组质粒进行PCR扩增，验证重组质粒中是否包含目标肽段。
3）测序验证。
将重组质粒进行测序，验证其序列与设计的目标序列是否一致。
4）原核表达验证。
利用质粒进行原核表达，检验目标肽段是否得到表达。
以上鉴定结果均符合预期，表明成功构建了基于原核表达重组质粒pUC57-CTP-PTEN。
该质粒在分子生物学以及其他领域中具有较广泛的应用前景。
重组表达质粒的构建
重组表达质粒的构建重组表达质粒的构建1．原核表达载体选择质粒载体是重组蛋⽩表达的关键⼯具，其结构如下图。
重组蛋⽩表达，我们⾸先要将基因插⼊到表达载体上，插⼊的位置为多克隆位点。
质粒载体上有很多的功能元件，这些元件对于蛋⽩的表达都是⾄关重要的。
尽管我们经过系统的分析和预测，但是仍有很多蛋⽩不能顺利表达、表达量很低或者表达状态不好。
这个时候我们需要尝试构建不同的表达载体以期得到最好的效果，这些载体的主要区别是启动⼦和融合标签的差异。
蛋⽩表达优化主要⼯作也就是尝试构建不同融合表达标签，使⽤不同的宿主表达菌，测试不同的表达条件，筛选出最优表达体系。
常⽤的融合标签有GST、MBP、Trx、6His、SUMO等，这些标签主要功能是促表达、促可溶、信号标记或助纯化。
福因德⽣物可以提供以下系列载体以供科研表达研究。
我们选择表达载体的时候不但要考虑蛋⽩怎么表达成功，更要考虑蛋⽩怎么纯化出来，纯化的问题主要是考虑纯化标签和酶切位点的选择，下表我们列举了常见的纯化标签和酶切位点。
以上为原核表达常⽤的标签和酶切位点,其性质也都作了简要的介绍，各专业⽹站或专业书籍已对此做详尽解释，科研⼯作者可根据具体实验设计⽅案，组合设计以上标签和酶切位点的使⽤。
特别值得注意的是，选⽤和设计蛋⽩酶切位点的时候⾸要考虑的是序列内部有没有蛋⽩酶位点，同时要考虑酶切的效率和蛋⽩酶试剂成本。
⼀般商业化载体，在标签蛋⽩与载体多克隆位点之间都设计有酶切位点。
标签可设计在N-端也可在C-端,设计在N-端的优势是,可通过标签⾼效翻译起始位点带动插⼊蛋⽩的表达,可溶性标签的⾼效表达更可促进蛋⽩的可溶性表达;同时,⼤部分的蛋⽩内切酶的切割位点在C-端,所以标签设计在N-端可将标签切割完全。
在设计标签序列与酶切位点的时候还要考虑N-端稳定性原则，也就是所谓宿主细胞的N-端规则（N-end rule）,这个要避免；同时，还应该检查是否引⼊了可与别的蛋⽩相互作⽤的序列或者蛋⽩酶切位点。
重组质粒的构建
重组质粒的构建[实验原理]外源DNA与载体分子的连接就是DNA重组，这样重新组合的DNA叫做重组体或重组子。
重组的DNA分子是在DNA连接酶的作用下，有Mg2+、ATP存在的连接缓冲系统中，将分别经酶切的载体分子与外源DNA分子进行连接。
DNA连接酶有两种：T4噬菌体DNA连接酶和大肠杆菌DNA连接酶。
两种DNA连接酶都有将两个带有相同粘性末端的DNA分子连在一起的功能，而且T4噬菌体DNA连接酶还有—种大肠杆菌连接酶没有的特性，即能使两个平末端的双链DNA分子连接起来。
但这种连接的效率比粘性末端的连接效率低，一般可通过提高T4噬菌体DNA连接酶浓度或增加DNA浓度来提高平末端的连接效率。
T4噬菌体DNA连接酶催化DNA连接反应分为3步：首先，T4DNA连接酶与辅助因子ATP形成酶—AMP复合物；然后，酶—AMP复合物再结合到具有5’磷酸基和3’羟基切口的DNA上，使DNA腺苷化；最后产生一个新的磷酸二酯键，把切口封起来。
DNA重组的方法主要有粘端连接法和平端连接法，为了防止载体本身的自连，可以通过(牛小肠碱性磷酸酶)CIP处理克服。
连接反应的温度在37℃时有利于连接酶的活性。
但是在这个温度下，粘性末端的氢键结合是不稳定的。
因此人们找到了一个折中温度，即12-16℃，连接12-16h(过夜)，这样既可最大限度地发挥连接酶的活性，又兼顾到短暂配对结构的稳定。
[仪器、材料与试剂]恒温摇床、紫外线透射仪、移液枪、pH计、电泳槽、T4DNA连接酶、T 4DNA连接酶缓冲液、载体、目的DNA片段[实验步骤]1、在微型离心管中混合以下试剂：试剂体积（uL）目的DNA 4载体分子1T4DNA连接酶及缓冲液52、混合液于16℃保温2-4h或过夜，取2uL做电泳检查，鉴定反应连接产物，做完DNA重组后，暂放冰箱保存，迅速做转化实验。
初一生物重组质粒的构建过程
初一生物重组质粒的构建过程在初一的生物学课程中，学生们将学习到生物重组质粒的构建过程。
生物重组质粒是一种重要的实验技术，被广泛应用于基因工程领域。
下面我们将详细介绍重组质粒的构建过程及其应用。
一、重组质粒的定义和价值重组质粒是由自然或人工合成的DNA片段通过体外重组技术构建而成的环状DNA分子。
它通常由两部分组成：载体DNA和插入DNA。
其中，载体DNA是一个可自主复制的DNA分子，插入DNA则是我们所关注的具有特定基因片段的DNA。
通过重组质粒的构建，我们可以将特定的基因片段导入到载体DNA中，使其能够在细胞中稳定复制。
这为我们的研究提供了一个有效的工具，可以用于分析和研究目标基因的功能以及其在生物体内的表达等方面。
二、重组质粒构建的基本步骤1. 选择适当的载体DNA在构建重组质粒之前，我们首先需要选择适当的载体DNA。
常用的载体包括质粒、噬菌体和人工合成的DNA片段等。
选择载体时需要考虑到其大小、复制能力、稳定性以及对细胞的适应性等因素。
2. 获得目标基因的DNA片段接下来，我们需要获得目标基因的DNA片段。
这可以通过PCR扩增、限制酶切或人工合成等方法来获取。
获得DNA片段后，我们需要进行酶切反应，将其制备成具有粘性末端的DNA片段。
3. 连接载体与目标基因片段连接过程中，我们使用DNA连接酶来将载体DNA和目标基因片段进行连接。
DNA连接酶具有连接末端的能力，可以将两条DNA片段通过磷酸二酯键连接起来形成一个完整的环状DNA分子。
连接完成后，我们需要进行酶切鉴定以确认连接的有效性。
4. 转化重组质粒最后一步是将重组质粒导入到宿主细胞中。
这一过程被称为质粒转化。
转化可以通过热冲击、电穿孔或利用嗜热菌的特殊性质等方法来实现。
转化完成后，我们还需要将细胞进行培养和筛选，以获得含有重组质粒的目标细胞。
三、重组质粒的应用重组质粒的构建为我们的研究提供了一个强有力的工具。
它在基因工程领域的应用非常广泛，并取得了许多重要的成果。
重组质粒的构建
重组质粒的构建实验流程—质粒构建实验操作一、LB培养基配置LB培养基用于一般细菌培养，特别用于分子生物学试验中大肠杆菌的保存和培养。
其中蛋白胨、酵母膏粉提供氮源、维生素和生长因子，NaCl维持均衡的渗透压，葡萄糖提供碳源，琼脂是培养基的凝固剂。
【试剂】胰蛋白胨（Tryptone）、酵母提取物（Yeast Extract）、NaCl、琼脂（Agar）【实验步骤】1、LB固体培养基配方（配置100ml培养基）胰蛋白胨（Tryptone） 1g酵母提取物（Yeast Extract）0.5gNaCl 1g琼脂（Agar）1.5g单蒸水100ml蛋白胨很易吸潮，在称取时动作要迅速，另外，称药品时严防药品混杂，一把药匙用于一种药品、或在称取一种药品后，洗净、擦干，再称取另一种药品，瓶盖也不要盖错。
2、液体培养基除不加琼脂外，其余同固体培养基一样。
3、包扎用报纸封住瓶口，再用皮筋捆扎好，用记号笔注明培养基名称、组别、日期。
4、灭菌将上述培养基以1.05kg/cm2、121.3℃、20min高压蒸汽灭菌。
如因特殊情况不能及时灭菌，则应放入4℃冰箱内暂存。
灭菌后，将锥形瓶放入烘箱烘干，烘干后，4℃保存。
5、LB固体培养基倒板○1配置：如上述配方配置100ml的LB固体培养基。
○2抗生素的加入：将凝固的培养基放入微波炉内加热至完全融化，然后置于55℃的水浴中，待培养基温度降至55℃时（手可触摸）加入抗生素，以免温度过高导致抗生素失效，并充分摇匀。
○3倒板：一般10ml倒1个板子，培养基倒入培养皿后，打开盖子，在紫外下照10—15min。
○4保存:将培养皿倒置放于4℃保存，一个月内使用。
二、质粒的提取（protocol）1、大肠杆菌的培养：从平板培养基上挑选单菌落接种至5ml的含有抗生素的LB液体培养基中，37℃过夜培养。
【注：培养液不宜过量，过量时会因菌量太大而溶菌不充分，纯化时会影响质粒的纯度。
】2、5ml菌液倒入5ml离心管中，10,000xg，1min离心，弃上清。
重组质粒的构建
重组质粒构建生物学——屠仁军(新浪) 一、载体与外源片段（PCR产物）的双酶切为了保证做连接反应时有足够的外源DNA片段，应该加入1ug的DNA进行酶切反应；两种酶分别加1ul，10×buffer 2ul，1ug的DNA，加水至20ul。
（因此要跑胶分析DNA以及载体的浓度，取1-2ul，电泳检测其含量。
1ul体积太少，可以将其稀释在9ul水中，再加loading buffer。
6ul 15000bp的marker，2500bp条带的亮度约是100ng DNA。
可对比marker的亮度算出酶切回收的DNA的浓度，以便于确定连接反应时的用量。
Image J软件可以做灰度分析。
）双酶切反应结束后，使用PCR cleanup试剂盒回收DNA与载体。
回收完之后用同样的方法分析其浓度。
（也可以用分光光度计直接测量DNA的浓度，但是，一般酶切反应之后其浓度会比较小，取1ul 稀释100倍之后浓度很低，可能已经低于仪器的测量围，而电泳灵敏度很高，还可一排除杂带、RNA、蛋白质等对浓度的干扰。
）二、连接反应载体100ng，DNA片段根据大小，1ul buffer，1ul T4连接酶，加水至10ul；16℃连接12-16h。
载体（约0.03pmol）与外源DNA的摩尔比大约1：3-1：10之间，根据载体与DNA片段的长度，可算出需要的量。
因为载体的大小一般在5kb-10kb，因此，严格的算出0.03pmol的载体的质量意义不大，大约100ng即可。
如果时间比较紧，可以25℃连接15min，之后可取5ul进行转化，剩余5ul于16℃继续连接。
三、质粒转化到感受态大肠杆菌中从-70℃中取出感受态，指尖轻转融化后立即插入冰上，5ul连接产物+100ul感受态大肠杆菌，充分混匀后冰浴30min，然后42°热激90s，热激时不要晃动EP管。
然后立即插入冰上，静置2min。
（连接产物的量尽量不超过感受态体积的5%，否则会降低转化效率，从而得不偿失。
实验二 重组质粒的构建
实验二重组质粒的构建一、实验步骤1.提取质粒DNA2.酶切（EcoRI+SpeI）注意事项：①酶量，反应时间及体积： One unit of enzyme is defined asthe quantity needed to cut 1μg of DNA in 50ul in onehour。
反应时间的选择。
一般酶切鉴定30分钟就可以了,如果酶减少，可延长反应时间（16h)；反应体系不应太小,常规的酶切一般要维持在10-50ul。
酶的体积不要超过总体积的10%（甘油应在5%以下）。
②酶的使用：酶应永远放冰上，应是最后一个被加入到反应体系中，用完后及时放回冰箱③DNA的制备：待切割的DNA应当已去除酚，氯仿，乙醇，EDTA, 去污剂或过多盐离子等④缓冲液：不同酶需不同离子强度缓冲液，使用前应将缓冲液完全溶解并充分混匀。
⑤混匀：很重要，注意不可振荡⑥反应温度：通常37 ℃⑦终止反应：终止液，热失活，酚/ 氯仿抽提⑧星号活性：在非理想条件下，内切酶切割与识别位点相似但不完全相同的序列。
3.: 酶切产物纯化4.连接二、实验结果与分析1.酶切结果检测图1 EcoRI和SpeI双酶切GST-T及proB载体结果1%琼脂糖凝胶电泳检测图注：M：DL5000DNAmarker；1号泳道;未酶切proB 质粒DNA；10、11号泳道：EcoRI和SpeI双酶切proB载体结果；16、17泳道：EcoRI和SpeI双酶切GST-T载体结果分析：①由图1可知，1号泳道的未酶切proB质粒DNA未显示有条带，其原因可能是所点的未酶切proB标准品浓度过低，条带亮度过低难以识别。
②10和11泳道中大小约为5000bp的较亮条带是proB载体，但有轻微拖尾现象，条带呈圆弧型，应该是因为点样量较大。
经EcoRI和SpeI双酶切后，环状的质粒DNA被分成两个部分，分别为约5000bp和40bp的片段，其中40bp的小片段因分子量小，迁移速度快而跑出了琼脂糖凝胶，在图中无法看到。
同源重组构建质粒原理及方法
同源重组构建质粒原理及方法
同源重组构建质粒是一种常见的分子生物学技术，旨在构建具有特定序列或基因的质粒，以用于基因克隆、基因表达和蛋白质表达等领域。
这种技术利用了同源重组在细胞中的自然发生机制，而不需要DNA 修饰或特殊的酶切酶或连接酶。
同源重组构建质粒的基本原理是将目的 DNA 片段与载体 DNA 片段
的两端引入相同的特定序列，然后将两者共同转化至宿主细胞中，利用同源重组的机制完成质粒的重组。
在重组过程中，同源序列的两端会通过基因重组的方式将目的 DNA 片段与载体 DNA 片段连接起来，形成具有目的基因或 DNA 片段的质粒。
由于同源重组构建质粒不涉及酶切酶或连接酶的使用，因此成本低廉，操作简便，因此被广泛应用于生物学、医学和农业等领域。
同源重组构建质粒的方法主要有两种：一种是利用 PCR 技术扩增目的 DNA 片段和载体 DNA 片段的两端同源序列，将两者共同转化至宿主细胞中，完成质粒的构建。
另一种是将目的 DNA 片段和载体 DNA 片段的两端同源序列合成，并利用 DNA 合成技术将其连接在一起，然后将构建好的质粒转化至宿主细胞中，完成重组。
需要注意的是，同源重组构建质粒的成功率受到多种因素影响，包括同源序列的长度、同源序列与非同源序列之间的比例、转化效率、质
粒长度等。
因此，在进行同源重组构建质粒之前，需要对实验条件进行优化和控制，以提高质粒构建的成功率。
总之，同源重组构建质粒是一种简便、低成本、高效的基因克隆技术，被广泛应用于生物学、医学和农业等领域。
随着分子生物学技术的不断发展，同源重组构建质粒的应用前景将更加广阔。
重组质粒的构建、转化、筛选和鉴定解析
重组质粒的构建、转化、筛选和鉴定实验目的：1. 学习在实现DNA体外重组过程中，正确选择合适的载体和限制性内切酶并能对限制性核酸内切酶对载体和目的DNA进行切割，产生利于连接的合适末端。
2. 学习设计构建重组DNA分子的基本方法，掌握载体和外源目的DNA酶切的操作。
3. 学习利用T4DNA连接酶把酶切后的载体片段和外源目的DNA片段连接起来，构建体外DNA分子的技术，了解并掌握几种常用的连接方式。
4. 掌握利用Cacl2感受态细胞的方法。
5. 学习掌握热击法转化 E.coli的原理和方法。
6. 掌握α互补筛选法和PCR检测法筛选重组子的方法。
并鉴定体外导入目的DNA片段的大小。
7. 学习和掌握PCR反应的基本原理和操作技术，了解引物设计的基本要求。
实验原理：外源DNA与载体分子的连接即为DNA重组技术，这样重新组合的DNA分子叫做重组子。
重组的DNA分子式在DNA连接酶的作用下，有Mg2+、ATP存在的连接缓冲系统中，将分别经限制性内切酶酶切的载体分子和外源DNA分子连接起来。
将重组质粒导入感受态细胞中，将转化后的细胞在选择性培养基中培养，可以通过α互补筛选法筛选出重组子，并可通过酶切电泳及PCR检验的方法进行重组子的鉴定。
1. 重组子的构建酶切时首先要了解目的基因的酶切图谱，选用的限制性内切酶不能目的基因内部有专一的识别位点，否则当用一种或两种限制性内切酶切割外源工体DNA时不能得到完整的目的基因。
其次要选择具有相应的单一酶切位点质粒或者噬菌体载体分子。
常用的酶切方法有双酶切法和单酶切法两种。
本实验采用单酶切法，即只用一种限制性内切酶切割目的DNA片段，酶切后的片段两端将产生相同的黏性末端或平末端，再选用同样的限制性内切酶处理载体。
在构建重组子时，除了形成正常的重组子外，还可能出现目的DNA片段以相反方向插入载体分子中，或目的DNA串联后再插入载体分子中，甚至出现载体分子自连，重新环化的现象。
分子生物学重组质粒的制备
实验一感受态细胞的制备一、实验材料大肠杆菌DH5a 、LB培养基、0.1M CaCl2,50ml大Ep管，冰，80%甘油。
二、操作步骤氯化钙法1.将单个菌落或液体菌种（1:50）接种于20mL LB培养液的试管中，37℃振荡（200r/min）培养过夜。
2.取过夜2ml菌体加入100mLLB培养液37℃振荡培养至光密度（OD600）值在0.4-0.5之间。
（约需1h-2h）.3.预冷0.1M CaCl2，和2个50ml大Ep管。
4.将细菌培养物分别倒入预先冰浴的无菌50mL大Ep管中，冰浴30min.5.于4℃下离心10min,（4000r/min）,弃去上清夜，放于冰浴中。
6.加10mL冰冷的0.1mol/L MgCl2溶液混匀，冰浴30min。
7.4℃下离心10min,（4000r/min）,弃去上清夜（吸尽），放于冰浴中。
8.加入2ml 0.1 mol/L CaCl2轻混。
9.分装于1.5ml离心管中，(每支200uL)，－80℃储存备用。
1)转化用：200ul/Ep2）保存：180ul+20ul甘油（80%）注意：1.为了获得高感受态细胞，应选用处于生长对数期的细胞，OD600值不应高于0.6，并且在整个试验过程中均需将细胞置于冰上。
2.细胞在冰冻后即获得了感受性，在－80℃几小时后感受性达到最高值，几个月不会改变。
实验二质粒DNA的小量提取一、试剂及溶液LB培养基、葡萄糖（1）用于碱法提取质粒DNA的溶液a.溶液Ⅰ（GET）缓冲液(50ml)：葡萄糖0.49g，0.5M的EDTA(pH8.0)1ml，1M的Tris-HCl(pH8.0)1.25ml。
b. 溶液Ⅱ（变性液）：(现用现配)c. （50ml）]：60mL的5M的KAc，11.5mL冰醋酸，28.5mL H2O. PH4.8。
(2)缓冲液TBE缓冲液(10Χ)：称取Tris 108g，硼酸55g，5M EDTA（Ph8.0）40ml，用H2O定容到1000mL。
实验报告构建重组质粒(3篇)
第1篇一、实验目的1. 学习DNA体外重组技术的原理和方法。
2. 掌握重组质粒的构建、转化、筛选和鉴定技术。
3. 熟悉实验操作步骤和注意事项。
二、实验原理DNA体外重组技术是指将外源DNA片段与载体DNA片段在体外进行连接，形成重组DNA分子的技术。
通过该技术，可以将外源基因导入宿主细胞，实现基因表达和功能研究。
三、实验材料1. 载体：pUC19质粒2. 目的基因：基因片段3. 限制性核酸内切酶：EcoRI、BamHI4. DNA连接酶：T4 DNA连接酶5. DNA聚合酶：Klenow片段6. 琼脂糖凝胶电泳试剂7. DNA标记物8. 转化试剂：CaCl2、SDS、乙醇9. 受体细胞：大肠杆菌DH5α四、实验步骤1. 目的基因的扩增（1）设计引物：根据目的基因序列设计一对引物，引物长度一般为20-25bp，5'端添加EcoRI和BamHI酶切位点。
（2）PCR扩增：以基因片段为模板，引物为引物，进行PCR扩增。
2. 载体的酶切（1）将pUC19质粒和PCR扩增的目的基因分别用EcoRI和BamHI进行酶切。
（2）回收酶切片段：琼脂糖凝胶电泳分离酶切片段，回收目的片段。
3. DNA连接（1）将回收的目的基因片段和载体片段混合，加入DNA连接酶，进行连接反应。
（2）将连接产物转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞中。
4. 转化后细胞的培养与筛选（1）将转化后的细胞在含有氨苄青霉素的LB培养基中培养过夜。
（2）取适量菌液进行PCR检测，筛选出阳性克隆。
5. 阳性克隆的鉴定（1）提取阳性克隆的质粒DNA。
（2）用EcoRI和BamHI进行酶切，琼脂糖凝胶电泳检测酶切片段。
（3）将酶切片段与标记物进行对比，验证重组质粒的正确性。
五、实验结果与分析1. PCR扩增结果：在PCR产物中，可见一条与预期片段大小相符的条带。
2. 酶切结果：在琼脂糖凝胶电泳中，可见目的基因片段和载体片段的酶切片段。
3. 阳性克隆的鉴定：在琼脂糖凝胶电泳中，可见与预期片段大小相符的条带，证明重组质粒构建成功。
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重组质粒的构建经验 [技巧]
重组质粒的构建经验~~~
昨天我在版中我看很多谷友询问重组质粒的构建问题，有些谷友说构建质粒需要一个月，甚至更长时间，这让我联想我刚做分子生物学时候的曲折。
重组质粒构建是常用的分子生物学手段，其实只是最基本的方法，一般一个星期同时构建三二个组质粒是没有问题的。
在国内先进的实验中，也大都是由实验员搞定。
但是其中还是有些基本的技巧需要掌握。
在这里将我的心得分享于大家，这也是我本人几年来一线工作时的经验积累，以期能为谷友提供借鉴，让大家在实验中少走弯路。
所涉及内容如下: 1) 克隆基因的酶切位点问题 2) 载体酶切的问题 3) 连接片段浓度比的问题在阐明上述问题同时，本人尽可能举些实验中的问题案例予以说明。
一、克隆基因的酶切位点问题 1、克隆位点选择的问题。
首先要对目标基因进行酶切位点扫描分析，列出其所含酶切位点清单。
然后对照质粒多克隆位点，所选择的克隆位点必须是目标基因所不含的酶切位点。
这是常识，不赘述。
2、保护碱基数目的问题。
在设计PCR引物时，引入酶切位点后，常常要加入保护碱基，这是大家所熟知的。
但是保护碱基数量多少，可能被新手所忽视。
这种忽视碰可能会大大影响后续的实验进展。
一般情况下，普通的内切酶只加入两个保护碱基，其内切反应就可以正常进行;而有一类，仅仅只加入两个保护碱基，其内切反应就不能正常进行，这是因为内切酶不能正常结合DNA片段上。
如NdeI就属这类，需要加入至少6个保护碱基，常用的HindIII也要三个。
下面是我提供这类酶的列表及其所需最少的保护碱基数，相信下列将有助于大这家的实验设计。
NcoI 4 NdeI 6 NheI 3 NotI 8 PmeI 6
SacI 3 SalI 3 SmaI 3 HindIII 3 BstI 8 SphI 4
XhoI 3 XbaI 3 SmaI 4 案例分析一:本人最初曾选用NdeI克隆位点，未注意到保护碱基数目的问题，设计PCR引物时，引入NdeI酶切位点后，只加上两个保护碱基，一个月内没有进展，始终不能成功构建重组载体。
后查文献得知症结所在，在NdeI序列后加上六个保护碱基后，迎刃而解。
大家引以为戒啊。
现在普通酶我都引入三个保护碱基。
现在碱基合成价格也不贵了，为保证酶切充分，连接顺利，不用节约那点钱，再说若一次不成功，重复实验花费时间
与金钱更多，孰利孰弊，不言自明。
呵呵。
二、载体酶切的问题 1、质粒的单酶切鉴定。
这个问题似乎很简单，但我认为很有着重强调之必要。
现在大家手头的质粒都是转来转去的，其中的各酶切位点状况如何，是否能被有效地切开，这些问题都是要核实的。
因此，在实验开始之前必须对质粒载体进行单酶切鉴定。
现在我每次构建之前，对所选择的克隆位点都要作一一鉴定，例如选择NdeI和
HindIII作为克隆位点，就先分别对质粒上这两个酶的酶切位点进行单酶切鉴定。
单酶切鉴定能有效地切开后，再发出引物合成定单，进行引物合成;若不能，就按“一”中原则进行调换。
2、连接反应的对照。
在实验中，这步骤属于质粒载体与外源DNA片段的连接反应。
成功与否，很大程度上取决于与质粒和DNA片段的酶切效果。
一般情况下，都在通用缓冲液中进行双酶切，但这两种酶在通用缓冲液中酶切效率不一样，这可能导致部分的单缺口的质粒片段存在，这样，在连接反应中，即使在外源DNA片段存在下，这种单缺口的质粒片段能够进行更快速有效自我连接。
最终结果是大量假阳性的菌斑生长。
对照连接反应中，在不加入外源片段情况下，实验结果如果有菌斑生长，说明双酶切不充分，质粒DNA必须重新进行双酶切。
实验案例分析2:本人曾用XhoI和HindIII酶切位点构建重组质粒，对质粒进行双酶切后，直接就做连接，未上述两步鉴定，每次结果满板的菌斑。
但就是没有阳性。
后来对质粒进行单酶要鉴定后，发现XhoI酶切位点损坏。
又是一个月没有进展，浪费精力和药品。
血的教训啊。
因为当时没有注意到:单切质粒是一条
带，双切质粒也是一条带，电泳行为上是一样的，分辨不出。
如果做上述任何一个鉴定就会知道问题出在那儿，呵呵。
实验案例分析3:本实验室一个号称实验严谨的大博士，用KpnI和HindIII构建重组质粒，一个月未果，只得阴性斑，不得阳性斑，后怀疑KpnI酶失效。
迁怒KpnI，在我不知情下扔掉实验室所有KpnI酶。
我得知后，问他做过上述两鉴定实验后，他支吾着说没有，后经鉴定HindIII位点失效。
最后他责备本人暗中保留一手，没有倾攮相授。
呵呵，他不自责自己不思考，只是木着脑袋做实验，反倒咬一口解铃人，再说我在那以前也不知道他遇到什么难题。
呵呵，你说冤不冤,这世道啊!也可看出，实验室人员之间相互交流相当重要。
两星
期前写了前两问题后，终于能抽时间写第三个问题，在做好前述两个方面工作后，这个问题相对简单。
三、连接时两片段浓度比问题一般实验指导手册上都说质粒:片段,1:3(摩尔比)，在实际操作中我以为在1:5甚至1:10为宜。
做好“一、二”，16? 10小时后，每次都能有效地连接上。
当然还有大肠杆菌感受觉态问题，我们以前自己做，现在懒得做了，都用“天为时代公司”的产品，感觉还不错(特别声明我不是天为公司内线，呵呵)。
这里介绍一个估测处DNA浓度的方
法:DNA可以用紫外法检测，也可以电泳对比marker估测，在要求不是很精确情况下，大家不妨试试下面方法: 1( 取一平皿。
2( 薄薄倒一层含有EB的琼脂糖胶，凝固 (4 ?可以存一个星期)。
3( 平皿背面可以画成小方格。
4( 一小格中点1 ul样品。
5( 另一小格格点1 ul DNA标准品(我一般用Takara 2000 DNA lander，1 ul相当60 ng) 6( 凉干后，紫外灯下根据亮度就可以估测了。
OK，我连接时这么估测浓度，5分钟就要可以知道两片段浓度。
其实连接片段浓度比可以充许在一个范围内，1:5至1:10都可以，所以上述估测方法在这种情况下是行得通的。