重组质粒的构建与转化
同源重组构建质粒原理及方法
同源重组构建质粒原理及方法一、引言同源重组构建质粒是基因工程领域的关键技术，它通过将外源基因片段与适当的质粒DNA相连接，实现外源基因的表达和遗传转移。
本文将详细介绍同源重组构建质粒的原理和方法，以及常用的实验步骤和注意事项。
二、原理同源重组构建质粒的原理是通过内切酶在两个同源DNA片段上切割，然后连接起来形成一个新的质粒DNA。
同源DNA片段通常由外源基因和质粒DNA提供，通过互补的粘性末端序列将它们连接起来。
三、方法以下是同源重组构建质粒常用的方法和步骤：1. 选择合适的质粒和酶切位点首先，需要选择一个适合的质粒，根据实验需要选择带有合适酶切位点的质粒。
同时，还需要选择适合的内切酶用于切割质粒和外源基因片段。
2. 切割质粒和外源基因片段将选择好的质粒和外源基因片段与相应的内切酶一起反应，将其切割为互补的粘性末端序列。
切割后的质粒和外源基因片段会留下粘性末端。
3. 进行连接反应将切割好的质粒和外源基因片段加入连接反应中，可以使用DNA连接酶来催化连接。
4. 转化宿主细胞将连接好的质粒转化到宿主细胞中，常用的方法有热擦法、电穿孔法和化学法等。
宿主细胞可以是大肠杆菌等常用的实验宿主细胞。
5. 筛选转化子将转化到宿主细胞中的质粒进行筛选，可以通过选择性培养基或进行基因标记（如荧光蛋白等）来筛选转化子。
四、注意事项在同源重组构建质粒过程中，需要注意以下事项：1. 同源重组效率同源重组的效率是影响质粒构建成功率的关键因素。
需要合理选择酶切位点，确保质粒和外源基因片段有足够的同源性。
2. DNA连接酶的选择DNA连接酶的选择也是非常重要的。
不同的DNA连接酶在连接效率和酶切位点的要求上有所区别，选择适合的连接酶能提高连接效率。
3. 转化宿主细胞选择转化宿主细胞的选择也会影响质粒构建的成功率。
不同的宿主细胞对质粒的转化效率和表达能力有所不同，需要根据实验要求选择合适的宿主细胞。
4. 合理设计实验对照组为确保实验结果的可靠性和准确性，需要设计适当的对照组，验证质粒构建的成功性和外源基因的表达情况。
重组质粒的构建
重组质粒的构建重组质粒的构建是基因工程的核心步骤之一，其目的是将目的基因插入到质粒载体中，以实现目的基因的稳定表达和克隆化。
以下是重组质粒构建的主要步骤：1.目的基因获取首先需要获取目的基因。
目的基因可以从基因文库、PCR、基因组测序等方法中获取。
根据需要选择合适的方法，将目的基因克隆到质粒载体中。
2.载体质粒选择选择适合的质粒载体是重组质粒构建的关键步骤之一。
根据目的基因的特点和表达要求，选择适合的质粒载体。
常见的质粒载体有pET、pUC、pBluescript等。
3.限制性酶切限制性酶切是重组质粒构建的重要步骤之一。
通过限制性酶切，将目的基因和质粒载体分别切开，露出粘性末端，以便于连接反应。
4.连接反应将切好的目的基因和质粒载体的粘性末端连接在一起，形成重组质粒。
连接反应需要使用T4DNA连接酶或其它连接酶进行催化。
连接反应需要在适宜的温度和pH 条件下进行一定时间，以确保重组质粒的正确构建。
5.转化宿主细胞将连接反应得到的重组质粒转化到宿主细胞中。
常见的宿主细胞有细菌、酵母、昆虫等。
转化方法有多种，如电穿孔法、化学转化法等。
转化后需要在适宜的培养条件下进行培养，以获得大量的重组质粒。
6.克隆筛选克隆筛选是重组质粒构建的重要步骤之一。
通过克隆筛选，可以确定重组质粒是否正确构建。
常见的克隆筛选方法有蓝白斑筛选、酶切法等。
7.序列验证最后需要对重组质粒进行序列验证，以确保目的基因的正确插入和序列的准确性。
序列验证可以通过Sanger测序等方法进行。
重组质粒构建注意事项
重组质粒构建注意事项重组质粒构建是现代生物学中常用的技术手段，其能够利用DNA重组技术将感兴趣的基因片段插入到质粒中，从而探究基因的功能、调控及其在生物体中的作用。
下面是重组质粒构建中需要注意的一些关键问题。
1.选择合适的质粒载体：质粒是一种能够自主复制的小型DNA分子，其可以含有多个对基因表达有重要影响的元件，如启动子、终止子、选择性标记基因等。
因此，选择合适的质粒载体对于重组质粒构建至关重要。
一般而言，常用的质粒载体有pUC19、pBR322、pBluescript等，根据实验需要选择适合的质粒载体。
2.选择合适的限制性内切酶：限制性内切酶是能够识别特定的DNA序列并具有切割作用的酶。
在重组质粒构建中，常需要利用限制性内切酶切割质粒载体和目标基因片段的DNA，从而产生互补的粘性末端，便于二者连接。
因此，选择适合的限制性内切酶对于重组质粒的构建是非常重要的。
3.设计合适的引物：引物是在PCR扩增反应中用于识别目标DNA序列的短小DNA片段。
在重组质粒构建中，利用引物扩增目标基因片段是必不可少的步骤。
因此，设计合适的引物非常重要。
引物应具有良好的特异性，能够特异性地扩增目标基因片段，并且不会与质粒载体序列发生非特异性扩增。
此外，引物还可以设计一些限制性内切酶切割位点，以便于后续的连接工作。
4.进行寡核苷酸连接反应：连接反应是指将质粒载体和目标基因片段进行连接的步骤。
常用的方法有T4 DNA连接酶的连接反应和PCR引物连接法。
在连接反应中，需要注意合适的反应条件，例如连接反应的时间、反应体系的pH值、温度等，对连接效果有重要影响。
5.转化宿主细胞：转化是指将重组质粒导入宿主细胞中。
在进行转化实验时，需要注意选择合适的宿主细胞，例如大肠杆菌（E. coli）等，以及适当的培养基、适宜的温度和容器。
此外，还需要注意进行适当的筛选压力，如在含有选择性抗生素的培养基中进行培养，筛选能够稳定带有重组质粒的转化子。
重组质粒标记基因筛选的原理
重组质粒标记基因筛选的原理引言：重组质粒标记基因筛选是一种常用的遗传工程技术，可以通过标记基因的引入和筛选，实现对特定基因的研究和应用。
该技术在基因克隆、基因表达、基因功能研究等领域具有广泛的应用价值。
本文将介绍重组质粒标记基因筛选的原理及其在科学研究和应用中的作用。
一、重组质粒构建重组质粒是指将目标基因或DNA片段插入到质粒中形成的一种重组DNA分子。
通常，重组质粒包括一个选择标记基因和目标基因或DNA 片段。
选择标记基因通常是一种能够在特定条件下表达的基因，例如抗生素耐药基因。
目标基因或DNA片段则是研究者所关注的基因或DNA序列。
二、质粒转化质粒转化是指将重组质粒导入到宿主细胞中的过程。
常用的转化方法包括热激转化、电穿孔转化、化学转化等。
转化后的细胞称为转化体。
三、筛选标记基因筛选标记基因的目的是为了筛选成功转化的细胞。
常用的筛选方法是将转化体培养在含有选择标记基因所对应抗生素的培养基中，只有成功转化的细胞才能够存活下来。
通过这种方法，可以获得带有选择标记基因的转化细胞。
四、目标基因筛选通过筛选标记基因，已经获得了转化细胞，但其中是否存在目标基因还需要进一步筛选。
常用的目标基因筛选方法包括PCR筛选、酶切筛选、Southern blotting等。
PCR筛选是一种便捷快速的方法，通过特异性引物扩增目标基因，检测扩增产物的存在与否。
酶切筛选则是利用酶切产物的大小差异来判断目标基因的存在与否。
而Southern blotting是一种较为精确的方法，通过DNA杂交的原理，检测目标基因的存在与否。
五、应用领域重组质粒标记基因筛选技术在科学研究和应用中有着广泛的应用。
在基因克隆中，通过将目标基因插入到质粒中，可以实现对基因的快速扩增和分离纯化。
在基因表达中，可以通过标记基因筛选成功转化的细胞，并进一步表达目标基因。
在基因功能研究中，可以通过标记基因筛选目标基因，进而研究基因的表达、调控和功能等方面。
构建重组质粒基本方法
构建重组质粒基本方法重组质粒是一种重要的遗传工程工具，用于将外源基因导入到宿主细胞中，从而实现特定基因的表达与功能研究。
构建重组质粒的基本方法可以概括为：选择质粒骨架、引物设计与合成、PCR扩增外源基因片段、DNA连接与重组、质粒扩增与提取、质粒鉴定与筛选，以下分别进行详细介绍。
一、选择质粒骨架在构建重组质粒时，首先需要选择一个合适的质粒骨架。
质粒骨架是指一个可复制的质粒DNA分子，常见的质粒骨架有pUC、pBR322、pET等。
质粒骨架上通常包含有宿主细胞可以识别的起始子和起始子附近的终止子，用于启动和终止转录过程，同时还包含选择标记基因，如抗生素抗性基因，以及其他在分子克隆中常用的诸如多克隆位点、限制酶切位点等。
二、引物设计与合成在构建重组质粒时，需要利用引物来扩增并克隆外源基因片段。
引物一般是两条DNA可控引物，其中一条是正向引物，另一条是反向引物。
引物的设计需要注意以下几点：引物的长度通常为15-30个碱基对，引物应该具有合适的Tm值，并且在引物双链的末端至少有2个碱基对是纯G或纯C。
引物可以使用商业引物合成公司合成。
三、PCR扩增外源基因片段使用引物扩增外源基因片段是构建重组质粒的一个关键步骤。
PCR反应一般包括DNA模板、引物、dNTPs和DNA聚合酶。
根据需要，可以使用特异性引物对目标基因进行PCR扩增，然后通过凝胶电泳检查PCR产物长度和纯度，并使用PCR产物进行下一步处理。
四、DNA连接与重组将PCR扩增得到的外源基因片段与质粒骨架进行连接和重组。
连接通常通过使用限制酶切和连接酶来实现。
限制酶切是利用限制酶切剪切DNA，生成具有互补粘性末端的DNA片段，然后将外源基因片段与质粒骨架进行连接。
连接酶可以使DNA片段之间的末端骨架参与phosphodiester结合反应，从而形成连体分子。
五、质粒扩增与提取将重组质粒转化到宿主细胞中，通过培养和培养基筛选来扩增质粒。
质粒扩增一般在含有抗生素的琼脂糖平板上进行，抗生素可以选择对宿主细胞有毒作用但不对重组质粒有毒的抗生素。
重组质粒构建流程
重组质粒构建流程导言在分子生物学研究中，质粒是一种重要的工具，可用于携带外源DNA，转导到靶细胞内进行表达或操纵基因。
在许多应用中，需要从头开始构建特定的质粒来满足实验需求。
本文将介绍重组质粒的构建流程，包括质粒设计、DNA片段的合成、连接和转化等步骤。
质粒设计重组质粒的构建首先需要进行质粒设计。
在设计过程中，需要考虑以下几个方面：质粒拓扑结构、宿主细胞、选择标记、启动子、终止子等。
其中，质粒拓扑结构是质粒构建的基础，可以选择环状质粒或线性质粒；宿主细胞是质粒的宿主细胞，需要考虑宿主细胞的特性和适用范围；选择标记是用于筛选携带外源DNA的宿主细胞，可以选择抗生素抗性标记、荧光蛋白标记等；启动子和终止子则是用于调控外源DNA的表达水平。
DNA片段的合成在质粒构建中，需要合成一系列DNA片段，包括载体骨架、选择标记、启动子、基因、终止子等。
DNA片段的合成可以通过多种方法进行，包括化学合成、PCR扩增、酶切和连接等。
在合成过程中，需要确保DNA片段的正确性和纯度，以保证后续的连接和转化效率。
连接连接是质粒构建的关键步骤，通过连接不同的DNA片段来构建目标质粒。
连接的方法包括酶切和连接、PCR扩增和连接、重组DNA技术等。
在连接过程中，需要确保连接效率和准确性，避免产生错误连接或杂交产物。
此外，对于大片段DNA的连接，还需要考虑连接的稳定性和转化效率。
质粒的放大和提取连接完成后，需要将质粒放大到足够的数量，并提取纯净的质粒DNA。
放大的方法可以选择细菌发酵、真菌发酵等，根据质粒的特性选择合适的宿主细胞进行放大。
质粒提取的方法包括碱裂解法、隐式裂解法等，确保提取的质粒DNA的纯度和完整性。
质粒的转化最后一步是将构建好的质粒转化到目标宿主细胞中，进行表达或操纵基因。
转化的方法可以选择化学转化、电转化、热激转化等，根据宿主细胞的特性和实验需求选择合适的转化方法。
在转化过程中，需要考虑转化效率、亲和性和表达水平等因素，确保转化的质粒可以稳定存在和表达。
重组质粒的概念
重组质粒的概念重组质粒是指通过DNA技术，将外源基因或DNA片段插入到质粒中，并使其在宿主细胞中复制和表达的过程。
重组质粒常用于基因工程研究、基因克隆及蛋白表达等领域，具有广泛的应用价值。
重组质粒通常由一个或多个外源DNA序列插入到质粒的多个位点上，插入的DNA序列可以来自同一种生物体，也可以来自不同种生物体。
质粒是一种环状的DNA分子，可以自由地在细胞内复制和传递。
在细胞复制过程中，质粒会被复制成多个复制体，并将其传递给子细胞。
质粒通常由多个重要元素组成，其中最重要的是载体序列和选择标记。
载体序列是质粒中的DNA序列，在质粒复制和传递过程中起到重要的作用。
载体序列通常包括起始位点、终止位点和复制起始区域等，这些序列协助控制质粒的复制和分离过程。
选择标记是质粒中的DNA序列，可以帮助鉴别哪些细胞获得了重组质粒。
选择标记常用于筛选具有重组质粒的细胞，例如抗生素抗性基因。
只有带有选择标记的细胞可以生存和繁殖，从而筛选出带有重组质粒的细胞。
重组质粒的构建通常包括以下步骤：1.选择合适的质粒：根据实验需要和目标生物体，选择合适的质粒作为载体。
常用的质粒有pUC19、pBR322等。
2.选择合适的外源DNA序列：根据实验目的，选择合适的外源DNA序列。
这些DNA序列可以来自某个生物体的基因，或者是重组技术合成的特定DNA片段。
3.设计引物和酶切位点：设计引物，可以通过PCR扩增外源DNA序列，并设计酶切位点，以便将外源DNA插入到质粒上。
4.酶切和连接：通过限制性内切酶酶切质粒和外源DNA，生成具有互补末端的DNA片段。
然后使用DNA连接酶将外源DNA和质粒连接起来。
5.转化：将重组质粒转化到宿主细胞中。
常用的宿主细胞有大肠杆菌、酵母菌等。
可以通过热激转化、化学转化或电转化等方法将重组质粒引入到宿主细胞内。
6.筛选：通过选择标记，筛选出带有重组质粒的细胞。
通常使用抗生素筛选法，将带有抗生素抗性基因的重组质粒引入到宿主细胞中，只有带有重组质粒的细胞能够在富含抗生素的培养基中生长。
质粒重组实验报告
质粒重组实验报告质粒重组实验报告引言：质粒重组是一种重要的实验技术，可以将外源基因导入到宿主细胞中，用于研究基因功能、蛋白质表达等方面。
本实验旨在通过质粒重组技术，将外源基因成功导入到大肠杆菌中，并通过酶切、连接、转化等步骤验证重组质粒的构建。
材料与方法：1. 外源基因：选择了编码了绿色荧光蛋白（GFP）的质粒pGFP。
2. 宿主细胞：采用大肠杆菌作为宿主细胞。
3. 酶切酶：使用限制酶EcoRI和BamHI进行酶切反应。
4. 连接酶：使用T4 DNA连接酶进行连接反应。
5. 培养基：含有抗生素的LB培养基。
实验步骤：1. 酶切反应：将pGFP质粒和EcoRI、BamHI酶切酶按照指定条件进行酶切反应，以得到线性化的质粒和目标基因片段。
2. 连接反应：将线性化的质粒和目标基因片段加入连接酶缓冲液中，按照指定条件进行连接反应，形成重组质粒。
3. 转化：将重组质粒加入含有大肠杆菌的培养基中，通过热激转化法使质粒进入细胞。
4. 筛选：将转化后的细胞均匀涂布在含有抗生素的LB平板上，筛选出含有重组质粒的菌落。
5. 验证：通过PCR、酶切等方法对筛选出的菌落进行验证，确认质粒重组成功。
结果与讨论：经过酶切、连接、转化等步骤，成功构建了质粒重组实验系统。
在LB平板上筛选出了多个抗生素耐受的菌落，表明转化成功。
通过PCR验证，检测到了目标基因片段的特异扩增带，证明重组质粒中成功导入了外源基因。
进一步进行酶切验证，发现重组质粒经过连接反应后，酶切位点发生改变，与未连接的质粒有明显差异。
这些结果表明，质粒重组实验成功构建了重组质粒，并将外源基因导入到大肠杆菌中。
质粒重组实验的成功对于基因功能研究和蛋白质表达具有重要意义。
通过重组质粒，可以将外源基因导入到宿主细胞中，进而研究其在生物体内的功能和表达情况。
例如，可以通过重组质粒实现基因敲除、基因表达调控等功能，从而深入了解基因在生物体内的作用机制。
同时，重组质粒还可以用于蛋白质表达，通过外源基因的转录和翻译，使宿主细胞产生目标蛋白质，用于研究其结构、功能等方面。
同源重组构建质粒步骤
同源重组构建质粒步骤
同源重组构建质粒是一种常用的基因工程技术，用于将外源基因插入到质粒中。
以下是同源重组构建质粒的一般步骤：
1. 选择合适的质粒载体：根据实验需要选择适当的质粒载体，通常选择含有适当多个限制酶切位点的质粒。
2. 执行酶切反应：将选定的质粒载体进行限制酶切反应，使用限制酶切酶将质粒切割为线性片段。
3. 扩增外源基因：使用PCR等技术扩增所需的外源基因片段，同时设计引物使得其两端带有与质粒载体的酶切位点相同的序列。
4. 接头连接：将扩增的外源基因片段与酶切后的质粒片段进行连接，使用连接酶将二者进行连接。
连接酶可以是T4 DNA连接酶等。
5. 转化宿主细胞：将连接后的质粒导入到合适的宿主细胞中，常用的宿主细胞包括大肠杆菌等。
6. 选取转化子：利用筛选法选择成功转化质粒的宿主细胞，可以使用抗生素等抗性筛选方法。
7. 确认质粒插入：通过PCR、酶切等方法对转化细胞进行筛
选和验证，确认质粒中外源基因的插入情况。
8. 提取质粒：从筛选验证通过的细胞中提取质粒，通常使用质粒提取试剂盒等方法进行质粒提取。
9. 验证质粒：通过测序等方法验证质粒中外源基因的序列，确认构建成功。
以上步骤仅为一般的同源重组构建质粒步骤，具体实验操作可能因实验设计和需求的不同而有所差异。
酵母双杂交实验原理
酵母双杂交实验是一种用于研究蛋白质之间相互作用的实验方法，它基于真核生物调控转录起始过程的机制。
酵母双杂交实验主要通过检测两个蛋白质在酵母细胞中的相互作用，从而揭示它们在生物体内的功能和相互作用。
酵母双杂交实验原理如下：
1. 构建重组质粒：首先，将目标蛋白质的表达载体与酵母双杂交系统中的启动子、激活子等调控元件进行重组，得到重组质粒。
2. 转化酵母细胞：将重组质粒转化到酵母细胞中，使目标蛋白质在酵母细胞中表达。
3. 筛选融合蛋白：利用选择性培养基，筛选出成功表达目标蛋白质的酵母细胞。
4. 鉴定蛋白质互作：将筛选出的酵母细胞进行混合、共培养，观察转录激活效应。
如果两个蛋白质之间存在相互作用，它们会结合在一起，形成完整的转录激活因子，从而激活报告基因的转录。
通过检测报告基因的表达水平，可以判断蛋白质之间是否发生相互作用以及作用强度。
5. 结果分析：根据实验结果，分析蛋白质之间的相互作用，进一步研究它们在生物体内的功能和调控机制。
目前常用的酵母双杂交系统有LexA系统和Gal4系统两种。
LexA系统基于原核蛋白LexA的DNA结合域和转录激活域，而Gal4系统则利用了酵母转录激活因子GAL4的DNA结合域和转录激活域。
这两种系统在实验操作和应用范围上略有不同，但均具有较高的灵敏度和特异性。
重组质粒的构建与转化2
姓名系年级10级生命基地组别JD-4 同组者科目分子生物学实验题目重组质粒的酶切与P C R验证学号实验目的1.掌握通过酶切与PCR扩增鉴定重组DNA分子的基本方法。
2.学习和掌握PCR扩增的基本原理和实验技术。
实验原理1.酶切法鉴定重组DNA重组质粒是外源基因通过单酶切（或双酶切）与用相同的（或两种）限制性核酸内切酶切割的质粒载体连接后获得的，因此在连接处仍保留原限制性核酸内切酶的识别序列，用该酶（或两种酶）再次切割重组质粒，能把插入片段切离载体，根据琼脂糖凝胶电泳检测可见有载体片段和插入的外源DNA片段，并可知插入片段的大小。
2.PCR扩增法鉴定重组质粒PCR反应可以用来鉴定载体上是否重组了外源DNA片段，并可估测外源插入片段的大小，。
根据载体多克隆位点上下游基因的序列设计一对PCR引物，两引物之间的距离即是空载体PCR 扩增的大小，如果在多克隆位点内插入外源DNA片段，就会改变PCR扩增产物的大小，扩增产物的大小减去两引物之间的距离即是插入片段的长度，也可以直接基于外源DNA两端的序列设计一对引物，分分别以空载体和重组质粒为模板进行PCR反应，只有重组质粒能扩增出一定大小的产物，则该产物的大小即是插入片段的大小。
3.PCR扩增原理具有模板DNA，寡核苷酸引物，Mg2+，4种脱氧核糖核苷酸（dNTPs）、DNA聚合酶和缓冲液所有组分的PCR反应体系中，在模板变性，引物退火后，模拟体内半保留复制过程——即在DNA聚合酶的作用下，以变性单链为模板，依据碱基互补配对原理，在引物的3’端加入合适的核苷酸分子，不断延伸直至完成新DNA的合成。
新合成的DNA分子也可以作为模板，参与后续的扩增反应，使目的分子呈指数增长。
因此，变性、退火和延伸循环反复25~30次姓名系年级10级生命基地组别JD-4 同组者科目分子生物学实验题目重组质粒的酶切与P C R验证学号后，即可以从少量的模板DNA中扩增出大量的目的产物。
农杆菌介导的转化作用原理
农杆菌介导的转化作用原理
农杆菌介导的转化是一种生物技术方法，用于将外源DNA引入植物细胞中。
其原理是利用农杆菌生长势旺盛、易于培养的特点，将目标外源DNA导入到农杆菌的质粒中，形成重组质粒。
然后通过将转化质粒与植物细胞接触，使其外源DNA传递到植物细胞内部。
具体步骤如下：
1. 构建重组质粒：在质粒中插入目标外源DNA，通常使用限制性内切酶将目标基因插入到质粒的多克隆位点（多克隆位点是一段DNA序列，能够容纳外源DNA）。
2. 转化农杆菌：将质粒导入到农杆菌中，使其质粒与细菌细胞融合，形成重组菌株。
3. 培养菌株：培养重组菌株，使其扩增到大量细胞。
4. 处理植物组织：将希望转化的植物组织（例如幼嫩的叶片或胚）与农杆菌接触，使农杆菌与植物细胞发生互作用。
5. 重组质粒转入植物细胞：通过机械方法（例如悬浮培养）或生理方法（例如创伤诱导），使农杆菌穿过植物细胞的细胞壁，使重组质粒进入植物细胞。
6. 重组质粒在植物细胞中复制和表达：重组质粒在植物细胞中复制，并将插入的目标基因转录和翻译为蛋白质。
通过农杆菌介导的转化方法，可以有效地将外源基因导入到植物细胞中，实现基
因转移和基因表达的目的。
这种方法在植物基因工程和转基因技术中得到广泛应用。
重组质粒的转化实验报告
重组质粒的转化实验报告
一、实验目的
本实验旨在构建重组质粒，以提高转录和表达的效率。
二、实验原理
重组质粒技术是一种细胞分子遗传学技术，它可以将一种特定的DNA片段插入另一种特定的质粒中，以改变质粒的表达模式。
它的基本原理是利用酶切，将特定的DNA片段插入质粒中，然后将其复制到另一个质粒中，从而改变质粒的表达模式。
三、实验步骤
1. 提取质粒：首先，使用适当的抗性菌株（如E.coli）提取质
粒DNA，使用特定的质粒提取试剂提取质粒DNA；
2. 克隆DNA片段：使用PCR技术，将要插入质粒中的DNA
片段克隆到另一个质粒中；
3. 制备重组质粒：将克隆的DNA片段插入质粒中，使用特定
的酶切试剂，完成重组质粒的制备；
4. 测序：使用测序仪，测试重组质粒的序列，以确保重组质粒的正确性。
四、实验结果
1. 质粒提取：成功提取质粒，提取的质粒DNA纯度达到99%以上；
2. 克隆DNA片段：成功克隆目标DNA片段，PCR扩增结果与理想结果一致；
3. 重组质粒制备：重组质粒制备成功，酶切结果与理想结果一致；
4. 测序：重组质粒的序列与理想序列一致，证明重组质粒制备成功。
五、结论
本次实验成功地构建了重组质粒，从。
重组质粒的构建与转化
姓名系年级10级生命基地组别JD-4 同组者科目分子生物学实验题目重组质粒的构建、转化、筛选和鉴定学号实验目的1.学习在实现DNA体外重组过程中，正确选择合适的载体和限制性内切酶并能用限制性核酸内切酶对载体和目的DNA进行切割，产生利于连接的合适末端。
2.学习设计构建重组DNA分子的基本方法，掌握载体和外源目的DNA酶切的操作。
3.学习利用T4 DNA连接酶把酶切后的载体片段和外源目的DNA片段连接起来，构建体外DNA分子的技术，了解并掌握几种常用的连接方式。
4.掌握利用Cacl2制备感受态细胞的方法。
5.学习掌握热击法转化E.coli的原理和方法。
6.学习并掌握使用红白菌落法筛选获得重组子以及α互补筛选法的原理及方法。
7.学习并掌握使用Omaga试剂盒抽提质粒的方法及进一步确定重组质粒中含有外源目的DNA片段。
实验原理：（一）限制性核酸内切酶的酶切反应体外构建重组DNA分子，首先要了解目的基因的酶切图谱，选用的限制性内切酶不能在目的基因内部有专一的识别位点，否则当用一种或两种限制性内切酶切割外源供体DNA时不能得到完整的目的基因。
其次要选择具有相应的单一酶切位点质粒或者噬菌体载体分子。
常用的酶切方法有双酶切法和单酶切法两种。
本实验采用单酶切法，即只用一种限制性内切酶切割目的DNA 片段，酶切后的片段两端将产生相同的黏性末端或平末端，再选用同样的限制性内切酶处理载体。
在构建重组子时，除了形成正常的重组子外，还可能出现目的DNA片段以相反方向插入载体分子中，或目的DNA串联后再插入载体分子中，甚至出现载体分子自连，重新环化的现象。
单酶切法简单易行，但是后期筛选工作比较复杂。
各种限制性内切酶都有其最佳反应条件，最主要的因素是反应温度和缓冲液的组成。
在双酶切体系中，如果两种酶对盐离子的浓度和温度要求一致，原则上可以将这两种酶同时加入一个反应体系中同步酶切；如果不一致，则酶切反应最好分步进行，常用的酶切顺序是：先低盐后高盐，先低温后高温。
实验报告构建重组质粒(3篇)
第1篇一、实验目的1. 学习DNA体外重组技术的原理和方法。
2. 掌握重组质粒的构建、转化、筛选和鉴定技术。
3. 熟悉实验操作步骤和注意事项。
二、实验原理DNA体外重组技术是指将外源DNA片段与载体DNA片段在体外进行连接，形成重组DNA分子的技术。
通过该技术，可以将外源基因导入宿主细胞，实现基因表达和功能研究。
三、实验材料1. 载体：pUC19质粒2. 目的基因：基因片段3. 限制性核酸内切酶：EcoRI、BamHI4. DNA连接酶：T4 DNA连接酶5. DNA聚合酶：Klenow片段6. 琼脂糖凝胶电泳试剂7. DNA标记物8. 转化试剂：CaCl2、SDS、乙醇9. 受体细胞：大肠杆菌DH5α四、实验步骤1. 目的基因的扩增（1）设计引物：根据目的基因序列设计一对引物，引物长度一般为20-25bp，5'端添加EcoRI和BamHI酶切位点。
（2）PCR扩增：以基因片段为模板，引物为引物，进行PCR扩增。
2. 载体的酶切（1）将pUC19质粒和PCR扩增的目的基因分别用EcoRI和BamHI进行酶切。
（2）回收酶切片段：琼脂糖凝胶电泳分离酶切片段，回收目的片段。
3. DNA连接（1）将回收的目的基因片段和载体片段混合，加入DNA连接酶，进行连接反应。
（2）将连接产物转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞中。
4. 转化后细胞的培养与筛选（1）将转化后的细胞在含有氨苄青霉素的LB培养基中培养过夜。
（2）取适量菌液进行PCR检测，筛选出阳性克隆。
5. 阳性克隆的鉴定（1）提取阳性克隆的质粒DNA。
（2）用EcoRI和BamHI进行酶切，琼脂糖凝胶电泳检测酶切片段。
（3）将酶切片段与标记物进行对比，验证重组质粒的正确性。
五、实验结果与分析1. PCR扩增结果：在PCR产物中，可见一条与预期片段大小相符的条带。
2. 酶切结果：在琼脂糖凝胶电泳中，可见目的基因片段和载体片段的酶切片段。
3. 阳性克隆的鉴定：在琼脂糖凝胶电泳中，可见与预期片段大小相符的条带，证明重组质粒构建成功。
质粒发酵工艺
质粒发酵工艺质粒发酵是一种常用的生物技术，被广泛应用于生物医药、生物化学、工业生产等领域。
本文将详细介绍质粒发酵的工艺流程、关键参数及调控方法，希望能为相关领域的科研工作者提供有用的指导意义。
一、质粒发酵的工艺流程质粒发酵是指将含有重组质粒的宿主细胞进行培养和发酵，以大量制备目标蛋白或其他特定产物。
其工艺流程主要包括以下几个步骤：1.宿主细胞的预处理：选择合适的宿主细胞，常见的包括大肠杆菌、酵母菌等。
对于大肠杆菌而言，预处理包括接种菌种、培养基筛选和其他处理等。
2.重组质粒的构建：从目标蛋白的DNA序列中克隆出所需的基因，并将其插入载体（质粒）中。
这一步通常采用分子克隆技术。
3.质粒转化：将构建好的重组质粒转化到宿主细胞中，使其成为重组菌株。
4.发酵培养：在适宜的条件下，对重组菌株进行发酵培养，以达到高效表达目标蛋白的目的。
5.目标产物的提取和纯化：培养结束后，通过离心、过滤、层析等方式对培养上清液进行处理，从中提取出目标产物并进行纯化。
二、质粒发酵的关键参数及调控方法1.培养基：选择适合菌株生长的培养基，液态或固态均可。
常用的培养基包括Luria-Bertani（LB）培养基、复合盐基培养基（YPB）等。
还可以根据需要添加相应的营养成分和抗生素等。
2.温度：温度对质粒发酵的影响很大。
一般大肠杆菌的生长适温为 37 度，但部分株系在更低的温度下生长更稳定，例如温度在 30-34 ℃ 时，可提高细胞存活率和重组蛋白产量。
3.氧气供应：氧气对细胞的代谢很重要，但过多或过少都会对细胞生长和产物合成产生影响。
调控氧气供应的方式包括控制气体流量、调整搅拌速度等。
4.酸碱度：合适的酸碱度有利于菌株的生长和目标蛋白的表达，一般维持在 pH 6.8-7.2。
5.发酵时间：发酵时间一般在 12-24 小时之间，根据菌株生长情况和目标蛋白的表达量进行调整。
本文简要介绍了质粒发酵的工艺流程、关键参数及调控方法。
在质粒发酵的实践过程中，需要对不同的参数进行筛选和优化，以提高产物表达量和纯度。
同源重组构建质粒原理及方法
同源重组构建质粒原理及方法
同源重组构建质粒是一种常见的分子生物学技术，旨在构建具有特定序列或基因的质粒，以用于基因克隆、基因表达和蛋白质表达等领域。
这种技术利用了同源重组在细胞中的自然发生机制，而不需要DNA 修饰或特殊的酶切酶或连接酶。
同源重组构建质粒的基本原理是将目的 DNA 片段与载体 DNA 片段
的两端引入相同的特定序列，然后将两者共同转化至宿主细胞中，利用同源重组的机制完成质粒的重组。
在重组过程中，同源序列的两端会通过基因重组的方式将目的 DNA 片段与载体 DNA 片段连接起来，形成具有目的基因或 DNA 片段的质粒。
由于同源重组构建质粒不涉及酶切酶或连接酶的使用，因此成本低廉，操作简便，因此被广泛应用于生物学、医学和农业等领域。
同源重组构建质粒的方法主要有两种：一种是利用 PCR 技术扩增目的 DNA 片段和载体 DNA 片段的两端同源序列，将两者共同转化至宿主细胞中，完成质粒的构建。
另一种是将目的 DNA 片段和载体 DNA 片段的两端同源序列合成，并利用 DNA 合成技术将其连接在一起，然后将构建好的质粒转化至宿主细胞中，完成重组。
需要注意的是，同源重组构建质粒的成功率受到多种因素影响，包括同源序列的长度、同源序列与非同源序列之间的比例、转化效率、质
粒长度等。
因此，在进行同源重组构建质粒之前，需要对实验条件进行优化和控制，以提高质粒构建的成功率。
总之，同源重组构建质粒是一种简便、低成本、高效的基因克隆技术，被广泛应用于生物学、医学和农业等领域。
随着分子生物学技术的不断发展，同源重组构建质粒的应用前景将更加广阔。
质粒同源重组的原理
质粒同源重组的原理质粒同源重组是一种常用的基因工程技术，通过将外源基因插入到质粒中，实现对目标基因的表达和研究。
本文将从质粒的构建、限制性内切酶切割、连接酶连接以及转化等方面，介绍质粒同源重组的原理。
一、质粒的构建质粒是一种环状的DNA分子，可以在细菌中自我复制。
质粒通常由多个基本部分组成，包括起始子、多克隆位点、选择标记基因等。
起始子指定了质粒的复制起点，多克隆位点提供了插入外源基因的位置，选择标记基因则用于筛选带有目标基因的转化菌株。
二、限制性内切酶切割限制性内切酶是一种特殊的酶，能够识别并切割DNA的特定序列。
在质粒同源重组中，需要选择合适的限制性内切酶对质粒和外源基因进行切割。
通过切割，可以在质粒和外源基因的切口上形成互补的粘性末端，为下一步的连接提供便利。
三、连接酶连接连接酶是一种酶类，能够催化DNA分子的连接。
在质粒同源重组中，需要使用连接酶将质粒和外源基因连接起来。
连接酶能够识别质粒和外源基因的互补粘性末端，并将它们连接起来形成一个新的DNA分子。
连接后的质粒中含有外源基因的序列，可以在细菌中进行复制和表达。
四、转化转化是指将质粒导入到细菌中的过程。
转化可以通过多种方法实现，例如热激转化、电转化等。
在转化过程中，将含有外源基因的质粒与目标细菌一起处理，使质粒进入到细菌细胞内。
转化后，质粒可以在细菌中进行复制和表达，从而实现对目标基因的研究。
质粒同源重组的原理非常简单，但却是现代基因工程中最常用的技术之一。
通过质粒同源重组，可以将外源基因导入到细菌中，实现对目标基因的表达和研究。
质粒同源重组的成功与否取决于质粒的构建、限制性内切酶的选择、连接酶的连接以及转化的效率等多个因素。
因此，在进行质粒同源重组实验时，需要仔细设计实验方案，确保每一步的操作准确无误。
总结起来，质粒同源重组是一种重要的基因工程技术，通过将外源基因插入到质粒中，实现对目标基因的表达和研究。
质粒同源重组的原理包括质粒的构建、限制性内切酶切割、连接酶连接以及转化等步骤。
重组质粒的作用
重组质粒的作用质粒是细胞质外发生的一种细小的圆环状DNA分子。
在生物技术领域，重组质粒具有广泛的应用，它们可以作为载体用于植入外源基因，进而导致目的基因表达。
以下是围绕“重组质粒的作用”所写的文章，从分步骤阐述其作用。
第一步：制备重组质粒制备重组质粒的第一步是提取质粒DNA，其中包含了从细胞中复制的DNA序列。
同时，人工设计的DNA片段也会被构建，通过高效的DNA连接技术，将重组的DNA片段连接到质粒DNA上，形成一个新的、带有目的性基因的重组质粒。
这种方法可以为生命科学研究和技术开发提供一个有力的手段。
第二步：克隆重组质粒在制备完重组质粒后，还需要将其克隆到宿主细胞中。
细胞质内的质粒可以自我复制，且重组质粒携带的外源基因可以被细胞读取和表达，并可传递给后代。
克隆过程中，人们通常会选择大肠杆菌作为宿主细胞，因为大肠杆菌是一种常用且广泛研究得到的细菌，可以轻松地转化和繁殖重组质粒。
第三步：表达重组蛋白克隆后的重组质粒需要在宿主细胞中表达，以产生所需的目的性蛋白。
在此过程中，质粒绕着核框蛋白的结构形成一个紧凑的DNA螺旋状物，进而参与到基因的表达中。
在表达基因的过程中，基因序列被转录为RNA，随后转化为相应的蛋白质。
人们可以通过分离和纯化蛋白工艺，获得所需的目的性蛋白，并在生命科学及医学领域中得以进一步应用。
综上所述，重组质粒在生物技术领域中具有非常广泛的应用，可以作为基因转移载体，用于植入外源基因，实现特定蛋白的表达，完成诊断或治疗目标。
同时，人们还可以使用这种技术来开发新药、改良传统药物和治疗疾病。
因此，重组质粒将继续为人类医学和生命科学发展做出重要贡献。
ti质粒介导基因转移的过程
ti质粒介导基因转移的过程TI质粒介导基因转移是一种常用的植物基因工程技术，主要应用于将外源基因导入植物细胞中。
以下是TI质粒介导基因转移的基本过程：1. 构建重组质粒：首先，需要构建一个包含目标基因的重组质粒。
这个质粒通常由几个重要部分组成：T-DNA区域、选择标记基因和表达载体。
T-DNA区域是质粒中用于转移基因的DNA片段，其中包含目标基因和相关调控序列。
选择标记基因用于筛选成功转化的植株，通常是与抗性或荧光等特征相关的基因。
表达载体则包含启动子、终止子等元件，用于确保目标基因在植物细胞中正确表达。
2. 农杆菌感染：接下来，将构建好的重组质粒导入农杆菌（常用的是农杆菌株Agrobacterium tumefaciens）。
农杆菌具有天然的基因转移能力，可以将质粒中的T-DNA区域转移到植物细胞中。
3. 植物组织处理：将农杆菌含有重组质粒的培养基与目标植物的组织（如叶片、幼苗等）接触，使农杆菌能够感染植物细胞。
通常会在含有适当激素和营养物质的培养基上进行处理，以促进植物细胞的再生和增殖。
4. 选择和筛选：经过一段时间的培养，将植物组织转移到含有选择标记基因所需的选择剂（如抗生素）的培养基上。
只有成功转化的细胞或组织才能在含有选择剂的培养基上存活和生长，从而实现对转化植株的筛选。
5. 植株再生：经过筛选后，成功转化的细胞或组织将进一步培养和培育，以实现植株的再生。
这可以通过体外培养或组织培养技术来实现。
6. 验证和鉴定：最后，对获得的转化植株进行验证和鉴定。
这包括通过PCR、Southern blotting 等分子生物学方法来确认目标基因的存在，并通过表型观察来确定转基因植株是否具有预期的性状和特征。
通过以上步骤，TI质粒介导基因转移可以实现外源基因的导入和表达，从而为植物基因工程研究和应用提供了重要的工具和方法。
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实验目的1. 学习在实现DNA 体外重组过程中，正确选择合适的载体和限制性内切酶并能用限制性核酸内切酶对载体和目的DNA 进行切割，产生利于连接的合适末端。
2. 学习设计构建重组DNA 分子的基本方法，掌握载体和外源目的DNA 酶切的操作。
3. 学习利用T4 DNA 连接酶把酶切后的载体片段和外源目的DNA 片段连接起来，构建体外DNA 分子的技术，了解并掌握几种常用的连接方式。
4. 掌握利用Cacl 2制备感受态细胞的方法。
5. 学习掌握热击法转化 E.coli 的原理和方法。
6. 学习并掌握使用红白菌落法筛选获得重组子以及α互补筛选法的原理及方法。
7. 学习并掌握使用Omaga 试剂盒抽提质粒的方法及进一步确定重组质粒中含有外源目的DNA 片段。
实验原理：（一）限制性核酸内切酶的酶切反应体外构建重组DNA 分子，首先要了解目的基因的酶切图谱，选用的限制性内切酶不能在目的基因内部有专一的识别位点，否则当用一种或两种限制性内切酶切割外源供体DNA 时不能得到完整的目的基因。
其次要选择具有相应的单一酶切位点质粒或者噬菌体载体分子。
常用的酶切方法有双酶切法和单酶切法两种。
本实验采用单酶切法，即只用一种限制性内切酶切割目的DNA 片段，酶切后的片段两端将产生相同的黏性末端或平末端，再选用同样的限制性内切酶处理载体。
在构建重组子时，除了形成正常的重组子外，还可能出现目的DNA 片段以相反方向插入载体分子中，或目的DNA 串联后再插入载体分子中，甚至出现载体分子自连，重新环化的现象。
单酶切法简单易行，但是后期筛选工作比较复杂。
各种限制性内切酶都有其最佳反应条件，最主要的因素是反应温度和缓冲液的组成。
在双酶切体系中，如果两种酶对盐离子的浓度和温度要求一致，原则上可以将这两种酶同时加入一个反应体系中同步酶切；如果不一致，则酶切反应最好分步进行，常用的酶切顺序是：先低盐后高盐，先低温后高温。
酶切与连接是两个密切相关的步骤，要达到高效率的连接，必须酶切完全，酶切的DNA 数量要适当。
另外，酶切反应的规模也取决于需要酶切的DNA 的量，以及相应的所需酶的量。
一般的，酶切0.2~1.0 μg的DNA 分子时，反应体积约为15~20 μg，DNA 的量越大，反应体积可按比例适当放大。
酶的用量参照标准：一个标准单位酶能在指定的缓冲液系统和温度下，1h 完全酶解1μg 的pBR322 DNA 分子。
如果酶活力低，可以适当增加酶的用量，但是最高不能超过反应总体积的10% 。
因为限制性核酸内切酶一般是保存在50% 甘油的缓冲液中，如果酶切反应体系中甘油的含量超过5% ，就会抑制酶的活性。
（二）载体与外源DNA 的连接反应连接反应总是紧跟酶切反应，外源DNA 片段与载体分子连接的方法即DNA 分子体外重组技术主要依赖限制性核酸内切酶和DNA 连接酶催化完成的。
DNA 连接酶催化两双链DNA 片段相邻的5’-磷酸和3’-OH 间形成磷酸二酯键。
在分子克隆中最有用的DNA 连接酶是来自T4 噬菌体的T4 DNA 连接酶，它可以连接黏性末端和平末端。
连接反应时，载体DNA 和外源DNA 的摩尔数之比控制在1:（1~3 ）之间，可以有效地解决DNA 多拷贝插入的现象。
实际操作中，反应温度介于酶作用速率和末端结合速率之间，一般是16℃，平末端适当提高连接反应温度。
反应时间与温度有关，随温度的提高，反应速度增加，所需时间会相应减少，16℃下最常用的连接时间为12-16h 。
（三）感受态细胞的制备及质粒转化构建好的重组DNA 转入感受态细胞中进行表达的现象就是转化。
能进行转化的受体细胞必须是感受态细胞，即受体细胞最容易接受外源DNA 片段实现转化的生理状态，它决定于受体菌的遗传特性，同时与菌龄、外界环境等因素有关。
人工转化是通过人为诱导的方法使细胞具有摄取DNA 的能力，或人为地将DNA 导入细胞内，该过程与细菌自身的遗传控制无关，常用热击法，电穿孔法等。
能否实现质粒DNA 的转化还与受体细胞的遗传特性有关，所用的受体细胞一般是限制修饰系统的缺陷变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变株。
目前常用的感受态细胞制备方法有CaCl法，制备好的感受态细胞可以加入终浓度为15% 的无2菌甘油，-70 ℃可保存半年至一年。
经过CaCl 2 处理的细胞细胞膜通透性增加，允许外源DNA 分子进入。
在低温下，将携带有外源DNA 片段的载体与感受态细胞混合，经过热击或电穿孔技术，使载体分子进入细胞。
进入受体细胞的外源DNA 分子通过复制、表达，使受体细胞出现新的遗传性状。
将这些转化后的细胞在选择性培养基上培养，即可筛选出重组子。
本实验以 E.coli- DH 5 α菌株为受体细胞，用CaCl 2处理，使其处于感受态，然后将重组后的pUC19 质粒在42 ℃ 下热击90s ，实现转化。
（四）重组子的鉴定与外源基因的表达重组DNA 进入宿主细胞后，必须使用各种筛选与鉴定手段区分转化子（接纳载体或重组DNA 分子的转化细胞）与非转化子（未接纳载体或重组DNA 分子的转化细胞）。
而转化子又分为含有重组DNA 的转化子（重组子）和仅含有空载体分子的转化子（非重组子）。
重组子含有的重组DNA 分子中有期望重组子（含有目的基因的重组子）和非期望重组子（不含有目的基因的重组子）。
本实验中采用的方法是平板筛选法（α互补筛选原理）、电泳筛选法进行初步鉴定，进一步将采用PCR 检测以及酶切验证进行较为准确的鉴定。
利用抗药性筛选原理可筛选出转化子。
质粒pUC19 携带有氨苄青霉素抗性基因（Amp r）, 在含有氨苄青霉素平板上筛选转化子，没有导入质粒pUC19 的受体细胞，在含有氨苄青霉素的平板上不生长。
利用α互补筛选原理可筛选出转化子中的重组子与非重组子。
α互补筛选原理是根据菌落颜色筛选含有重组质粒的转化子。
据菌落颜色筛选含有重组质粒的转化子，利用β-半乳糖苷酶筛选系统来选择。
载体上带有一个来自大肠杆菌的lac 操纵子的DNA 区段，这一区段编码β-半乳糖苷酶氨基端的一个蛋白片段。
IPTG( 异丙基-β-D- 硫代半乳糖苷)可以诱导该片段的合成，而该片段能与宿主细胞所编码的β-半乳糖苷酶羧基端的一个蛋白片段互补(α互补)。
故暴露于诱导物IPTG 的细菌含有编码lac Z 基因的质粒可同时合成该酶的两种片段，该菌在麦康凯培养基上利用乳糖产酸生成红色菌落。
在外源DNA 插人质粒的多克隆位点后，使编码β-半乳糖苷酶氨基端片段的基因失去作用，从而破坏了α互补作用，使重组子菌落显白色。
利用这种筛选方法可方便地将含目的基因的重组子筛选出来。
实验材料1.菌株： E.coli DH 5 α2.培养基：LB 培养基、麦康凯培养基3.试剂材料：酶切反应：（DNA pUC19 质粒，酶切10 ×buffer ，Hin d Ⅲ,重蒸水，λDNA 。
）连接反应：（酶切后的DNA （pUC19 质粒和λ DNA ），连接10 ×buffer ，T4 连接酶，重蒸水。
）感受态细胞的制备：（0.1M CaCl 2 ），冰块。
）转化：（连接液和感受态细胞，0.1M CaCl2琼脂糖电泳：琼脂糖，TAE 缓冲液（50×），上样缓冲液（10 ×），溴化乙锭（EB ）染液。
4.仪器器材：恒温振荡培养箱，高速冷冻离心机，漩涡振荡器，恒温水浴锅，Eppendorf 管，微量移液器，培养皿，三角瓶，酒精灯，量筒，接种环，涂布器，电子天平，微波炉，电泳仪，制胶槽，电泳槽，凝胶成像检测仪，琼脂糖凝胶梳子，手套。
实验步骤（一）载体与外源片段限制性酶切反应1. 在1.5ml 的Eppendorf 管中依次加入酶切反应的各种成分：表1 pUC19 质粒及λDNA 酶切反应体系试剂（用量单位：重蒸水μl）pUC19( 载体)13.0λDNA （目的基因）66.0pUC19 （商品）37.510 ×buffer 2.0 10.0 5.0DNA 3.5 15.0 5.0 Hin d Ⅲ(1.5U/ μl) 1.5 9.0 2.5精品资料总计20.0 100.0 50.0体系混匀后，1000rpm 离心1min ，37 ℃水浴 2 小时2. 电泳检测：10.0 μl样品+2.0 μl loading buffer ，琼脂糖凝胶电泳检测酶切效果。
（二）载体与外源片段连接反应1. 在1.5ml 的Eppendorf 管中依次加入连接反应的各种成分：表2 连接反应体系编号试剂体积/μl1 ddH2O 3.22 10 ×Ligase Buffer 1.03 pUC19DNA/ Hin dⅢ 1.2 （1.0-1.5 ）4 λDNA/ Hin dⅢ 3.8 （3.5-4.4 ）5 T4-DNA 连接酶0.8总计连接体系10.0适当离心，16℃水浴12-16 小时pUC19/ Hin d Ⅲ先60℃水浴10min ，打开自连接，也可使酶备注Hin d Ⅲ失活，然后冰浴，再配置连接体系（三）感受态细胞的制备1.甘油管 E.coli DH5 α（AP S)→接LB 平板（过夜）→37℃，12-16 小时→接单菌落于LB 平板→37 ℃，过夜→划线于AP 平板→37℃，过夜→不生长。
2.LB 平板上挑单菌落至20ml LB 培养基→ 37 ℃ 250rpm 过夜→取1% 转至新20ml LB 培养基→37 ℃ 180rpm 2-3 小时→冰浴10min →收集菌体于两EP 管→菌体离心4000rpm 5min →弃上清→再次补加菌液→离心4000rpm 5min →弃上清→涡旋细胞3.加800 μlCaCl 2 (0.1M) →颠倒混匀→ 4000rpm 离心5min →弃上清→加100 μlCaCl 2轻悬细胞（慢慢敲打）→冰浴20min →最终得到2 管100 μl感受态细胞（四）质粒转化1.将上述制备好的感受态细胞分为三管，分别为50μl,50 μl,100 μl，对三管分别进行一下处理：受体菌对照组：50 μl感受态细胞pUC 质粒对照组：50 μl感受态细胞+ pUC19 质粒DNA 1.0 μl重组质粒转化组：100 μl感受态细胞+ 重组质粒 5.0 μl2.用枪尖缓慢吹打混匀，三管均于冰上放置10min ，在42 ℃水浴中热击90s ，然后迅速置于冰上，质粒已经吸附到感受态细胞的表面，此时不能剧烈振荡，以增加转化效率；3.向上述 3 管中分别加入450 μl(50 μl管）和900 μl（100 μl管）新鲜的LB 培养基，混匀后，37 ℃摇床培养1h，使受体菌恢复正常生长状态。
（五）稀释和涂布平板及重组质粒的初步筛选（AP + 抗性筛选与α互补筛选法）1. 无菌操作，将转化细胞溶液按以下操作涂布平板：⑴受体菌对照组：取50 μl受体菌液分别涂布AP + 和AP -的麦康凯培养基，各 1 个。