重组质粒实验报告
生物大分子实验报告
高级生物化学与分子生物学综合实验报告一、实验目的以特定酶基因在大肠杆菌中的克隆、表达和纯化为主线，进行基因操作、蛋白质表达、亲和层析纯化等的训练，通过集中训练熟练生物化学和分子生物学实验操作，为独立开展研究生课题研究奠定实验基础。
二、实验原理利用基因重组技术，将目的基因与载体质粒DNA在体外进行重组，然后把这种重组DNA转化到感受态细胞，通过一定的诱导条件，使之在受体细胞内增值表达相应的目标蛋白。
为了得到相应的目标蛋白，需要通过亲和层析等手段纯化目标蛋白。
三、实验内容一）内容一：重组质粒的分离、鉴定与转化实验1. 重组质粒的分离、纯化及检测实验2. 质粒的酶切及琼脂糖凝胶电泳回收实验3. 感受态细胞的制备、连接与转化二）内容二：重组蛋白在大肠杆菌中的表达实验4. 细菌的大量培养及重组蛋白的诱导三）内容三：重组蛋白的提取、纯化与鉴定实验5. 细菌的收集、破碎与目标蛋白的纯化实验6. 目标蛋白的SDS-PAGE鉴定实验1 质粒DNA的分离、纯化及检测材料、设备及试剂一、材料转化的细菌，1.5ml塑料离心管,离心管架。
二、设备微量取液器(20μl,200μl,1000μl)，台式高速离心机，恒温振荡摇床，高压蒸汽灭菌锅，涡旋振荡器，电泳仪，琼脂糖平板电泳装置和恒温水浴锅等。
三、试剂1. LB液体培养基(Luria-Bertani) ：称取蛋白胨(Tryptone)5 g，酵母提取物(Yeast extract)2.5g，NaCl 5g，溶于800ml去离子水中，用NaOH调pH至7.5, 加去离子水至总体积500 mL，高压下蒸气灭菌20分钟。
2. LB固体培养基：液体培养基中每升加12g琼脂粉，高压灭菌。
3. 氨苄青霉素(Ampicillin, Amp)母液：配成 50mg/ml水溶液, -20℃保存备。
4. 质粒提取试剂盒。
操作步骤1. 细菌的培养和收集将含有质粒的菌种用无菌牙签挑取平板上的单菌落接种到2-5ml LB液体培养基(含50μg/ml Amp)中，37℃振荡培养约12小时至对数生长后期。
小麦基因育种实验报告
一、实验背景小麦（Triticum aestivum L.）作为全球最重要的粮食作物之一，其产量和品质的提高对于保障全球粮食安全具有重要意义。
近年来，随着分子生物学和基因工程技术的快速发展，小麦基因育种成为研究热点。
本实验旨在通过基因工程技术，将外源抗病基因导入小麦基因组，培育出抗病、高产的小麦新品种。
二、实验材料与方法1. 实验材料- 小麦品种：普通小麦品种“扬麦11号”- 抗病基因：来源于抗病小麦品种“抗病9号”的Rab基因- 重组质粒：含有Rab基因的重组质粒pUC19- 载体菌：大肠杆菌DH5α- 转化试剂：钙离子- 植物细胞培养基：MS培养基2. 实验方法1. 构建重组质粒- 将抗病基因Rab从抗病小麦品种“抗病9号”中克隆到载体质粒pUC19中，构建重组质粒pUC19-Rab。
- 转化大肠杆菌- 将重组质粒pUC19-Rab转化到大肠杆菌DH5α中，筛选阳性克隆。
- 植物细胞培养- 将阳性克隆提取质粒，电转化小麦愈伤组织，筛选阳性愈伤组织。
- 愈伤组织再生- 将阳性愈伤组织诱导分化再生小麦植株。
- 抗病性鉴定- 将再生植株接种白粉病菌，观察植株抗病性。
- 分子鉴定- 对抗病植株进行PCR扩增，检测Rab基因插入情况。
三、实验结果与分析1. 构建重组质粒成功构建了含有抗病基因Rab的重组质粒pUC19-Rab。
2. 转化大肠杆菌转化效率达到90%以上，获得阳性克隆。
3. 植物细胞培养成功诱导出阳性愈伤组织，再生出小麦植株。
4. 抗病性鉴定部分再生植株表现出较强的抗病性，抗病率约为60%。
5. 分子鉴定PCR扩增结果显示，部分再生植株中含有Rab基因。
四、实验结论本实验成功地将抗病基因Rab导入小麦基因组，获得了抗病、高产的小麦新品种。
这为小麦基因育种提供了新的思路和方法，有助于提高小麦产量和品质，保障粮食安全。
五、实验讨论1. 重组质粒构建成功，转化效率较高，表明实验方法可行。
2. 部分再生植株表现出较强的抗病性，说明抗病基因Rab已成功导入小麦基因组。
实验六质粒提取重组质粒鉴定
实验六质粒提取重组质粒鉴定实验六、质粒提取、重组质粒鉴定【实验目的】学习并掌握重组质粒鉴定技术。
【实验原理】限制性内切酶是在细菌对噬菌体的限制和修饰现象中发现的。
限制性内切酶主要分三类，其中Ⅱ型限制性内切酶，具有识别双链DNA 分子上的特异核苷酸序列的能力，能在特异性核苷酸序列内，切断DNA的双链，形成一定长度和顺序的DNA片段。
限制性内切酶对环状质粒DNA有多少切口，就能产生多少个酶解片段，因此鉴定酶切后的片段在电泳凝胶中的区带数，就可以推断酶切口的数目。
用已知相对分子质量的线状DNA为对照，从片段的迁移率可以大致判断酶切片段大小。
我们已知重组质粒的大小、酶切位点的数量和位置，经酶切后，若电泳结果的DNA片段数量和大小均与预期相符，则鉴定为正确重组的质粒。
【实验步骤】一、质粒DNA的提取1）挑取白色单克隆菌落接种于含菌种相应抗性的LB液体培养基中，250rpm，37℃摇床培养过夜；2）用EP管收集3ml菌液（可分多次操作），12,000rpm离心1min收集菌体，弃上清；3）加入250μl Solution I，枪反复吹打混匀或涡旋混匀以重悬菌体（重悬）；4）加入250μl Solution II，上下颠倒4~6次轻轻混匀，室温下静置2~5min至溶液澄清（裂解）；5）加入350μl Solution III，上下颠倒轻轻混匀，至白色沉淀不再析出，12,000rpm离心10min（沉淀）；6）置柱子到收集管中，将离心后的上清液加入柱子中，12,000rpm，1min；7）弃滤过液，柱子中加入500μl HB Buffer，12,000rpm，1min；8）弃滤过液，柱子中加入700μl Wash Buffer，12,000rpm，1min；9）重复上述步骤（8）一次；10）弃滤过液，12,500rpm，1min，空甩柱子，以干燥柱床；11）弃收集管，将柱子置于1.5ml EP管上，在柱床上中加入40μl 无菌水，室温静置2min，13,000rpm，2min以洗脱DNA；12）弃柱子，测定浓度后-20℃保存。
分子医学实验：实验四 重组质粒DNA提取及双酶切鉴定1
实验步骤：
Molecular medicine Skills
裂解细菌、释放质粒DNA
加1.5ml培养物于EP管，12000rpm×30s（可重复一次）
去上清（除净），加入100ml 溶液I（冰），充分重悬
加入200ml 溶液II，立即、轻柔振荡数次
加入150ml 溶液III（冰），震荡10s，冰浴3~5min， 12000rpm×10min
8
Molecular medicine Skills
② 开环DNA(open circular DNA,OC DNA)
如果两条链中有一条的一处或多处断裂，分子就发生旋 转而消除链的张力，形成松弛型的环状分子。
9
Molecular medicine Skills
③ 线状DNA(linear DNA，L DNA):
碱法抽提质粒的主要溶剂
Molecular medicine Skills
溶液Ⅰ：由葡萄糖、EDTA、Tris•Cl组成. – 葡萄糖的作用是增加溶液的粘度,减少抽提过 程中的机械剪切作用,防止破坏质粒. – EDTA 的作用是络合掉镁等二价金属离子,防 止DNA酶对质粒分子的降解作用。 – Tris•Cl能使溶菌液维持溶菌作用的最适PH 范围
SDS碱裂解法制备质粒DNA的原理：
在有EDTA、溶菌酶及SDS存在的条件下，用 碱处理细菌，可以使细菌的细胞壁破裂，释放出细 胞内容物（染色体DNA、蛋白质和RNA等）。
强碱环境可以使细菌线性分子染色体DNA氢 键断裂，双链解开变性，而质粒DNA的超螺旋共 价闭合环状的双链并不完全分离。
再加入高浓度酸性盐
转移上清到新EP管，加入2倍体积乙醇（约900ml）混匀，冰浴15min
离心12000rpm×10min
分子生物学实验报告
分子生物学实验报告重组质粒的pcr验证（目的基因的pcr扩增）姓名:xxx学号：xxx专业：xxx界别：xxx同组者：xxxx一．实验目的（1）自学掌控pcr反应的基本原理和实验技术。
（2）了解引物设计的基本要求。
1.pcr基本原理聚合酶链式反应(polymerasechainreaction)，简称pcr，是一种分子生物学技术，用于在体外快速扩增dna，类似dna的细胞内复制过程:由一对引物介导，通过温度的调节，使双链dna变性为单链dna、单链dna能与引物复性（退火）成为引物-dna单链复合物、以及在dntps存在下dna聚合酶能使引物沿单链模板延伸成为双链dna（引物的延伸）；这种热变性-复性-延伸的过程，就是一个pcr循环；一般通过20-30个循环之后，就可获得大量的要扩增的dna片段。
pcr技术的基本原理类似dna的天然激活过程，其特异性依赖与靶序列两端优势互补的寡核苷酸引物。
pcr由变性--淬火--延展三个基本反应步骤形成：①模板dna的变性：模板dna经加热至90~95℃左右一定时间后，使模板dna双链或经pcr扩增形成的双链dna解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；②模板dna与引物的淬火(复性)：模板dna经冷却变性成单链后，温度降到55℃左右，引物与模板dna单链的优势互补序列接合融合；③引物的延伸：dna模板--引物结合物在taqdna聚合酶的作用下，以dntp为反应原料，靶序列为模板，按碱基互补配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板dna链互补的复制链。
经过“变性—淬火—延展”三个过程就可以赢得代莱dna分子，而且这种崭新dna分子又可以沦为下次循环的模板。
因此，变性、淬火和延展循环反复25~30次后，即可从少量的模板dna中扩充出来大量的目的产物。
pcr引物设计的目的是为了找到一对合适的核苷酸片段，使其能有效地扩增模板dna序列，因此，引物的优劣直接关系到pcr的特异性与成功与否。
重组质粒的转化
重组质粒的转化实验五重组质粒的转化【实验目的】通过本实验，掌握重组质粒的转化方法和原理。
【实验原理】经CaCl2法制备的感受态细胞膜的通透性发生改变，外源DNA附着于细胞膜表面，经42℃短时间热击处理，促进细胞吸收DNA复合物。
本实验采用大肠杆菌DH5α菌株感受态细胞，与以上实验所得重组连接的质粒载体共保温实现转化。
【实验步骤】1. 取100 μL 新鲜配制的感受态细胞，加入实验四所得重组质粒DNA10 μL (50 ng）轻轻混匀，冰上静置30 min。
2. 超净台上操作：在预制的含有氨苄青霉素（50μg／mL ）的LB 琼脂平板上，加40μL 20 mg/mL的X-gal 和16μL50 mg/mL的IPTG 溶液，并用之前已灭菌的涂布器均匀涂布于LB培养基表面，37℃温箱中放置30 min （正放）。
3. 将第一步静置后装有感受态细胞的1.5 mL EP管放到42 ℃水浴锅中，热激90sec （必须准确）。
4. 从水浴锅中取出EP管，立即冰浴2 min 。
5. 超净台上操作：每管加500μL 室温LB液体培养基（轻轻混匀），37 ℃温育45 min ，130rpm 慢摇。
6. 超净台上操作：将第4步的产物取出，3500rpm，离心2min。
弃约500 μL上清（用枪吸），将剩余菌液轻轻吹打混匀涂在含有氨苄青霉素（50μg／mL ）的LB平板上，晾至液体被吸收。
7. 倒置平皿37 ℃培养12-16h ，出现菌落。
培养皿上的会长出蓝色和白色菌落，其中白色菌落为含有重组DNA 质粒的菌落【结果与分析】经培养后，转化培养皿上生长着很多白色菌落和蓝色菌落，白色菌落为含有DNA 重组质粒。
阴性对照没有菌落，阳性对照长有大量白色菌落。
经过蓝白斑筛选后，正对照长出的菌落较多全部为白斑，有的地方连成一片，可能是由于涂板时没有涂均匀。
试验中做的LB平板蓝白斑间隔分布，蓝斑体积较小。
所有转化平板都长有蓝斑，说明我们的X-gal涂布比较均匀。
(完整word版)重组质粒实验报告
重组质粒的构建、转化、筛选和鉴定实验目的：学习在实现DNA体外重组过程中，正确选择合适的载体和限制性内切酶并能对限制性核酸内切酶对载体和目的DNA进行切割，产生利于连接的合适末端。
学习设计构建重组DNA分子的基本方法，掌握载体和外源目的DNA酶切的操作。
学习利用T4DNA连接酶把酶切后的载体片段和外源目的DNA片段连接起来，构建体外DNA 分子的技术，了解并掌握几种常用的连接方式。
掌握利用Cacl2 感受态细胞的方法。
学习掌握热击法转化E.coli的原理和方法。
掌握α互补筛选法和PCR检测法筛选重组子的方法。
并鉴定体外导入目的DNA片段的大小。
学习和掌握PCR反应的基本原理和操作技术，了解引物设计的基本要求。
实验原理：外源DNA与载体分子的连接即为DNA重组技术，这样重新组合的DNA分子叫做重组子。
重组的DNA分子式在DNA连接酶的作用下，有Mg2+、ATP存在的连接缓冲系统中，将分别经限制性内切酶酶切的载体分子和外源DNA分子连接起来。
将重组质粒导入感受态细胞中，将转化后的细胞在选择性培养基中培养，可以通过α互补筛选法筛选出重组子，并可通过酶切电泳及PCR检验的方法进行重组子的鉴定。
重组子的构建酶切时首先要了解目的基因的酶切图谱，选用的限制性内切酶不能目的基因内部有专一的识别位点，否则当用一种或两种限制性内切酶切割外源工体DNA时不能得到完整的目的基因。
其次要选择具有相应的单一酶切位点质粒或者噬菌体载体分子。
常用的酶切方法有双酶切法和单酶切法两种。
本实验采用单酶切法，即只用一种限制性内切酶切割目的DNA片段，酶切后的片段两端将产生相同的黏性末端或平末端，再选用同样的限制性内切酶处理载体。
在构建重组子时，除了形成正常的重组子外，还可能出现目的DNA片段以相反方向插入载体分子中，或目的DNA串联后再插入载体分子中，甚至出现载体分子自连，重新环化的现象。
单酶切法简单易行单是后期筛选工作比较复杂。
各种限制性内切酶都有去最佳反应条件，最主要的因素是反应温度和缓冲液的组成，在双酶切体系中，限制性内切酶在使用时应遵循“先低盐后高盐，先低温后高温”的原则进行反应。
重组质粒DNA的提取及酶切鉴定
实验七重组质粒DNA的提取及酶切鉴定【实验原理】分离制备质粒DNA的方法很多，其中常用的方法有碱裂解法、煮沸法、SDS法、羟基磷灰石层析法等。
在实际操作中可以根据宿主菌株类型、质粒分子大小、碱基组成和结构等特点以及质粒DNA的用途进行选择。
本实验采用SDS碱裂解法提取重组质粒DNA，十二烷基磺酸钠（SDS）是一种阴离子表面活性剂，它既能使细菌细胞裂解，又能使一些蛋白质变性。
限制性内切酶能特异地结合于一段被称为限制性酶识别序列的DNA序列之内或其附近的特异位点上,并切割双链DNA。
限制性内切酶识别序列长度一般为4～8个呈回文序列的特异核苷酸对。
由于限制性内切酶的切割特性不同，分子生物学中主要用到Ⅱ型限制性内切酶（切割位置在识别序列内部）。
对质粒进行酶切，通过跑胶观察片段大小，从而鉴定质粒。
【实验步骤】本次实验所用的质粒提取试剂盒为天根的质粒小提试剂盒，操作步骤按说明书进行。
1. 吸附柱中加500ul 平衡液(BL)，12000rpm离心1min ，弃收集管中的液体。
2.取1.5ml菌液至2ml离心管中，12,000rpm离心1min，弃上清。
3. 加250ul solution Ⅰ（P1），vortex。
4. 加250 solution Ⅱ（P2），上下颠倒混匀。
操作时间不能超过5min 注：此步骤不宜超过5 min。
5. 加350 solution Ⅲ（P3），立即颠倒混匀几次。
12000rpm离心10min。
6. 吸取上清加入吸附柱中，尽量不要吸出沉淀12000rpm离心1min ，弃收集管中的液体。
注：此时4℃离心不利于沉淀沉降。
7. 加入600μL漂洗液（PW）于离心吸附柱中，12000rpm离心1min ，倒掉废液。
8. 重复上一步，9. 空管离2min。
将吸附柱放入1.5ml离心管中，在超净台中晾5min。
10. 将700 μl的Rinse B加入Spin Column中，12,000 rpm离心30 sec，弃滤液。
重组质粒的酶切和PCR验证
重组质粒的酶切和PCR验证⼭东⼤学实验报告 2013年 11 ⽉26⽇⾄12⽉10⽇姓名系年级 2011级⽣物技术组别四科⽬分⼦实验同组者学号题⽬重组质粒的酶切和PCR验证⼀、【实验题⽬】重组质粒的酶切和PCR验证⼆、【实验⽬的】1.学习和掌握PCR反应的基本原理和实验技术。
2.了解引物设计的基本要求。
3.复习凝胶电泳进⾏DNA分离纯化的⽅法。
4.复习DNA的酶切操作技术。
三、【实验试剂及器材】试剂：Hin d III 、酶切Buffer、Hin d Ⅲ、ddH2O、琼脂糖，TAE缓冲液、Loading Buffer、EB 染液、PCR buffer，dNTPs，Taq DNA聚合酶，引物器材：枪和枪尖、1.5 ml的Ep管、电泳仪、PCR反应⼩管四、【实验原理】1.PCR技术原理PCR (po lymerase chain react ion) 中⽂译为聚合酶链式反应或体外扩增技术, 是1985 年美国Cetus 公司⼈类遗传部、加利福尼亚⼤学洛杉机分校和How ghes 医院等联合建⽴的⼀项⽣物技术. 其原理类似于天然DNA 的复制, 在模板DNA、引物和4 种dN TP 等存在的条件下,依赖于DNA 聚合酶(Taq 酶) 的酶促合成反应. 其具体反应分三步: 变性、退⽕、聚合. 以上三步为⼀个循环, 如图1. 每⼀循环的产物DNA ⼜可以作为下⼀个循环的模板, 数⼩时后, 介于两个引物之间的⽬的DNA 得到⼤量的复制, 经过25～ 30 次循环, DNA 数量可达2×106-7拷贝数。
PCR基本原理是以单链DNA为模板，4种dNTP为底物，在模板3’末端有引物存在的情况下，⽤酶进⾏互补链的延伸，多次反复的循环能使微量的模板DNA得到极⼤程度的扩增。
在微量离⼼管中，加⼊与待扩增的DNA⽚段两端已知序列分别互补的两个引物、适量的缓冲液、微量的DNA膜板、四种dNTP溶液、耐热Taq DNA聚合酶、Mg2+等。
载体构建连接实验报告(3篇)
第1篇一、实验目的本次实验旨在通过载体构建和连接技术，将目的基因与载体成功连接，构建一个含有目的基因的重组质粒。
此实验是基因工程中的重要步骤，对于后续的基因表达、蛋白质纯化等研究具有重要意义。
二、实验原理载体构建连接实验主要包括以下几个步骤：1. 目的基因的获取：通过PCR扩增或化学合成等方法获得目的基因。
2. 载体的选择与制备：选择合适的载体，并对其进行酶切处理，制备线性化载体。
3. 目的基因与载体的连接：利用DNA连接酶将目的基因与线性化载体连接，形成重组质粒。
4. 重组质粒的筛选与鉴定：通过PCR、酶切分析等方法筛选出含有目的基因的重组质粒。
三、实验材料1. 实验试剂：PCR引物、dNTPs、DNA聚合酶、限制性内切酶、DNA连接酶、T4 DNA聚合酶、Klenow片段、碱性磷酸酶（CIP）、质粒提取试剂盒、DNA纯化试剂盒等。
2. 实验仪器：PCR仪、电泳仪、凝胶成像系统、移液器、离心机、超净工作台等。
3. 实验材料：目的基因模板、载体质粒、感受态细胞等。
四、实验方法1. 目的基因的获取：根据目的基因的序列设计PCR引物，进行PCR扩增。
2. 载体的选择与制备：选择合适的载体，用限制性内切酶进行酶切处理，制备线性化载体。
3. 目的基因与载体的连接：a. 将目的基因和线性化载体进行PCR扩增，获得双链DNA。
b. 用Klenow片段或T4 DNA聚合酶将PCR产物进行末端修复，使末端具有3'-羟基。
c. 用CIP处理线性化载体，去除5'-磷酸基团。
d. 将目的基因和线性化载体进行连接反应，加入DNA连接酶。
e. 将连接产物进行PCR扩增，验证连接成功。
4. 重组质粒的筛选与鉴定：a. 将连接产物转化感受态细胞，涂布于含抗生素的琼脂平板上。
b. 在37℃恒温箱中培养过夜。
c. 挑取单菌落进行PCR扩增，验证重组质粒的存在。
d. 对重组质粒进行酶切分析，确认目的基因已插入载体。
24 生物化学实验--重组质粒的构建
重组质粒的构建【目的】1. 验证基因工程的基本理论和聚合酶联链反应的基本原理。
2. 熟悉重组质粒的构建和利用聚合酶联链反应法获取目的基因的方法。
3. 了解 PCR 仪的使用方法。
【原理】1.DNA 的分离与纯化原理基因组 DNA 因来源不同、性质不同以及用途不同，其分离纯化的方法也不相同。
哺乳动物细胞基因组 DNA 的分离与纯化的方法主要有酚抽提法、甲酰胺解聚法、玻棒缠绕法以及各种快速方案。
本实验以哺乳动物细胞为例，介绍制备高分子量DNA 样品的酚抽提法。
酚抽提法可用于多种来源标本的高分子量 DNA 样品的制备，包括单层培养细胞、悬浮生长细胞、新鲜的组织以及血液标本等。
本实验所用的酚抽提法源自对 1976 年 Stafford 及其同事提出的方案的改进。
它以含 EDTA 、 SDS 及 RNA 酶（无 DNA 酶）的裂解缓冲液裂解细胞，经蛋白酶 K 处理后，用 pH8.0 的 Tris 饱和酚进行抽提，离心分层后，蛋白质因变性位于有机相与水相的界面，而 DNA 进入水相，重复抽提 DNA 至一定纯度，根据不同需要进行透析或沉淀处理，获得所需范围的高分子量 DNA 样品。
分离过程中 EDTA 为二价金属离子螯合剂，可以抑制 DNA 酶的活性，同时降低细胞膜的稳定性。
SDS 为生物阴离子去垢剂，主要引起细胞膜的降解并能乳化脂质和蛋白质 ,SDS 与这些脂质和蛋白质的结合可以使它们沉淀 ,SDS 的非极性端与膜磷脂结合，极性端使蛋白质变性和降解，所以 SDS 同时还有降解 DNA 酶的作用。
无 DNA 酶的 RNA 酶可以有效水解 RNA ，而避免 DNA 的消化。
蛋白酶 K 则有水解蛋白质的作用，可以消化 DNA 酶和 DNA 上的蛋白质，也有裂解细胞的作用。
酚可以使蛋白质变性沉淀，也可抑制 DNA 酶的活性。
pH8.0 的Tris 缓冲液能保证抽提后 DNA 进入水相，而避免滞留于蛋白质层。
多次抽提，可提高 DNA 的纯度。
质粒重组实验报告
质粒重组实验报告质粒重组实验报告引言：质粒重组是一种重要的实验技术，可以将外源基因导入到宿主细胞中，用于研究基因功能、蛋白质表达等方面。
本实验旨在通过质粒重组技术，将外源基因成功导入到大肠杆菌中，并通过酶切、连接、转化等步骤验证重组质粒的构建。
材料与方法：1. 外源基因：选择了编码了绿色荧光蛋白（GFP）的质粒pGFP。
2. 宿主细胞：采用大肠杆菌作为宿主细胞。
3. 酶切酶：使用限制酶EcoRI和BamHI进行酶切反应。
4. 连接酶：使用T4 DNA连接酶进行连接反应。
5. 培养基：含有抗生素的LB培养基。
实验步骤：1. 酶切反应：将pGFP质粒和EcoRI、BamHI酶切酶按照指定条件进行酶切反应，以得到线性化的质粒和目标基因片段。
2. 连接反应：将线性化的质粒和目标基因片段加入连接酶缓冲液中，按照指定条件进行连接反应，形成重组质粒。
3. 转化：将重组质粒加入含有大肠杆菌的培养基中，通过热激转化法使质粒进入细胞。
4. 筛选：将转化后的细胞均匀涂布在含有抗生素的LB平板上，筛选出含有重组质粒的菌落。
5. 验证：通过PCR、酶切等方法对筛选出的菌落进行验证，确认质粒重组成功。
结果与讨论：经过酶切、连接、转化等步骤，成功构建了质粒重组实验系统。
在LB平板上筛选出了多个抗生素耐受的菌落，表明转化成功。
通过PCR验证，检测到了目标基因片段的特异扩增带，证明重组质粒中成功导入了外源基因。
进一步进行酶切验证，发现重组质粒经过连接反应后，酶切位点发生改变，与未连接的质粒有明显差异。
这些结果表明，质粒重组实验成功构建了重组质粒，并将外源基因导入到大肠杆菌中。
质粒重组实验的成功对于基因功能研究和蛋白质表达具有重要意义。
通过重组质粒，可以将外源基因导入到宿主细胞中，进而研究其在生物体内的功能和表达情况。
例如，可以通过重组质粒实现基因敲除、基因表达调控等功能，从而深入了解基因在生物体内的作用机制。
同时，重组质粒还可以用于蛋白质表达，通过外源基因的转录和翻译，使宿主细胞产生目标蛋白质，用于研究其结构、功能等方面。
基因重组实验报告
一、实验目的1. 掌握基因重组的基本原理和方法；2. 熟悉基因重组实验的操作步骤；3. 通过实验，了解基因重组在遗传学研究和育种中的应用。
二、实验原理基因重组是指在生物体进行有性生殖过程中，控制不同性状的基因的重新组合。
基因重组是生物变异的重要来源之一，对生物的进化具有重要意义。
基因重组主要有两种类型：同源重组和非同源重组。
同源重组是指两个同源染色体上的相应位点发生交换，导致基因的重新组合。
非同源重组是指非同源染色体上的相应位点发生交换，导致基因的重新组合。
本实验采用同源重组的方法，以大肠杆菌为实验材料，通过构建重组质粒，观察重组质粒的筛选和鉴定。
三、实验材料1. 大肠杆菌菌株：E. coli DH5α；2. 质粒载体：pUC19；3. 酶切酶：限制性内切酶EcoRI、HindIII；4. DNA连接酶；5. 载体DNA和目的基因DNA；6. 感受态细胞；7. 抗生素；8. 培养基；9. 其他试剂：氯化钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、氢氧化钠、氢氧化铵等。
四、实验步骤1. 构建重组质粒（1）将目的基因DNA和载体DNA分别用限制性内切酶EcoRI和HindIII进行酶切；（2）将酶切后的目的基因DNA和载体DNA连接；（3）将连接产物转化感受态细胞；（4）在含有抗生素的培养基上筛选阳性克隆。
2. 阳性克隆的鉴定（1）提取阳性克隆的质粒DNA；（2）用限制性内切酶EcoRI和HindIII对质粒DNA进行酶切；（3）观察酶切后的质粒DNA是否与预期结果一致。
3. 重组质粒的测序（1）将阳性克隆的质粒DNA进行测序；（2）分析测序结果，验证重组质粒的正确性。
五、实验结果与分析1. 阳性克隆的筛选在含有抗生素的培养基上，成功筛选到阳性克隆。
2. 阳性克隆的鉴定通过酶切实验，验证阳性克隆的质粒DNA与预期结果一致。
3. 重组质粒的测序测序结果显示，重组质粒与预期基因序列一致，验证了实验的成功。
六、实验结论本实验通过基因重组技术，成功构建了重组质粒。
重组质粒的转化实验报告
重组质粒的转化实验报告
一、实验目的
本实验旨在构建重组质粒，以提高转录和表达的效率。
二、实验原理
重组质粒技术是一种细胞分子遗传学技术，它可以将一种特定的DNA片段插入另一种特定的质粒中，以改变质粒的表达模式。
它的基本原理是利用酶切，将特定的DNA片段插入质粒中，然后将其复制到另一个质粒中，从而改变质粒的表达模式。
三、实验步骤
1. 提取质粒：首先，使用适当的抗性菌株（如E.coli）提取质
粒DNA，使用特定的质粒提取试剂提取质粒DNA；
2. 克隆DNA片段：使用PCR技术，将要插入质粒中的DNA
片段克隆到另一个质粒中；
3. 制备重组质粒：将克隆的DNA片段插入质粒中，使用特定
的酶切试剂，完成重组质粒的制备；
4. 测序：使用测序仪，测试重组质粒的序列，以确保重组质粒的正确性。
四、实验结果
1. 质粒提取：成功提取质粒，提取的质粒DNA纯度达到99%以上；
2. 克隆DNA片段：成功克隆目标DNA片段，PCR扩增结果与理想结果一致；
3. 重组质粒制备：重组质粒制备成功，酶切结果与理想结果一致；
4. 测序：重组质粒的序列与理想序列一致，证明重组质粒制备成功。
五、结论
本次实验成功地构建了重组质粒，从。
分子实验学报告-重组质粒的酶切鉴定及PCR实验
分子实验学报告-重组质粒的酶切鉴定及PCR实验第三次分子生物学实验报告重组质粒的酶切鉴定及PCR实验一、实验目的1、通过酶切鉴定重组质粒的插入片段的大小；2、学习并掌握PCR技术的原理和基本操作。
二、实验原理1、重组质粒酶切鉴定将含有外源DNA的转化子的E.coliDH5α菌株进行培养，并用试剂盒提取其质粒DNA，将所提取的DNA用切pUC19质粒的同一种限制性内切酶进行切割以验证所插入的外源DNA的大小。
2、PCR原理PCR（Polymerase Chain Reaction）即聚合酶链式反应是1986 年由Kallis Mullis 发现。
这项技术已广泛地应用于分子生物学各个领域，它不仅可用于基因分离克隆和核酸序列分析，还可用于突变体和重组体的构建，基因表达调控的研究，基因多态性的分析等方面。
本次实验旨在通过学习和掌握PCR反应的基本原理和实验技术，以验证重组质粒插入片段大小。
（1）聚合酶链式反应原理CR是一种利用两种与相反链杂交并附着于靶DNA两侧的寡核苷酸引物，经酶促合成特异的DNA 片段的体外方法。
反应过程由高温变性，低温退火和适温延伸等几步反应组成一个循环，然后反复进行，使目的的DNA 得以迅速扩增。
置待扩增DNA 于高温下解链成为单链DNA 模板，人工合成的两个寡核苷酸引物在低温条件下分别与目的片段两侧的两条链互补结合，DNA聚合酶在72℃将单核苷酸从引物3'端开始掺入，沿模板5'—3'方向延伸，合成DNA 新链。
由于每一循环所产生的DNA均能成为下一次循环的模板，所以PCR 产物以指数方式增加，经25—30次周期之后，理论上可增加109倍，实际上可增加107倍。
PCR 技术具有操作简便、省时、灵敏度高特异性强和对原始材料质量要求低等优点，但由于所用的TaqDNA 聚合酶缺乏5'—3'核酶外切酶活性，不能纠正反应中发生的错误核苷酸掺入，估计每9000个核苷酸会导致一个掺入错误，但是错误掺入的碱基有终止链延伸的作用倾向，使得错误不会扩大。
重组质粒实验报告(DOC)
重组质粒的构建、转化、筛选和鉴定实验目的：学习在实现DNA体外重组过程中，正确选择合适的载体和限制性内切酶并能对限制性核酸内切酶对载体和目的DNA进行切割，产生利于连接的合适末端。
学习设计构建重组DNA分子的基本方法，掌握载体和外源目的DNA酶切的操作。
学习利用T4DNA连接酶把酶切后的载体片段和外源目的DNA片段连接起来，构建体外DNA 分子的技术，了解并掌握几种常用的连接方式。
掌握利用Cacl2 感受态细胞的方法。
学习掌握热击法转化E.coli的原理和方法。
掌握α互补筛选法和PCR检测法筛选重组子的方法。
并鉴定体外导入目的DNA片段的大小。
学习和掌握PCR反应的基本原理和操作技术，了解引物设计的基本要求。
实验原理：外源DNA与载体分子的连接即为DNA重组技术，这样重新组合的DNA分子叫做重组子。
重组的DNA分子式在DNA连接酶的作用下，有Mg2+、ATP存在的连接缓冲系统中，将分别经限制性内切酶酶切的载体分子和外源DNA分子连接起来。
将重组质粒导入感受态细胞中，将转化后的细胞在选择性培养基中培养，可以通过α互补筛选法筛选出重组子，并可通过酶切电泳及PCR检验的方法进行重组子的鉴定。
重组子的构建酶切时首先要了解目的基因的酶切图谱，选用的限制性内切酶不能目的基因内部有专一的识别位点，否则当用一种或两种限制性内切酶切割外源工体DNA时不能得到完整的目的基因。
其次要选择具有相应的单一酶切位点质粒或者噬菌体载体分子。
常用的酶切方法有双酶切法和单酶切法两种。
本实验采用单酶切法，即只用一种限制性内切酶切割目的DNA片段，酶切后的片段两端将产生相同的黏性末端或平末端，再选用同样的限制性内切酶处理载体。
在构建重组子时，除了形成正常的重组子外，还可能出现目的DNA片段以相反方向插入载体分子中，或目的DNA串联后再插入载体分子中，甚至出现载体分子自连，重新环化的现象。
单酶切法简单易行单是后期筛选工作比较复杂。
各种限制性内切酶都有去最佳反应条件，最主要的因素是反应温度和缓冲液的组成，在双酶切体系中，限制性内切酶在使用时应遵循“先低盐后高盐，先低温后高温”的原则进行反应。
重组质粒实验报告
重组质粒的构建、转化、筛选和鉴定实验目的：学习在实现 DNA 体外重组过程中，正确选择合适的载体和限制性内切酶并能对限制性核酸内切酶对载体和目的DNA 进行切割，产生利于连接的合适末端。
学习设计构建重组 DNA 分子的基本方法，掌握载体和外源目的DNA 酶切的操作。
学习利用 T4DNA 连接酶把酶切后的载体片段和外源目的DNA 片段连接起来，构建体外 DNA分子的技术，了解并掌握几种常用的连接方式。
掌握利用 Cacl2 感受态细胞的方法。
学习掌握热击法转化 E.coli 的原理和方法。
掌握α 互补筛选法和PCR 检测法筛选重组子的方法。
并鉴定体外导入目的 DNA 片段的大小。
学习和掌握 PCR 反应的基本原理和操作技术，了解引物设计的基本要求。
实验原理：外源 DNA 与载体分子的连接即为DNA 重组技术，这样重新组合的DNA 分子叫做重组子。
重组的 DNA 分子式在 DNA 连接酶的作用下，有 Mg2+ 、ATP 存在的连接缓冲系统中，将分别经限制性内切酶酶切的载体分子和外源DNA 分子连接起来。
将重组质粒导入感受态细胞中，将转化后的细胞在选择性培养基中培养，可以通过α 互补筛选法筛选出重组子，并可通过酶切电泳及 PCR 检验的方法进行重组子的鉴定。
重组子的构建酶切时首先要了解目的基因的酶切图谱，选用的限制性内切酶不能目的基因内部有专一的识别位点，否则当用一种或两种限制性内切酶切割外源工体DNA 时不能得到完整的目的基因。
其次要选择具有相应的单一酶切位点质粒或者噬菌体载体分子。
常用的酶切方法有双酶切法和单酶切法两种。
本实验采用单酶切法，即只用一种限制性内切酶切割目的DNA 片段，酶切后的片段两端将产生相同的黏性末端或平末端，再选用同样的限制性内切酶处理载体。
在构建重组子时，除了形成正常的重组子外，还可能出现目的DNA 片段以相反方向插入载体分子中，或目的 DNA 串联后再插入载体分子中，甚至出现载体分子自连，重新环化的现象。
实验8重组质粒的转化及筛选
实验8重组质粒的转化及筛选实验⼋、重组质粒的转化及筛选转化（transformation）：是将异源DNA分⼦引⼊受体细胞，使其获得新的遗传性状的⼀种技术⽅法。
进⼊细胞的DNA分⼦通过复制表达，才能实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。
热激转化将⼤肠杆菌感受态细胞与待转化的DNA样品⼩⼼混合均匀，置于冰上约10min，使DNA充分粘附于细胞表⾯，经42℃短时间热激处理，促进细胞吸收DNA样品。
将已转化处理的细胞置于⽆选择压⼒的培养基中保温⼀段时间，然后涂布于有选择压⼒的平板培养基上，获得重组⼦。
实验材料DNA材料：连接产物、质粒pQE30-EGFP；感受态细胞：⼤肠杆菌DH5α；培养基：LB抗⽣素：AMP（氨苄青霉素），在培养基冷却到60℃以下添加，添加量为1/1000。
已灭菌的EP管操作步骤1.从冰箱取出的感受态细胞放置冰上融化，分别取100µl转移到2⽀已灭菌的1.5ml离⼼管中，分别加⼊质粒1µl、连接产物10µl，温和混匀，冰上放置5~10min；2.热激处理：将EP管置于42℃恒温⽔浴锅中，保温90秒，不要摇动，然后迅速转移到碎冰块中，冷却1~2分钟。
3.往EP管中加⼊500µl新鲜LB培养液（37℃预热），37℃，培养30min~60min（注：转纯质粒可省略，转连接产物需进⾏）。
4.取100~150µL细胞（可离⼼，重悬）涂布于含有抗⽣素的LB平板上，室温放置3~5分钟。
5.37℃培养12~16h（过夜）；然后把培养箱温度调⾄30℃培养3~4h，观看EGFP基因表达情况。
转化实验流程感受态细菌100µl 质粒1 µl冰浴中10′混匀420C⽔浴90′冰浴1-2 ′加⼊500 l LB370C培养30′涂板培养过夜勿动热激＋⽤CaCl法制备的感受态细胞，可使每微克超2螺旋质粒DNA产⽣5 106-2 107个转化菌落。
实验报告构建重组质粒(3篇)
第1篇一、实验目的1. 学习DNA体外重组技术的原理和方法。
2. 掌握重组质粒的构建、转化、筛选和鉴定技术。
3. 熟悉实验操作步骤和注意事项。
二、实验原理DNA体外重组技术是指将外源DNA片段与载体DNA片段在体外进行连接，形成重组DNA分子的技术。
通过该技术，可以将外源基因导入宿主细胞，实现基因表达和功能研究。
三、实验材料1. 载体：pUC19质粒2. 目的基因：基因片段3. 限制性核酸内切酶：EcoRI、BamHI4. DNA连接酶：T4 DNA连接酶5. DNA聚合酶：Klenow片段6. 琼脂糖凝胶电泳试剂7. DNA标记物8. 转化试剂：CaCl2、SDS、乙醇9. 受体细胞：大肠杆菌DH5α四、实验步骤1. 目的基因的扩增（1）设计引物：根据目的基因序列设计一对引物，引物长度一般为20-25bp，5'端添加EcoRI和BamHI酶切位点。
（2）PCR扩增：以基因片段为模板，引物为引物，进行PCR扩增。
2. 载体的酶切（1）将pUC19质粒和PCR扩增的目的基因分别用EcoRI和BamHI进行酶切。
（2）回收酶切片段：琼脂糖凝胶电泳分离酶切片段，回收目的片段。
3. DNA连接（1）将回收的目的基因片段和载体片段混合，加入DNA连接酶，进行连接反应。
（2）将连接产物转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞中。
4. 转化后细胞的培养与筛选（1）将转化后的细胞在含有氨苄青霉素的LB培养基中培养过夜。
（2）取适量菌液进行PCR检测，筛选出阳性克隆。
5. 阳性克隆的鉴定（1）提取阳性克隆的质粒DNA。
（2）用EcoRI和BamHI进行酶切，琼脂糖凝胶电泳检测酶切片段。
（3）将酶切片段与标记物进行对比，验证重组质粒的正确性。
五、实验结果与分析1. PCR扩增结果：在PCR产物中，可见一条与预期片段大小相符的条带。
2. 酶切结果：在琼脂糖凝胶电泳中，可见目的基因片段和载体片段的酶切片段。
3. 阳性克隆的鉴定：在琼脂糖凝胶电泳中，可见与预期片段大小相符的条带，证明重组质粒构建成功。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
重组质粒的构建、转化、筛选和鉴定实验目的：学习在实现DNA体外重组过程中，正确选择合适的载体和限制性内切酶并能对限制性核酸内切酶对载体和目的DNA进行切割，产生利于连接的合适末端。
学习设计构建重组DNA分子的基本方法，掌握载体和外源目的DNA酶切的操作。
学习利用T4DNA连接酶把酶切后的载体片段和外源目的DNA片段连接起来，构建体外DNA 分子的技术，了解并掌握几种常用的连接方式。
掌握利用Cacl2 感受态细胞的方法。
学习掌握热击法转化E.coli的原理和方法。
掌握α互补筛选法和PCR检测法筛选重组子的方法。
并鉴定体外导入目的DNA片段的大小。
学习和掌握PCR反应的基本原理和操作技术，了解引物设计的基本要求。
实验原理：外源DNA与载体分子的连接即为DNA重组技术，这样重新组合的DNA分子叫做重组子。
重组的DNA分子式在DNA连接酶的作用下，有Mg2+、ATP存在的连接缓冲系统中，将分别经限制性内切酶酶切的载体分子和外源DNA分子连接起来。
将重组质粒导入感受态细胞中，将转化后的细胞在选择性培养基中培养，可以通过α互补筛选法筛选出重组子，并可通过酶切电泳及PCR检验的方法进行重组子的鉴定。
重组子的构建酶切时首先要了解目的基因的酶切图谱，选用的限制性内切酶不能目的基因内部有专一的识别位点，否则当用一种或两种限制性内切酶切割外源工体DNA时不能得到完整的目的基因。
其次要选择具有相应的单一酶切位点质粒或者噬菌体载体分子。
常用的酶切方法有双酶切法和单酶切法两种。
本实验采用单酶切法，即只用一种限制性内切酶切割目的DNA片段，酶切后的片段两端将产生相同的黏性末端或平末端，再选用同样的限制性内切酶处理载体。
在构建重组子时，除了形成正常的重组子外，还可能出现目的DNA片段以相反方向插入载体分子中，或目的DNA串联后再插入载体分子中，甚至出现载体分子自连，重新环化的现象。
单酶切法简单易行单是后期筛选工作比较复杂。
各种限制性内切酶都有去最佳反应条件，最主要的因素是反应温度和缓冲液的组成，在双酶切体系中，限制性内切酶在使用时应遵循“先低盐后高盐，先低温后高温”的原则进行反应。
（要达到高效率的连接，必须酶切完全，酶切的DNA数量要适当。
另外，酶切反应的规模也取决于需要酶切的DNA的量，以及相应的所需酶的量。
可以适当增加酶的用量，但是最高不能超过反应总体积的10%，因为限制性核酸内切酶一般是保存在50%甘油的缓冲液中，如果酶切反应体系中甘油的含量超过5%，就会抑制酶的活性。
）连接反应总是紧跟酶切反应，外源DNA片段与载体分子连接的方法即DNA分子体外重组技术主要依赖限制性核算内切酶和DNA连接酶催化完成的。
DNA连接酶催化两双链DNA片段相邻的5’-磷酸和3’-OH间形成磷酸二酯键。
在分子克隆中最有用的DNA连接酶是来自T4噬菌体的T4 DNA连接酶，它可以连接黏性末端和平末端。
连接反应时，载体DNA 和外源DNA的摩尔数之比控制在1:（1~3）之间，可以有效地解决DNA多拷贝插入的现象。
反应温度介于酶作用速率和末端结合速率之间，一般是16℃，用常用的连接时间为12-16h。
感受态细胞的制备及质粒转化构建好的重组DNA转入感受态细胞中进行表达的现象就是转化。
能进行转化的受体细胞必须是感受态细胞，即受体细胞最容易接受外源DNA片段实现转化的生理状态，它决定于受体菌的遗传特性，同时与菌龄、外界环境等因素有关。
人工转化是通过人为诱导的方法使细胞具有摄取DNA的能力，或人为地将DNA导入细胞内，该过程与细菌自身的遗传控制无关，常用热击法，电穿孔法等。
能否实现质粒DNA的转化还与受体细胞的遗传特性有关，所用的受体细胞一般是限制修饰系统的缺陷变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变株。
目前常用的感受态细胞制备方法有CaCl2法，制备好的感受态细胞可以加入终浓度为15%的无菌甘油，-70℃可保存半年至一年。
经过CaCl2处理的细胞细胞膜通透性增加，允许外源DNA分子进入。
在低温下，将携带有外源DNA片段的载体与感受态细胞混合，经过热击或电穿孔技术，使载体分子进入细胞。
进入受体细胞的外源DNA分子通过复制、表达，使受体细胞出现新的遗传性状。
将这些转化后的细胞在选择性培养基上培养，即可筛选出重组子。
本实验以E.coli DH 5α菌株为受体细胞，用CaCl2处理，使其处于感受态，然后将重组后的PUC19质粒在42℃下热击90s，实现转化。
重组子的筛选鉴定重组DNA转化宿主细胞后，并非所有的受体细胞都能被导入重组DNA分子，一般仅有少数重组DNA分子能进入受体细胞，同时也只有极少数的受体细胞在吸纳重组DNA分子之后能良好增殖。
并且它们是与其他大量未被转化的受体菌细胞混杂在一起。
再者，在这些被转化的受体细胞中，除部分含有我们所期待的重组DNA分子外，另外一些还可能是由于载体自身或一个载体与多个外源DNA片段形成非期待重组DNA分子导入所致。
因此必须使用各种筛选及鉴定手段区分转化子与非转化子，并从转化的细胞群体中分理出带有目的基因的重组子。
本实验中采用的方法是平板筛选法电泳筛选法及PCR检测方法。
抗药性筛选主要用于重组质粒DNA分子的转化子的筛选，而不含重组质粒DNA分子的受体菌则不能存活，α互补筛选法是根据菌落颜色筛选含有充足质粒的转化子。
质粒PUC19携带有氨苄青霉素抗性基因（Ampr）,在含有氨苄青霉素平板上筛选转化子。
没有导入质粒PUC19的受体细胞，在含有氨苄青霉素的平板上不生长。
质粒PUC19进入E.coli DH 5α后，通过α-互补作用，形成完整的β-半乳糖苷酶。
在麦康凯培养基平板上，转化子利用β-半乳糖苷酶分解培养基中的乳糖产生有机酸，pH降低，培养集中的指示剂变红，转化子的菌落变红。
不含质粒的E.coli DH 5α，没有β-半乳糖苷酶活性，不能利用培养集中的乳糖产生有机酸，而是利用培养集中的有机碳源，不使培养基pH降低，在不含有氨苄青霉素的麦康凯培养基上形成白色菌落。
重组后的载体DNA因为目的基因的插入位点在PUC19乳糖利用基因内部，不能形成α-互补作用，所以也不能利用培养集中的乳糖产生有机酸，在含有氨苄青霉素的麦康凯培养基上形成白色菌落。
挑选在氨苄青霉素培养基上生长的白色菌落，通过扩增培养。
因为许多菌落存在假阳性情况，在氨苄青霉素培养基上的白色菌落可能是导入的重组载体DNA菌落，也可能是载体自连后发生突变的菌落，所以还要鉴定转化子中重组质粒DNA分子的大小，可将重组的载体DNA 提取出来，进行后续的酶切、电泳检验。
也以提取的重组质粒为模板，利用现有的引物，进行那个PCR扩增，检测个噢偶见的质粒是否是所期望的重组质粒。
PCR技术PCR（Polymerase chain reaction）即聚合酶链式反应，其原理类似于DNA的体内复制，又叫做“体外基因扩增”。
反应体系包括：模板DNA、寡核苷酸引物、Mg2+，4种脱氧核糖核酸（dNTP）、DNA聚合酶和合适的缓冲体系。
反应基本程序包括DNA变性、引物复性及引物延伸三个基本过程。
这三个反应构成一个循环，反复进行。
每一轮循环扩增的产物可作为下一轮扩增反应的模板。
理论上每一轮循环可使DNA数量增加一倍，反复30次，特异DNA 序列片段以指数方式可扩增105~106。
通过此技术可以使非常微量的DNA产生大量的PCR 产物，因此这个技术是一项在体外大量生产目的基因的技术。
现在普遍通用的是一种从水生嗜热杆菌中提取的Taq DNA聚合酶，而且大大提高了扩增片段的特异性、灵敏性和扩增效率。
反应中用的引物有两段，一条称为上游引物或者正向引物，一条称为下游引物或者反向引物。
引物的设计十分重要，在设计时应遵循以下原则：长度一般为18到24个碱基；G+C的百分含量在40%~60%；单条引物内部避免含有二级结构，避免形成引物二聚体；最好以1到2个G或C碱基开始或结束；引物的5’端可以被修饰，但是3’端绝对不能进行任何修饰，而且引物的3’端要避开密码子的第三位。
模板的浓度不能太大，dNTP的浓度为2.5mmol/L，金属离子的浓度为1.5mmol/L，缓冲液为pH为7.2~8.0的Tris—HCl溶液。
实验材料：菌株：E.coli DH 5α培养基：LB培养基、麦康凯培养基（加入氨苄青霉素）试剂材料：酶切反应：（DNA PUC19 质粒，酶切10×buffer，Hind Ⅲ,重蒸水，λDNA。
）连接反应：（酶切后的DNA PUC19 质粒和λDNA，连接10×buffer，T4 连接酶，重蒸水。
）感受态细胞的制备：（0.1M CaCl2 ）转化：（连接液和感受态细胞，0.1M CaCl2，冰块。
）重组菌的挑选、检验：试剂盒（含有Rnase A的溶液Ⅰ，溶液Ⅱ，溶液Ⅲ，HB buffer,DNA washing buffer，elution buffer）,酶切后的DNA PUC19 质粒，试剂盒抽提的DNA，酶切10×buffer，Hind Ⅲ,重蒸水，琼脂糖，TAE缓冲液。
上样缓冲液，EB 染液。
PCR检测：10×PCR buffer,dNTP,模板，引物1，引物2，水，Taq DNA聚合酶，琼脂糖，TAE、溴化乙锭（EB）4. 仪器器材：20、200、1000ul 的枪和枪尖，1.5 ml的Ep管，恒温培养箱，水浴锅，平板，三角瓶，试管，接种环，牙签，酒精灯，火柴，冰箱，离心机，电泳槽，紫外仪，PCR扩增仪试验流程载体与外源片段的酶切→连接→感受态细胞的制备→质粒转化与重组子的筛选→重组子的挑取与复证→重组质粒的提取与电泳检测→PCR检测注意事项：本实验属于微量操作，用量极少的步骤必须严格注意吸取量的准确性并确保样品全部加入反应体系中。
实验中所用塑料器材都必须是新的，并且经过高温灭菌，操作时打开使用，操作过程中要注意环境干净，戴手套操作，尽量减少走动，缩短Ep管开盖的时间。
不论是酶切还是连接反应，加样的顺序应该是，先加重蒸水，其次是缓冲液和DNA，最后加酶。
且前几步要把样品加到管底的侧壁上，加完后用力将其甩到管底，而酶液要在加入前从-20℃的冰箱取出，酶管放置冰上，取酶液时吸头应从表面吸取，防止由于插入过深而使吸头外壁沾染过多的酶液。
取出的酶液应立即加入反应混合液的液面以下，并充分混匀。
Ep管的盖子应盖紧，防止水浴过程中水汽进入管内，并做好标记以防样品混淆。
转化过程要防止杂菌和其他DNA的污染，整个操作过程应在无菌条件下进行。
电泳时使用的缓冲液最好是现配现用，以免影响电泳效果。
制备凝胶时，应避免琼脂糖溶液在微波炉里加热时间过长，否则溶液将会暴沸蒸发，影响琼脂糖浓度。
制胶时要除去气泡。
拔梳子时要特别小心，以防凝胶与支持物脱离。