叶绿体色素的提取分离实验报告

叶绿体色素的提取分离、理化性质实验报告

第一部分提取与分离

一实验目的

学习应用薄层色谱法分离叶绿体色素的实验方法

二实验原理

叶绿体是进行光合作用的细胞器。叶绿体中的叶绿体a(C55H72O5N4Mg)、叶绿素b(C55H72O6N4Mg)、胡萝卜素(C40H56)和叶黄素(C40H56O2)与类囊体膜结合成为色素蛋白复合体。这些色素都不溶于水，而溶于有机溶剂，故可用乙醇等有机溶剂提取。提取液可用薄层色谱法加以分离与鉴别。

薄层色谱分析法是将吸附剂均匀的涂在玻璃板上成一薄层，将此吸附剂薄层做固定相，把待分离的样品溶液点在薄层板的下端，然后用一定量的溶剂做流动相，将薄层板的下端浸入到展开剂中。流动相通过毛细管作用由下而上的逐渐浸润薄层板，并带动样品在板上也向上移动，样品中各组分在吸附剂和展开剂之间发生连续不断的吸附、脱附、再吸附、再脱附……的过程。由于吸附剂的吸附能力大小不同，吸附力强的物质相对移动慢一些，而吸附力弱的则相对移动快一些，从而使各组分有不同的移动速度而彼此分开。

三实验材料与试剂

1 新鲜的菠菜叶片

2 体积分数为95%的乙醇，碳酸钙粉末，展开剂(石油醚:丙酮:苯=7:5:1，体积比)

3 天平，研钵，漏斗，三角瓶，剪刀，点样毛细管，层析缸，硅胶预制板，滤纸

四实验步骤

(一)色素提取液的制备

1 取新鲜叶片4至5片(2g左右)，洗净，擦干叶表面，去中脉剪碎，放入研钵中。

2 研钵中加入少量碳酸钙粉末，加2至3ml体积分数为95%的乙醇，研磨至糊状，再加10至15ml体积分数为95%的乙醇，上清液用漏斗过滤，残渣再用10ml体积分数为95%的乙醇冲洗一次，一同过滤于三角瓶中，即制成叶绿体色素提取液。提取液应避光保存。

(二)叶绿体色素的分离

1 取硅胶预制板一个，用点样毛细管吸取上述提取液，平行于硅胶板的短边，距下边缘约1cm处用毛细管划线，风干后再划第二次，重复操作3至4次。

2 在干洁的层析缸中加入适量的展开剂，高度约0.5cm，将硅胶预制板带有色素的一端放下，使其浸入展开剂中(但不要使待测样品浸入展开剂中)。迅速盖好层析缸盖。此时，展开剂借毛细管作用沿硅胶预制板向上扩散，并把叶绿体色素向上推动，不久即可以看到各种色素的色带。

3 当各种色素的得到较好分离，展开剂前沿接近硅胶预制板上端近边缘处时，取出硅胶预制板，并迅速用铅笔标出展开剂前沿和各色素带的位置。

五实验结果及数据、分析

经过薄层色谱分离后，叶绿素a为蓝绿色，叶绿素b为黄绿色，叶黄素为鲜黄色，胡萝卜素为橙黄色。各色素带在薄层中的位置可用相对比移值R f表示，即

R f=斑点中心到原点的距离/溶剂前沿至远点的距离

由于不同组分具有不同的R f值，所以比较R f值可以进行定性分析。但是，实验中的很多因素也可以影响到R f的值，例如吸附剂的种类、层析缸的形状大小、温度、展开剂的浓度等等。

最后测得数据：R f(胡萝卜素)=0.972，R f(叶绿素a)=0.908,R f(叶绿素b)=0.856，R f(叶黄素)=0.804。

第二部分理化性质

一实验目的

验证叶绿体色素的理化性质

二实验原理

叶绿素是一种由叶绿酸和叶绿醇形成的复合酯，故可与碱起皂化反应而生成甲醇和叶绿醇及叶绿酸盐，产生的盐能溶于水，故可用此法将叶绿素和类胡萝卜素分开。叶绿素吸收光量子而转变成为激发态，激发态的叶绿素分子很不稳定，当它变回倒基态时可发射出红光量子，因而产生荧光。叶绿素的化学性质很不稳定，容易受到强光的破坏，特别是当叶绿素与蛋白质分离以后，破坏更快，而类胡萝卜素则较稳定。叶绿素中的镁可以被H+所取代而生成褐色的去镁叶绿素。去镁叶绿素遇铜则成为铜代叶绿素，铜代叶绿素很稳定，在光下不易被破坏，故常用此法制作绿色多汁植物的浸渍标本。

三实验材料及试剂

1 新鲜菠菜叶片

2 刻度试管，小试管，试管架，水浴锅，10ml移液管

3 体积分数为95%的乙醇，苯，醋酸铜粉末，质量分数为5%的稀盐酸，醋酸-醋酸铜溶液，氢氧化钾-甲醇溶液

四实验步骤

(一)光对叶绿素的破坏作用

1 取2支小试管，各加入2.5ml叶绿体色素乙醇提取液，并用体积分数为95%的乙醇稀释一倍。其中一支放在直射日光下，另外一支放在暗处或用锡箔纸包严，40分钟后对比观察颜色有何变化。

2 另取本实验中用薄层层析分离成的硅胶色谱板一个，按长度方向将一半用黑色纸或塑料薄膜包住，放在直射日光下，半小时后观察，比较色谱板上各色素的颜色有何变化。

(二)皂化作用

1 取1支10ml刻度的试管加入3ml浓的叶绿体色素乙醇提取液，加入1ml氢氧化钾-甲醇溶液，充分摇匀。

2 片刻后，加入3ml苯，摇匀，再沿试管壁慢慢加入1ml左右的蒸馏水，轻轻摇匀(勿激烈摇荡)，然后置于试管架上静置分层。若溶液不分层，则用滴管吸取蒸馏水，沿管壁滴加，边滴加边摇动，直到溶液开始分层时，静置。

(三)H+和Cu+对叶绿素分子中的Mg+的取代作用

1 取两支试管，第一支试管中加叶绿体色素提取液5ml，作为对照。第二支试管中加入叶绿体色素提取液5ml后，再加入质量分数为5%的HCl数滴，摇匀，观察溶液颜色变化。当溶液变褐后，再加入少量醋酸铜粉末，60℃水浴加热，观察溶液颜色变化情况，并与对照试管相比较。

2 取新鲜植物叶片两片，放入试管中，加醋酸-醋酸铜溶液，使之没过叶片，90℃水浴加热，随时观察叶片颜色的变化，直至颜色不再变化为止。

(四)荧光现象的观察

取一支小试管加入3ml浓的叶绿素乙醇提取液，在直射光下照射，比较溶液的透射光与反射光的颜色有何不同。

五实验结果及分析

1 在光对叶绿素的破坏的实验中，未观察到提取液的颜色变化以及个色素的颜色变化，分析其原因，可能是因为当时的阳光已经不够强烈，不足以对色素达到破坏的程度，而且放置的位置不够好，不能使样品被阳光直射，而且放置的时间也可能不够长，所以导致此试验失败。

2 静置一段时间之后，溶液逐渐分为两层，下层是稀的乙醇溶液，其中溶有皂化的叶绿素a 和叶绿素b(以及少量的叶黄素)，呈绿色；上层是苯溶液，其中溶有黄色的胡萝卜素和叶黄素，呈黄色；最下层有少量黄色乳状液体，这是由于皂化液沉积引起的。

3 ·当加入了少量的盐酸后，溶液在短时间内变为了褐色，再加入少量的醋酸铜粉末，水浴加热一段时间后，溶液又重新变为了蓝绿色。

·90℃水浴加热约半个小时以后，叶片变为黄色，约一个半小时以后，叶片又逐渐恢复为蓝绿色。

4 荧光现象:透射光下呈绿色，反射光下呈红褐色。

第三部分实验感想

1 实验过程中，同组人员的配合十分重要，因为本实验的步骤很多，所以两个人配合起来的话可以大大的提高实验效率。

2 在用毛细管划线时，不可以画的太粗，否则会影响分离的时间，而且效果也不太好。

3 做叶绿素光解的实验时，要多等一些时间，否则时间太短的话实验现象不明显，或者没有出现应有的实验现象。