重组质粒构建(protocol)

重组质粒的构建（beta版）
一、引物设计:
1.选择合适的载体。

酶切位点及其顺序（酶切位点的顺序一定不能颠倒;注意ATG和stop codon）。

2.在NCBI上再次确认目的片段的碱基序列。

1，使用word
2，设计引物：primer-up
Primer-down
3，另设计一对引物扩增CDS区，引物位于CDS区之外，扩增产物包含完整的CDS区。

引物长度约20个碱基。

4，核对----送公司合成。

5，对公司合成的引物快速离心，在超净台按照管子上标注的体积加入高压水（dd2H2O），配成100umol/ul(100uM),-20℃保存。

使用时按1：3比例稀释成25uM工作浓度。

二、PCR（P出目的片段）：
（一）、PCR P出目的片段：
2,pcr: cDNA 1ul
10x PFU buffer 2.5ul ℃ 5min
dNTP 1ul ℃ 30sec
F’-Primer 1ul ℃ 30sec
R’-Primer 1ul ℃ X min
PFU 0.5ul ℃ 5min
dd2H2O 18ul
（X是根据片段的长度设定，1000bp/min，退火温度根据Tm值来计算，一般低于Tm值5℃）
3，跑胶、回收:
（1），配胶：
0.6g 琼脂糖
60ml 1X TAE
0.6ul (待温度降到50-60℃左右时)
25分钟后，即可点样跑胶。

（2），跑胶：130-150V、25-30分钟左右。

（3），紫外灯下观察，切胶（要带防护手套和口罩）
4，胶回收（胶回收试剂盒）:
按照试剂盒的protocol来做，在胶回收的最后一步，Elution Buffer预先在55-65℃温箱中水浴，放在37℃温箱中2min。

对胶回收的产物跑胶验证。

可建立10ul的体系：回收产物5ul、6xloading buffer 2ul、dd2H2O 5ul。

三、酶切、链接：
1，目的片段酶切：（酶切时间根据酶的活性,70℃15-20min灭活）
insert (胶回收产物) 10ul
10 x buffer 2ul
20ul的体系dd2H2O 6ul
EcoRI 1ul
HindⅢ1ul
2，载体酶切：（1~2小时）
Vector （1ug/ul）：5 ul（总量5ug）
10 x buffer 2ul
20ul的体系dd2H2O 11ul
EcoRI 1ul
HindⅢ1ul
为方便以后使用，载体可以一次性多切点。

3，酶切时，首先要核对一下酶的buffer，有时双酶切时两个酶不能共用一种buffer，那么就要先切一端，酶切回收后再用另一酶切另一端，然后再酶切产物回收。

4，连接：
10x T4 Ligation Buffer 1ul
Vector 1ul
10ul体系insert 3ul（2～3ul）
T4 DNA Lignase 1ul
dd2H2O 4ul
附：Ligation system
DNA片段克隆到质粒载体上
载体与插入DNA的摩尔数比例为1:3-10。

最佳的摩尔数比例因载体类型的不同而不同，例如cDNA 和基因组DNA克隆载体。

可根据以下公式计算插入DNA用量：
[实例]:
载体与插入片段的摩尔数比例为1:3，如连接反应中加入100ng 6kb载体，插入片段大小为0.5kb，这时应加入插入片段的量为：
四、转化：
⑴、冰上30min-→热激：42℃、60秒（30～60s）-→冰上2分钟
⑵、加750ul LB，37℃、150 rpm、45分钟。

⑶、离心，4500g,5min。

吸去上清600ul，余150ul涂板
⑷、220rpm、过夜。

五、挑克隆
六、质粒提取（mini）(按试剂盒protocol)
七、酶切鉴定：
plasmid：5ul（总量5ug）
10 x buffer 1ul
10ul的体系dd2H2O 2ul
EcoRI 1ul
HindⅢ1ul
跑胶检测酶切后DNA条带位置（分子量）是否一致
八、测序
九、质粒提取（midi）
十、转染、Western blot(检测蛋白表达及表达条带是否符合)。