重组质粒的构建与转化

姓名系年级10级生命基地组别JD-4 同组者

科目分子生物学实验题目重组质粒的构建、转化、筛选和鉴定学号

实验目的

1.学习在实现DNA体外重组过程中，正确选择合适的载体和限制性内切酶并能用限制性核酸内切酶对载

体和目的DNA进行切割，产生利于连接的合适末端。

2.学习设计构建重组DNA分子的基本方法，掌握载体和外源目的DNA酶切的操作。

3.学习利用T4 DNA连接酶把酶切后的载体片段和外源目的DNA片段连接起来，构建体外DNA分子的技

术，了解并掌握几种常用的连接方式。

4.掌握利用Cacl2制备感受态细胞的方法。

5.学习掌握热击法转化E.coli的原理和方法。

6.学习并掌握使用红白菌落法筛选获得重组子以及α互补筛选法的原理及方法。

7.学习并掌握使用Omaga试剂盒抽提质粒的方法及进一步确定重组质粒中含有外源目的DNA片段。

实验原理：

（一）限制性核酸内切酶的酶切反应

体外构建重组DNA分子，首先要了解目的基因的酶切图谱，选用的限制性内切酶不能在目的基因内部有专一的识别位点，否则当用一种或两种限制性内切酶切割外源供体DNA时不能得到完整的目的基因。其次要选择具有相应的单一酶切位点质粒或者噬菌体载体分子。常用的酶切方法有双酶切法和单酶切法两种。本实验采用单酶切法，即只用一种限制性内切酶切割目的DNA 片段，酶切后的片段两端将产生相同的黏性末端或平末端，再选用同样的限制性内切酶处理载体。

在构建重组子时，除了形成正常的重组子外，还可能出现目的DNA片段以相反方向插入载体分子中，或目的DNA串联后再插入载体分子中，甚至出现载体分子自连，重新环化的现象。单酶切法简单易行，但是后期筛选工作比较复杂。各种限制性内切酶都有其最佳反应条件，最主要的因素是反应温度和缓冲液的组成。在双酶切体系中，如果两种酶对盐离子的浓度和温度要求一致，原则上可以将这两种酶同时加入一个反应体系中同步酶切；如果不一致，则酶切反应最好分步进行，常用的酶切顺序是：先低盐后高盐，先低温后高温。

酶切与连接是两个密切相关的步骤，要达到高效率的连接，必须酶切完全，酶切的DNA数量要适当。另外，酶切反应的规模也取决于需要酶切的DNA的量，以及相应的所需酶的量。一般的，酶切0.2~1.0µg的DNA分子时，反应体积约为15~20µg，DNA的量越大，反应体积可按比例适当放大。酶的用量参照标准：一个标准单位酶能在指定的缓冲液系统和温度下，1h完全酶解1µg的pBR322 DNA分子。如果酶活力低，可以适当增加酶的用量，但是最高不能超过反应总体积的10%。因为限制性核酸内切酶一般是保存在50%甘油的缓冲液中，如果酶切反应体系中甘油的含量超过5%，就会抑制酶的活性。

姓名系年级10级生命基地组别JD-4 同组者

科目分子生物学实验题目重组质粒的构建、转化、筛选和鉴定学号

（二）载体与外源DNA的连接反应

连接反应总是紧跟酶切反应，外源DNA片段与载体分子连接的方法即DNA分子体外重组技术主要依赖限制性核酸内切酶和DNA连接酶催化完成的。DNA连接酶催化两双链DNA片段相邻的5’-磷酸和3’-OH间形成磷酸二酯键。在分子克隆中最有用的DNA连接酶是来自T4噬菌体的T4 DNA连接酶，它可以连接黏性末端和平末端。连接反应时，载体DNA和外源DNA的摩尔数之比控制在1:（1~3）之间，可以有效地解决DNA多拷贝插入的现象。实际操作中，反应温度介于酶作用速率和末端结合速率之间，一般是16℃，平末端适当提高连接反应温度。反应时间与温度有关，随温度的提高，反应速度增加，所需时间会相应减少，16℃下最常用的连接时间为12-16h。

（三）感受态细胞的制备及质粒转化

构建好的重组DNA转入感受态细胞中进行表达的现象就是转化。能进行转化的受体细胞必须是感受态细胞，即受体细胞最容易接受外源DNA片段实现转化的生理状态，它决定于受体菌的遗传特性，同时与菌龄、外界环境等因素有关。人工转化是通过人为诱导的方法使细胞具有摄取DNA的能力，或人为地将DNA导入细胞内，该过程与细菌自身的遗传控制无关，常用热击法，电穿孔法等。能否实现质粒DNA的转化还与受体细胞的遗传特性有关，所用的受体细胞一般是限制修饰系统的缺陷变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变株。

目前常用的感受态细胞制备方法有CaCl2法，制备好的感受态细胞可以加入终浓度为15%的无菌甘油，-70℃可保存半年至一年。经过CaCl2处理的细胞细胞膜通透性增加，允许外源DNA 分子进入。在低温下，将携带有外源DNA片段的载体与感受态细胞混合，经过热击或电穿孔技术，使载体分子进入细胞。进入受体细胞的外源DNA分子通过复制、表达，使受体细胞出现新的遗传性状。将这些转化后的细胞在选择性培养基上培养，即可筛选出重组子。本实验以E.coli- DH 5α菌株为受体细胞，用CaCl2处理，使其处于感受态，然后将重组后的pUC19质粒在42℃下热击90s，实现转化。

（四）重组子的鉴定与外源基因的表达

重组DNA进入宿主细胞后，必须使用各种筛选与鉴定手段区分转化子（接纳载体或重组DNA 分子的转化细胞）与非转化子（未接纳载体或重组DNA分子的转化细胞）。而转化子又分为含有重组DNA的转化子（重组子）和仅含有空载体分子的转化子（非重组子）。重组子含有的重组DNA分子中有期望重组子（含有目的基因的重组子）和非期望重组子（不含有目的基因的重组子）。本实验中采用的方法是平板筛选法（α互补筛选原理）、电泳筛选法进行初步鉴定，进一步将采用PCR检测以及酶切验证进行较为准确的鉴定。

利用抗药性筛选原理可筛选出转化子。质粒pUC19携带有氨苄青霉素抗性基因（Amp r）,在含有氨苄青霉素平板上筛选转化子，没有导入质粒pUC19的受体细胞，在含有氨苄青霉素的平板上不生长。

利用α互补筛选原理可筛选出转化子中的重组子与非重组子。α互补筛选原理是根据菌落颜色筛选含有重组质粒的转化子。据菌落颜色筛选含有重组质粒的转化子，利用β-半乳糖苷酶筛选