果蔬中维生素C的提取和定量测定

试验十三食物中维生素C的提取和含量测定（2，4－二硝基苯肼法）【实验目的】1．熟悉维生素C的生理功能。

2．掌握食物中维生素C的提取和含量测定。

【实验原理】维生素C是人类营养中最重要的维生素之一，是具有L-糖构型的不饱和多羟化合物，属于水溶性维生素。

维生素C缺乏时会产生坏血病，因此，又称为抗坏血酸。

维生素C分布很广，植物的绿色部分及许多水果(橘类、草莓、山楂、辣椒等)的含量更为丰富。

维生素C具有很强的还原性。

易被氧化成脱氢维生素C。

脱氢维生素C 仍保留维生素C的生物活性，在动物组织内被谷胱甘肽等还原成维生素C。

在pH>7.5时，脱氢维生素C易将其分子构造重新排列，使其内酯环裂开，生成没有活性的二酮古洛糖酸。

维生素C、脱氢维生素C和二酮古洛糖酸合称为总维生素C。

食物中的总维生素C包括还原型和脱氢型两种形式。

食物陈旧，贮存日久以及经过烹调处理的食物，其中有相当一部分维生素C成为脱氢型，此种形态的维生素C仍有85%左右的维生素C活性，所以对这类食物常常测定总维生素C。

测定时须将样品中的还原型维生素C氧化成脱氢型维生素C。

因脱氢维生素C和二酮古洛糖酸都能与2，4-二硝基苯肼作用生成红色的脎，脎的生成量与总维生素量成正比。

于是将脎溶于硫酸，再与同样处理的维生素C标准液比色，可求出样品中的总维生素C的含量。

【器材和试剂】1. 器材硏钵、恒温水浴、72型分光光度计、50m1容量瓶、刻度吸管、100m1锥形瓶。

2. 试剂（1）橘皮。

（2）9N硫酸：25m1浓硫酸(比重1.84) 缓慢加入700m1蒸馏水中，冷却后稀释至1000mI。

（3）2% 2,4-二硝基苯肼：溶解2g 2,4-二硝基苯肼于100ml4.5mol/L（9N）硫酸中，过滤。

4℃保存。

每次用前需再过滤，保存时间限于2周。

（4）85%硫酸：90m1浓硫酸(比重1.84)缓慢加入100mI水中。

（5）1%草酸溶液。

（6）10%硫脲：称取硫脲50g溶于1%500mI草酸中，4℃保存。

保存期限2个月。

（7）活性碳:100g活性碳加入750ml1mol/L(1N)盐酸回流1～2h，过滤，用蒸馏水反复洗涤活性碳至洗涤滤液中无Fe3+为止。

然后置烤箱中110℃烘干冷却后置干燥器中备用。

（8）标准维生素C贮存液：精确称取维生素C100mg，以1％草酸溶解并定容至100m1，4℃保存。

（9）标准维生素C应用液：准确吸取标准维生素C贮存液1.0m1置100m1容量瓶中，用1%草酸溶液稀释至刻度，用时现配。

【操作步骤】1．样品提取橘皮2g剪碎置硏钵中，按1%草酸10～15 m1，硏磨5～10min，将提取液收集至50m1容量瓶中，如此重复提取2～3次，最后加1%草酸至50 m1。

2．氧化、脱色取上述提取液约10m1置于干燥100m1锥形瓶中，加入活性碳0.5g，充分振摇1min后过滤，取约10m1标准液于另一干燥锥形瓶中，加入活性碳0.5g，同法振摇、过滤。

3．显色：取试管3支，编号，按下表操作：试剂空白标准测定样品滤液（ml）2.5 — 2.5标准滤液（ml）— 2.5 —10%硫脲（ml）1 1 12%2,4—二硝基苯肼(ml) 0 1.0 1.0混匀，置沸水浴中保温10min取出，流水冷却，空白管加2% 2,4—二硝基苯肼1ml。

4．脎的溶解各管置冷水浴中缓慢加入85%硫酸3.0m1，边加边摇边冷却。

加完后混匀，取出试管，室温下放置10min，于500nm波长下进行比色，以空白管凋零，测吸光度值。

【计算】【附注】（1）生蔬菜、水果捣匀浆时可能产生泡沫，为定容准确可加数滴戊醇以除去泡沫。

（2）处理活性炭时Fe3+检查法：取活性炭洗涤滤液少许，加数滴5%亚铁氯化钾，若不出现蓝色，示无Fe3+；或加数滴1%硫氰酸钾，若不出现红色，也示无Fe3+。

实验八果蔬中维生素C的提取和定量测定（2,6-二氯酚靛酚滴定法）【目的】1.学习并掌握定量测定维生素C的原理和方法。

2.了解蔬菜、水果中维生素C含量情况。

【原理】维生素C是人类营养中最重要的维生素之一，缺少它时会产生坏血病，因此又称为抗坏血酸（ascorbic acid）。

它对物质代谢的调节具有重要的作用。

近年来，发现它还有增强机体对肿瘤的抵抗力，并具有化学致癌物的阻断作用。

维生素C是不饱和多羟基物，属于水溶性维生素。

它分布很广，许多水果、蔬菜中的含量更为丰富。

维生素C具有很强的还原性。

还原型抗坏血酸能还原染料2,6—二氯酚靛酚（dichloro-phenol-indophenol，简称DCIP），本身则氧化为脱氢型。

在酸性溶液中，2,6—二氯酚靛酚呈红色，还原后变为无色。

因此，当用此染料滴定含有维生素C 的酸性溶液时，维生素C尚未全部被氧化前，则滴下的染料立即被还原成无色。

一旦溶液中的维生素C已全部被氧化时，则滴下的染料立即使溶液变成粉红色。

所以，当溶液从无色变成微红色时即表示溶液中的维生素C刚刚全部被氧化，此时即为滴定终点。

如无其它杂质干扰，样品提取液所还原的标准染料量与样品中所含还原型抗坏血酸量成正比。

【试剂和器材】一、试剂2%草酸溶液：草酸2g溶于100mL蒸馏水中。

1%草酸溶液：草酸1g溶于100mL蒸馏水中。

标准抗坏血酸溶液(0.1mg/mL)：准确称取50.0mg纯抗坏血酸（应为洁白色，如变为黄色则不能用）溶于1%草酸溶液中，并稀释至500mL，贮于棕色瓶中，冷藏。

最好临用前配制。

0.1% 2,6—二氯酚靛酚溶液：250mg 2,6—二氯酚靛酚溶于150mL含有52mg NaHCO3的热水中，冷却后加水稀释至250mL，贮于棕色瓶中冷藏(4℃)，约可保存一周。

每次临用时，以标准抗坏血酸溶液标定。

二、材料：水果、蔬菜三、器材研钵，组织匀浆器，吸量管，抽滤设备，离心机，滤纸，容量瓶，滴定管，锥形瓶。

【操作方法】一、提取水洗干净待测的新鲜蔬菜或水果，用纱布或吸水纸吸干表面水分。

然后称取20g，加入10～20mL 2%草酸，研磨成浆状，抽滤，合并滤液，滤液总体积定容至50mL。

或者研磨后以2%草酸洗涤离心(4000r/min，10min)2~3次，合并上清液于50mL容量瓶中，定容至刻度。

二、标准液滴定准确吸取标准抗坏血酸溶液1mL置50mL锥形瓶中，加9mL 1%草酸，以0.1% 2,6—二氯酚靛酚溶液滴定至淡红色，并保持15秒不褪色，即达终点；取10mL 1%草酸作空白对照，按以上方法滴定。

由所用染料的体积计算出1mL染料相当于多少毫克抗坏血酸。

三、样品滴定准确吸取滤液两份，每份10mL, 分别放入2个锥形瓶内，滴定方法同前。

另取10mL 1%草酸作空白对照滴定。

【计算】（V A-V B）×C×T×100维生素C含量（mg/100g样品）= ───────────────D×W式中：V A为滴定样品所耗用的染料的平均毫升数；V B为滴定空白对照所耗用的染料的平均毫升数；C为样品提取液的总毫升数；D为滴定时所取的样品提取液毫升数；T为1mL染料能氧化抗坏血酸毫克数（由操作二计算出）；W为待测样品的重量（g）。

【注意事项】(1) 某些水果、蔬菜（如橘子、西红柿等）浆状物泡沫太多，可加数滴丁醇或辛醇。

(2) 整个操作过程要迅速，防止还原型抗坏血酸被氧化。

滴定过程一般不超过2min。

滴定所用的染料不应小于1mL或多于4mL，如果样品含维生素C太高或太低时，可酌情增减样液用量或改变提取液稀释倍数。

(3) 本实验必须在酸性条件下进行。

在此条件下，干扰物反应进行得很慢。

(4) 2%草酸有抑制抗坏血酸氧化酶的作用，而1%草酸无此作用。

(5) 干扰滴定因素有：若提取液中色素很多时，滴定不易看出颜色变化，可用白陶土脱色，或加1mL氯仿，到达终点时，氯仿层呈现淡红色。

Fe2＋可还原二氯酚靛酚。

对含有大量Fe2＋的样品可用8%乙酸溶液代替草酸溶液提取，此时Fe2＋不会很快与染料起作用。

样品中可能有其它杂质还原二氯酚靛酚，但反应速度均较抗坏血酸慢，因而滴定开始时，染料要迅速加入，而后尽可能一点一点地加入，并要不断地摇动三角瓶直至呈粉红色，于15秒内不消退为终点。

【思考题】1．为了测得准确的维生素C含量，实验过程中都应注意哪些操作步骤？为什么？2．试简述维生素C的生理意义。

【小资料】一、维生素C维生素C是人类膳食中必需的维生素之一，如果缺乏维生素C，将导致坏血病发生。

因此，维生素C又称为抗坏血酸，有防治坏血病的功效。

抗坏血酸在自然界分布十分广泛，存在于新鲜水果和蔬菜中，尤其是柠檬果实和一些绿色植物（如青辣椒、菠菜等）中含量特别丰富。

抗坏血酸在机体同具有广泛的生理功能，已知体内许多重要物质的代谢反应都需要抗坏血酸的参与。

它是脯氨酸羟基化酶的辅酶，故有增进胶原蛋白合成的作用。

机体中许多含疏基的酶，需要依赖于作为还原剂的抗坏血酸的保护，使酶分子的疏基处于还原状态，从而维持其催化活性。

由于抗坏血酸的氧化还原作用，它可促进免疫球蛋白的合成，增强机体的抵抗力。

同时还能使氧化型谷胱甘肽转化为还原型谷胱甘肽（简称GSH），而GSH可与重金属结合而排出体外，因此维生素C常用于重金属的解毒。

此外，抗坏血酸尚有许多其他生理功能，但其作用机理还不十分清楚。

抗坏血酸是一种不饱和的多羟基内酯化合物，稍有酸味的糖类白色晶体，易溶于水，故属于水溶性维生素。

在溶液中其分子内C2和C3之间的烯醇式羟基上的氢极易解离并释放出H+，而被氧化成脱氢抗坏血酸，氧化后仍具有维生素C 的生理活性，但它易分解为二酮古洛糖酸，此化合物不再具有维生素C的生理活性。

维生素C有很强的还原性，在碱性溶液中加热并有氧化剂存在时，易被氧化而破坏。

还原型和氧化型抗坏血酸可以互相转变，在生物组织中自成一氧化还原系统。

由于维生素在营养学和临床方面的重要意义，故对食物和生物材料中维生素含量的测定是十分必须的。

抗坏血酸的定量测定方法很多，有2,6—二氯酚靛酚（简称DCIP）滴定法、碘滴定法、2,4—二硝基苯肼法、Folin试剂比色法、紫外吸收法等。

其中广泛采用的是DCIP 滴定法，它具有简便、快速、比较准确等优点，适用于许多不同类型样品的分析。

缺点是不能直接测定样品中的脱氢抗坏血酸及结合抗坏血酸的含量，易受其他还原物质的干扰。

如果样品中含有色素类物质，将给滴定终点的观察造成困难。

在酸性环境中，抗坏血酸（还原型）能将染料2,6—DCIP还原成无色的还原型2,6—DCIP，而抗坏血酸则被氧化成脱氢抗坏血酸。

氧化型2,6—DCIP在中性或碱性溶液中呈蓝色，但在酸性溶液中则呈粉红色。

因此，当用2,6—DICP滴定含有抗坏血酸的酸性溶液时，在抗坏血酸未被全部氧化前，滴下的2,6—DCIP 立即被还原成无色，一旦溶液中的抗坏血酸全部被氧化时，则滴下微量过剩的2,6—DCIP 便立即使溶液显示淡粉红色或微红色，此时即为滴定终点，表示溶液中的抗坏血酸刚刚全部被氧化。