生化实验复习资料

实验二 蛋白质的颜色反应实验目的：1.了解构成蛋白质的基本结构单位及主要联接方式 2.了解蛋白质的颜色反应原理。

3.学习几种常用的鉴定蛋白质的方法。

（一）双缩脲反应原理：尿素加热至180℃左右生成双缩脲并放出一分子氨。

双缩脲在碱性环境中能与cu2+结合生成紫红色化合物，此反应称为双缩脲反应。

蛋白质分子中有肽键，其结构与双缩脲相似，也能发生此反应。

可用于蛋白质的定性或定量测定。

一切蛋白质或二肽以上的多肽都有双缩脲反应，但有双缩脲反应的物质不一定都是蛋白质或多肽。

步骤： （1）取少量尿素结晶，放在干燥试管中。

用微火加热使尿素熔化。

熔化的尿素开始硬化时，停止加热，尿素放出氨，形成双缩脲。

冷后，加10％氢氧化钠溶液约1毫升，振荡混匀，再加1％硫酸铜溶液1滴，再振荡。

现象：出现的粉红颜色。

（2）向另一试管加卵清蛋白溶液约10滴和10％氢氧化钠溶液约10滴，摇匀，再加1％硫酸铜溶液2滴，随加随摇。

现象：观察到出现紫玫瑰色。

（二）茚三酮反应原理：除脯氨酸、羟脯氨酸和茚三酮反应产生黄色物质外，所有α—氨基酸及一切蛋白质都能和茚三酮反应生成蓝紫色物质。

该反应十分灵敏，是一种常用的氨基酸定量测定方法。

茚三酮反应分为两步，第一步是氨基酸被氧化形成CO2、NH3和醛，水合茚三酮被还原成还原型茚三酮；第二步是所形成的还原性茚三酮同另一个水合茚三酮分子和氨缩合生成有色物质。

步骤：取试管1支，加入蛋白质溶液1ml ，然后各加入0.1％茚三酮水溶液2滴，混匀后于沸水浴中加热1-2分钟。

现象：颜色由有粉色变紫红色再变蓝。

（三）黄色反应原理：在蛋白质分子中，具有芳香环的氨基酸(如酪氨酸，色氨酸等)残基上的苯环经硝酸作用可生成黄色的硝基化合物，在碱性条件下生成物可转变为深橙色的的硝醌衍生物，反应为：OH +HNO 3HO NO 2+H 2OHO NO 2+O NOH OH COCOCH OH +COCO CC O C O C O +2NH 3NH 2C O C O C N +2H 2O C OH OH +C COOH H 2R C O C C H OH +RCHO NH 3CO 2++多数蛋白质分子含有带苯环的氨基酸，所以都会发生黄色反应。

苯丙氨酸不易硝化，需加少量浓硫酸后才能够发生黄色反应。

步骤：于一试管内，置蛋白质溶液10滴，浓硝酸3-4滴，加热，冷却后于室温下逐滴加入10%NaOH溶液5滴，观察颜色变化。

现象：加入NaOH，振荡后出现颜色变成橙色(四)考马斯亮蓝反应原理：考马斯亮蓝G250具有红色和蓝色两种色调。

在酸性溶液中，其以游离态存在呈棕红色：当它与蛋白质通过疏水作用结合后变成蓝色。

它染色灵敏度高。

反应速度快，约在2分钟左右时间达到平衡，在室温一小时内稳定。

在0.01-1.0 mg蛋白质范围内，蛋白质浓度与A595nm值成正比。

所以常用来测定蛋白质含量。

步骤：在两个做好标记的试管中，分别对应加入1ml蒸馏水和2滴考马斯亮蓝染液，0.1ml 蛋白质溶液和0.9ml蒸馏水和2滴考马斯亮蓝染液。

观察两支试管有何区别。

现象：对照组呈棕红色，而实验组呈蓝色。

实验三蛋白质的等电点测定和沉淀反应实验目的：1、了解蛋白质的两性解离性质。

2、学习测定蛋白质等电点的一种方法。

3、加深对蛋白质胶体溶液稳定因素的认识。

4、了解沉淀蛋白质的几种方法及其实用意义。

5、了解蛋白质变性与沉淀的关系。

原理：蛋白质是两性电解质。

在蛋白质溶液中存在下列平衡：蛋白质的等电点: 蛋白质分子的解离状态和解离程度受溶液的酸碱度影响。

当溶液的pH达到一定数值时，蛋白质颗粒上正负电荷的数目相等，在电场中，蛋白质既不向阴极移动，也不向阳极移动，此时溶液的pH值称为此种蛋白质的等电点。

不同蛋白质各有特异的等电点。

在等电点时，蛋白质的理化性质都有变化，可利用此种性质的变化测定各种蛋白质的等电点。

最常用的方法是测其溶解度最低时的溶液pH值。

本实验通过观察不同pH溶液中的溶解度以测定酪蛋白的等电点。

用醋酸与醋酸钠（醋酸钠混合在酪蛋白溶液中）配制各种不同pH值的缓冲液。

向诸缓冲溶液中加入酪蛋白后，沉淀出现最多的缓冲液的pH值即为酪蛋白的等电点。

步骤：（一）酪蛋白等电点的测定1 取同样规格的试管4支，按下表顺序分别精确地加入各试剂，然后混匀;2 向以上试管中各加酪蛋白的醋酸钠溶液1mL，加一管，摇匀一管。

此时1、2、3、4管的pH依次为5.9、5.5、4.7、3.5。

观察其混浊度。

静置10分钟后，再观察其混浊度。

最混浊的一管pH即为酪蛋白的等电点。

现象：理论上pH为4.7的时候得到的沉淀最多。

但是实验结果不明显。

（二）蛋白质的沉淀在水溶液中的蛋白质分子由于表面生成水化层和双电层而成为稳定的亲水胶体颗粒，在一定的理化因素影响下，蛋白质颗粒可因失去电荷和脱水而沉淀。

蛋白质的沉淀反应可分为两类。

（1）可逆的沉淀反应此时蛋白质分子的结构尚未发生显著变化，除去引起沉淀的因素后，蛋白质的沉淀仍能溶解于原来溶剂中，并保持其天然性质而不变性。

（2）不可逆沉淀反应此时蛋白质分子内部结构发生重大改变，蛋白质常变性而沉淀，不再溶于原来溶剂中。

加热引起的蛋白质沉淀与凝固。

蛋白质与重金属离子或某些有机酸的反应都属于此类。

蛋白质变性后，有时由于维持溶液稳定的条件仍然存在（如电荷），并不析出。

因此变性蛋白质并不一定都表现为沉淀，而沉淀的蛋白质也未必都已变性。

无机盐(硫酸铵、硫酸钠、氯化钠等)的浓溶液能析出蛋白质。

盐的浓度不同，析出的蛋白质也不同。

如球蛋白可在半饱和硫酸铵溶液中析出，而清蛋白则在饱和硫酸铵溶液中才能析出。

由盐析获得的蛋白质沉淀，当降低其盐类浓度时，又能再溶解，故蛋白质的盐析作用是可逆过程。

步骤：加蛋白质溶液5 mL于试管中，再加等量的饱和硫酸铵溶液，混匀后静置数分钟则析出球蛋白的沉淀。

倒出少量混浊沉淀，加少量水，观察是否溶解，将管内容物过滤，向滤液中添加硫酸铵粉末到不再溶解为止。

此时析出沉淀为清蛋白。

取出部分清蛋白，加少量蒸馏水，观察沉淀的再溶解。

（三）重金属离子沉淀蛋白质步骤：重金属离子与蛋白质结合成不溶于水的复合物。

取1支试管，加入蛋白质溶液2 mL，再加3%硝酸银溶液1—2滴，振荡试管。

现象：有沉淀产生。

放置片刻，倾去上清液，向沉淀中加入少量的水，沉淀不溶解（四）某些有机酸沉淀蛋白质步骤：取1支试管，加入蛋白质溶液2mL，再加入1 ml 5%三氯乙酸溶液，振荡试管。

现象：有沉淀生成。

放置片刻倾出清液，向沉淀中加入少量水，沉淀不溶解。

（五）有机溶剂沉淀蛋白质步骤：取1支试管，加入2mL蛋白质溶液, 再加入2 mL95%乙醇。

观察沉淀的生成(如果沉淀不明显，加点NaCl，混匀)。

现象：沉淀不溶解实验四糖的性质实验实验目的：1 掌握莫氏试验鉴定糖的原理和方法；2 掌握塞氏试验鉴定酮糖的原理和方法；3 掌握用糖的还原反应来鉴定糖的原理和方法。

原理：（一）莫式试验：糖经无机酸（浓硫酸、浓盐酸）脱水产生糠醛或糠醛衍生物，后者在浓无机酸作用下，能与а-萘酚生成紫红色缩合物。

步骤：于三支试管中，分别加入1ml 1%葡萄糖溶液、1%蔗糖溶液和1%淀粉溶液，然后各加莫氏试剂2滴，摇匀，将试管倾斜，沿管壁慢慢加入浓盐酸1.5 ml（切勿振摇！），观察现象。

现象：液体分层，有粉色浑浊颗粒在交界处产生（二）塞式试验：酮糖在浓酸的作用下，脱水生成5-羟甲基糠醛，后者与间苯二酚作用，呈红色反应；有时亦同时产生棕红色沉淀，此沉淀溶于乙醇，成鲜红色溶液。

步骤：三支试管中，分别加入1%葡萄糖溶液、1%蔗糖溶液和1%淀粉溶液0.5 ml ，然后各加塞氏试剂2.5 ml ，摇匀，同时置沸水浴内，比较各管颜色及红色出现的先后顺序。

现象：加入蔗糖溶液的试管中，在沸水浴中加热约2分钟后，出现酒红色，另外两支试管无明显现象。

（三）还原反应：费林试剂和本尼迪克特试剂均为含Cu2+的碱性溶液，能使具有自由醛基或酮基的糖氧化，其本身则被还原成红色或黄色的Cu2O，此法常用作还原糖的定性或定量测定。

步骤：于3支试管中加入费林试剂A和B各1ml，混匀，分别加入1%葡萄糖溶液、1%蔗糖溶液和1%淀粉溶液1ml，置沸水浴中加热数分钟可，取出，冷却，观察各管的变化。

现象：加入葡萄糖溶液的试管在加热过程中，溶液首先由蓝色变为红色浑浊，再变为棕红色，最后出现分层现象，下层为朱红色沉淀。

另两支试管加热较长时间，依然没有明显现象。

（四）本尼迪特试验步骤：另取3支试管，分别加入1%葡萄糖溶液、1%蔗糖溶液和1%淀粉溶液1ml，然后每支试管加本尼迪特试剂2 ml，置沸水浴中加热数分钟，取出，冷却，和上面结果比较。

现象：加入葡萄糖溶液的试管，在加热构成中，溶液首先由蓝色由上至下变红，最后得到砖红色沉淀。

另两支试管加热较长时间，依然没有明显现象。

实验五蛋白质的浓度测定实验目的：1 掌握五种蛋白质的定量测定方法的原理（凯式定氮法，紫外吸收法，Lowry法，双缩脲法和考马斯亮蓝法）；2 熟悉并掌握双缩脲法和考马斯亮蓝法定量测定蛋白质的方法和操作技术。

原理：目前常用的有五种经典方法：定氮法：灵敏度0.2~1.0mg双缩脲法（Biuret法）：1~2mgFolin－酚试剂法（Lowry法）：50~100μg紫外吸收法：5μg考马斯亮蓝法（Bradford法）：1~5μg（一）Folin－酚试剂法原理：蛋白质中含有酪氨酸和色氨酸残基，能与Folin酚试剂起氧化还原反应。

反应过程分为两步，第一步：在碱性溶液中，蛋白质分子中的肽键与碱性铜试剂中的Cu2+作用生成蛋白质Cu2+复合物；第二步：蛋白质Cu2+复合物中所含的酪氨酸或色氨酸残基还原酚试剂中的磷钼酸和磷钨酸，生成蓝色的化合物（λmax=500nm)。

该呈色反应在30分钟内即接近极限,在一定浓度范围内，蓝色的深浅度与蛋白质浓度呈线性关系，故可用比色的方法确定蛋白质的含量。

（二）紫外吸收法原理：大多数蛋白质分子结构中含有芳香族氨基酸（酪氨酸和色氨酸）残基，使蛋白质在280 nm的紫外光区产生最大吸收，并且这一波长范围内的吸收值与蛋白质浓度的成正比，利用这一特性可定量测定蛋白质的含量。

（三）微量凯氏定氮法原理：蛋白质的含氮量为16%，即1克蛋白质中的氮相当于6.25克蛋白质，用凯氏定氮法测出的含氮量乘以6.25,即得样品中蛋白质的含量。

当蛋白质与浓硫酸共热时，其中的碳、氢两元素被氧化成二氧化碳和水，而氮则转变成氨，并进一步与硫酸作用生成硫酸铵。

此过程通常称为“消化”。

消化完成后，在凯氏定氮仪中加入浓碱，可使消化液中的硫酸铵分解，游离出氨，借助水蒸汽蒸馏法，将产生的氨蒸馏到一定量、一定浓度的硼酸溶液中，硼酸吸收氨后，氨与溶液中氢离子结合，使溶液中的氢离子浓度降低，指示剂颜色改变，然后用标准无机盐酸滴定，直至恢复溶液中原来的氢离子浓度为止。