TUNEL法检测细胞凋亡实验原理和方法tunel完成

TUNEL细胞凋亡检测程序

TUNEL细胞凋亡检测程序（Promega公司）一、原理与意义：TUNEL（TdT-mediated dUTP nick end labeling）细胞凋亡检测试剂盒是用来检测组织细胞在凋亡早期过程中细胞核DNA的断裂情况，其原理是生物素biotinylate标记的dUTP在脱氧核糖核苷酸末端转移酶（TdT Enzyme）的作用下，可以连接到凋亡细胞中断裂DNA的3’-OH末端，并与连接辣根过氧化酶（HRP，horse-radish peroxidase）的链霉亲和素streptavidin特异性结合，后者又与POD底物H2O2、二氨基联苯胺（DAB）产生深棕色反应，特异准确地定位正在凋亡的细胞，因而在光学显微镜下即可观察凋亡细胞；由于正常的或正在增殖的细胞几乎没有DNA断裂，因而没有3'-OH形成，很少能够被染色。

本试剂盒适用于组织样本（石蜡包埋、冰冻和超薄切片）和细胞样本（细胞涂片）在单细胞水平上的凋亡原位检测。

还可应用于抗肿瘤药的药效评价，以及通过双色法确定细胞死亡类型和分化阶段。

二、器材与试剂1.器材：光学显微镜及其成像系统、摇床、组化笔、小型染色缸、湿盒（塑料饭盒与纱布）、塑料盖玻片或封口膜、吸管、各种规格的移液器及枪头等。

2.试剂：试剂盒含TdT 2×、Biotinylated标记的dUTP、标记streptavidin的HRP、SSC 20×、Proteinase k、DAB 20×、DAB底物Buffer 20×、H2O2 20×；3.自备试剂：1)1×PBS（pH 7.4，2.5L＝20.0157g 137mM NaCl＋0.499552g 2.68mM KCl＋0.50013075g 1.47mM KH2PO4＋7.253337g 8.1mM Na2HPO4），115℃×15 min；2)0.85％NaCl 500 ml＝4.25 g Nacl＋500 ml三蒸水，115 ℃×15 min；3)4％多聚甲醛500 ml＝20 g多聚甲醛＋500 ml PBS在65 ℃水箱中3 h多，再放入4 ℃保存。

TUNEL-roche使用流程

In situ cell death detection kit-POD法一、原理：TUNEL（TdT-mediated dUTP nick end labeling）细胞凋亡检测试剂盒是用来检测组织细胞在凋亡早期过程中细胞核DNA的断裂情况。

其原理是脱氧核糖核苷酸末端转移酶（TdT Enzyme）把荧光素（fluorescein）标记的dUTP（三磷酸脱氧尿甘）连接到凋亡细胞中断裂DNA的3’-OH末端，并与连接辣根过氧化酶（HRP，horse-radish peroxidase）的荧光素抗体特异性结合，HRP又与HRP底物二氨基联苯胺（DAB）反应产生很强的颜色反应（呈深棕色），特异准确地定位正在凋亡的细胞，因而在光学显微镜下即可观察凋亡细胞；由于正常的或正在增殖的细胞几乎没有DNA断裂，因而没有3‘-OH形成，很少能够被染色。

本试剂盒适用于组织样本（石蜡包埋、冰冻和超薄切片）和细胞样本（细胞涂片）在单细胞水平上的凋亡原位检测。

还可应用于抗肿瘤药的药效评价，以及通过双色法确定细胞死亡类型和分化阶段。

二、器材与试剂器材：光学显微镜及其成像系统、小型染色缸、湿盒（塑料饭盒与纱布）、塑料盖玻片或封口膜、吸管、各种规格的加样器及枪头等；试剂：试剂盒含TdT 10×、荧光素标记的dUTP 1×、标记荧光素抗体的HRP；自备试剂：PBS、双蒸水、二甲苯、梯度乙醇（100、95、90、80、70%）、DAB工作液（临用前配制，5 μl 20×DAB+1μL 30%H2O2+94 μl PBS）、Proteinase K工作液（10-20 μg/ml in 10 mM Tris/HCl， pH 7.4-8）或细胞通透液（0.1% Triton X-100 in 0.1% sodium citrate，临用前配制）、苏木素或甲基绿、DNase 1（3000 U/ml– 3 U/ml in 50 mM Tris-HCl，pH 7.5， 10 mM MgCl2，1 mg/ml BSA）等。

TUNEL法检测细胞凋亡

细胞在发生凋亡时，会激活一些DNA内切酶，这些内切酶会切断核小体间的基因组DNA。

基因组DNA 断裂时，暴露的3'-0H 可以在末端脱氧核苷酸转移酶（Terminal Deox yn ucleotidyl Tran sferase,TdT）的催化下加上荧光素（FITC）标记的dUTP（fluorescein-dUTP），从而可以通过荧光显微镜或流式细胞仪进行检测，这就是TUNEL 法检测细胞凋亡的原理。

TUNEL法特异性检测细胞凋亡时产生的DNA断裂，但不会检测出射线等诱导的DNA断裂（和细胞凋亡时的断裂方式不同）。

这样一方面可以把凋亡和坏死区分开，另一方面也不会把射线等诱导发生DNA断裂的非凋亡细胞判断为凋亡细胞。

针对问题2（TUNEL法的实验原理是什么？）：基本原理：对不同组织切片先增加细胞膜通透性，然后让rTDT和bio标记的dUTP进入细胞内，在rTDT的辅助下dUTP与核断裂的DNA 3 -0H结合，再用HRP标记的链霉亲和素与dUTP 上的biot in 结合（每个链霉亲和素至少可以再结合3个biot in 分子），最后用DAB过氧化氢与SP上的辣根过氧化物酶HRP发生氧化、环化反应，形成苯乙肼聚合物而呈现棕褐色，最终通过计数每张切片上不同视野中TUNEL阳性细胞的比例来判断细胞凋亡发生情况。

■1. TUNEL工作原理：简单说就是一一TUNEL细胞凋亡检测试剂盒是用来检测细胞在凋亡过程中细胞核DNA的断裂情况。

其原理是；生物素（biot in ）标记的dUTP在脱氧核糖核苷酸末端转移酶（TdT En zyme）的作用下，可以连接到凋亡细胞中断裂的DNA的3' - 0H末端，并可与连接了的辣根过氧化酶的链霉亲和素（Streptavidin-HRP ）特异结合，在辣根过氧化酶底物二氨基联苯胺（DAB的存在下，产生很强的颜色反应（呈深棕色），特异准确地定位正在凋亡的细胞，因而在普通显微镜下即可观察和计数凋亡细胞；由于正常的或正在增殖的细胞几乎没有DNA的断裂，因而没有3'-0H形成，很少能够被染色。

TUNEL法检测细胞凋亡实验原理和方法

检测晚期凋亡.基本原理：对不同组织切片先增加细胞膜通透性，然后让和标记地进入细胞内，在地辅助下与核断裂地’结合，再用标记地链霉亲和素与上结合（每个链霉亲和素至少可以再结合个分子），最后用、过氧化氢与上地辣根过氧化物酶发生氧化、环化反应，形成苯乙肼聚合物而呈现棕褐色，最终通过计数每张切片上不同视野中阳性细胞地比例来判断细胞凋亡发生情况.罗氏试剂盒一、试剂、酶浓缩溶液×μ——末端脱氧核糖核酸转移酶（×）试剂、标记溶液×μ——含有核苷酸混合液地反应液（×）试剂、转化剂——酶标记抗荧光素抗体（即用型，融后℃保存）二、所需地溶液和仪器（）、配制、、饭盒、吹风机、甲醇溶液、、盖玻片、中性树胶、苏木素、二甲苯和无水乙醇（用量多）、双蒸水（用以配梯度酒精）, 充分脱蜡和水化.脱蜡可以先度，石蜡切片于染色缸中，二甲苯浸洗次共、、、、乙醇浸洗×；②过氧化氢甲醇中浸洗，抑制内源性过氧化氢酶.③用蛋白酶（μ溶于中，）室温孵育分钟.④洗约*次，擦干样品周围地水.此阶段配制反应混合物——从试剂中取出μ标记溶液作为两个阴性对照；将试剂中取μ试剂中μ标记液中，配成μ 反应混合物混匀（即配即用，℃避光！）⑤标记反应：滴加μ地反应混合液，在湿盒中℃孵育分钟（为防蒸发和保证反应混合物均匀分布，可以在孵育过程中加盖盖玻片）.洗*次，至此样品可在荧光镜下（绿色）分析结果.⑥信号转化和分析：擦干样品周围地水分，加入转化剂，湿盒中℃孵育分钟（可以在孵育过程中加盖盖玻片）.洗*次⑦加入μ 底物溶液，室温（℃）孵育，洗*次.（苏木素染秒，以免视野全染，需要摸索条件）⑧中性树胶或者甘油封片（在封片前可以复染），光镜下分析结果.•稳定性：反应混合物需在使用前立即制备，不能储存，配好地此液体必须将放入冰浴中.个人收集整理勿做商业用途、转化剂（即用型）：一旦融化此液体，需在℃保存（最多保存个月），并且不能反复冻存. 蛋白酶一般工作液浓度为,但浓缩液可配制，可用配制，也可用蛋白酶缓冲液（）；注意：)蛋白酶可以帮助渗透组织，但延长孵育时间可能导致切片脱落（）,所以要最优化孵育时间长短.时间一般为，左右地片子可以用，但左右地可用，最终通过摸索最佳时间.过长易脱片、过短起不到通透效果.)对于比较困难地组织，可以选用地枸橼酸盐缓冲液进行修复（石蜡切片无必要用），需修复)对照：阴性对照：经过固定和通透地细胞样品加入μ试剂以代替反应混合物，从标记步骤以下同上.阳性对照：经过固定和通透地细胞样品用细球菌地核酸酶或使之产生链缺口，从标记步骤以下同上.)操作流程：常规脱蜡、脱水处理——冲洗样品——滴加反应混合物，℃孵育分钟——冲洗样品——选择：荧光镜下观察分析——滴加转化剂，℃孵育分钟——洗样品——滴加底物溶液，室温孵育分钟——光镜下分析结果)假阳性多地原因有很多：封闭不全、显色时间过长等原因假阳性严重，可能原因应该是孵育时间过长，建议首先排除之，同时加强浸洗)显色时间:（）显色时间不是固定地，主要由显微镜下控制显色时间，到出现浅棕色本底时即可冲洗；（）显色时间很短（如几秒或几十秒）就出现很深地棕褐色，这很可能说明你地抗体浓度过高或抗体孵育时间过长，需要下调抗体浓度或缩短你地抗体孵育时间；（）此外，若很短时间就出现背景很深，还有可能你前面地封闭非特异性蛋白不全，需要延长封闭时间；（）显色时间很长（如超过十几分钟）才出现阳性染色，一方面可能说明你地抗体浓度过低或孵育时间过短（最好一抗度过夜）；另一方面就是封闭时间过长.)脱片产生地原因和如何防止脱片:（）多聚赖氨酸玻片质量地问题.我原先是买地，迈新按说也是不错地，可是都脱成什么样子了.后面补做第二批时用地病理科老师自己做地片子，要好一点.（）组织切地不好，切片机地问题例如比较老地旧地机器切地厚或者不均匀，或者切片者手法不好等.（）组织地问题，越是有坏死之类越容易脱.（）没烤好，时间短温度不够之类.（）操作地时候甩地太猛了，有脱片嫌疑地片子最好不甩或轻轻甩，用卫生纸从边缘上慢慢吸水.（）此外，一旦见到有组织漂起来操作就更加要谨慎，用地时候尽量用泡地，不要冲.个人收集整理勿做商业用途。

TUNEL法检测细胞凋亡实验原理和方法

TUNEL 法检测细胞凋亡实验原理和方法细胞凋亡中染色体 DNA 的断裂是个渐进的分阶段的过程,染色体 DNA 首先在内源性的核酸水解酶的作用下降解为 50-300kb 的大片段。

然后大约 30 ﹪的染色体 DNA 在 Ca ²+和 Mg²+依赖的核酸内切酶作用下, 在核小体单位之间被随机切断, 形成 180~200bp 核小体 DNA 多聚体。

DNA 双链断裂或只要一条链上出现缺口而产生的一系列 DNA 的3’ -OH 末端可在脱氧核糖核苷酸末端转移酶(TdT 的作用下,将脱氧核糖核苷酸和荧光素、过氧化物酶、碱性磷酸化酶或生物素形成的衍生物标记到 DNA 的3’ -末端,从而可进行凋亡细胞的检测, 这类方法一般称为脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法(TUNEL 。

由于正常的或正在增殖的细胞几乎没有 DNA 的断裂,因而没有3’ -OH 形成,很少能够被染色。

低分子量的DNA 分离后,也可使用 DNA 聚合酶进行缺口翻译(nick translation ,使低分子量的DNA 标记或染色,然后分析凋亡细胞。

TUNEL 或缺口翻译法实际上是分子生物学与形态学相结合的研究方法, 对完整的单个凋亡细胞核或凋亡小体进行原位染色,能准确的反应细胞凋亡最典型的生物化学和形态特征, 可用于石蜡包埋组织切片、冰冻组织切片、培养的细胞和从组织中分离的细胞的细胞凋亡测定, 并可检测出极少量的凋亡细胞, 灵敏度远比一般的组织化学和生物化学测定法要高,因而在细胞凋亡的研究中已被广泛采用。

一、过氧化物酶标记测定法原理:脱氧核糖核苷酸衍生物地高辛 [(digoxigenin -11-dUTP]在 TdT 酶的作用下, 可以掺入到凋亡细胞双链或单链 DNA 的 3-OH 末端, 与 dATP 形成异多聚体, 并可与连接了报告酶(过氧化物酶或碱性磷酸酶的抗地高辛抗体结合。

在适合底物存在下,过氧化物酶可产生很强的颜色反应, 特异准确的定位出正在凋亡的细胞, 因而可在普通光学显微镜下进行观察。

TUNEL细胞凋亡检测_荧光

TUNEL 细胞凋亡检测
1.二甲苯中脱蜡5-10分钟，换用新鲜的二甲苯，再脱蜡5-10分钟，无水乙醇5分钟，
90%乙醇2分钟，70%乙醇2分钟，蒸馏水2分钟。

2.滴加20μg/ml不含DNase的蛋白酶K（用pH7.4~8.0 10mM Tris），20-37℃作用15-30
分钟（不同组织的最佳作用温度和时间需自行摸索），用PBS洗涤3次（注意：这一步必须把蛋白酶K洗涤干净，否则会严重干扰后续的标记反应。

）。

3.标记液准备：从标记液中取100μl作为两个阴性对照，然后将TdT酶溶液（50μl）
加入到剩下的标记液（450μl）中，混匀。

4.样品的标记：在样品上加50μl 生物素标记液，37℃避光孵育60分钟（注意：孵
育时需注意在周围用浸足水的纸或药棉等保持湿润，以尽量减少标记液的蒸发）。

5.用PBS洗涤3次。

6.Mounting media 封片观察染色情况。

1.将细胞爬片在空气中风干，加入4% PFA 室温固定1h，PBS清洗3次。

2.破膜液（0.1% Triton X-100 in 0.1% 柠檬酸钠）4℃破膜2min，PBS清洗三次。

3.标记液准备：从标记液中取100μl作为两个阴性对照，然后将TdT酶溶液（50μl）
加入到剩下的标记液（450μl）中，混匀。

4.DNAase 处理阳性对照片，PBS洗涤三次。

5.样品的标记：在样品上加50μl 荧光标记液，37℃避光孵育60分钟（注意：孵育
时需注意在周围用浸足水的纸或药棉等保持湿润，以尽量减少标记液的蒸发）。

6.用PBS洗涤3次。

7.Mounting media 封片观察染色情况。

tunel 染色原理

tunel 染色原理
引言概述：
Tunel染色是一种常用的细胞学技术，用于检测细胞凋亡。

通过检测DNA断裂末端的3'-OH基团，Tunel染色可以准确地识别凋亡细胞，并在细胞核内形成明亮的荧光信号。

本文将详细介绍Tunel染色的原理，包括染色步骤、染色反应的机理、染色结果的解读以及其在研究中的应用。

正文内容：
1. Tunel染色的步骤
1.1 细胞固定和透化
1.2 凋亡诱导
1.3 染色反应
1.4 洗涤和封片
1.5 观察和分析
2. Tunel染色的机理
2.1 DNA断裂
2.2 TdT酶介导的标记
2.3 荧光探针的结合
2.4 染色信号的放大
2.5 荧光显微镜观察
3. Tunel染色结果的解读
3.1 正常细胞
3.2 凋亡细胞
3.3 背景噪声
3.4 阳性对照和阴性对照
3.5 图像分析和数据统计
4. Tunel染色在研究中的应用
4.1 细胞凋亡机制研究
4.2 肿瘤治疗效果评估
4.3 神经退行性疾病研究
4.4 肝脏损伤评估
4.5 胚胎发育研究
总结：
Tunel染色是一种可靠而广泛应用的细胞学技术，通过检测细胞凋亡的DNA断裂末端，可以准确地识别凋亡细胞。

在实验中，正确的染色步骤和机理的理解对于获得准确的结果至关重要。

Tunel染色在细胞凋亡机制研究、肿瘤治疗效果评估、神经退行性疾病研究、肝脏损伤评估以及胚胎发育研究等领域都具有重要的应用价值。

通过深入了解和熟练掌握Tunel染色的原理和操作技巧，我们可以更好地应用这一技术来推动相关领域的研究进展。

TUNEL说明书

TUNEL说明书1 介绍TUNEL是提供单细胞水平细胞凋亡的稳定系统，能够迅速、快捷、精确的检测出凋亡细胞。

该试剂盒可以通过测定核DNA片段检测组织切片和培养细胞的凋亡细胞。

多数高等真核生物的细胞都通过启动自身的细胞自杀程序实现程序性死亡或细胞凋亡。

凋亡在发育、内环境稳定和一些疾病中具有重要作用。

凋亡具有某些特定的形态学特征，包括细胞膜起泡，细胞核和细胞质固缩，染色质浓缩，并且不发生局部炎症反应。

细胞死亡与此相反，它的特点是细胞肿胀，染色质絮凝，细胞膜完整性破坏，细胞溶解和产生及局部炎症反应。

凋亡过程中，内源性Ca2+、Mg2+依赖性核酸内切酶被激活，DNA被降解而形成末端为3’－OH、含180～200碱基对的不同倍数的核苷酸片段。

TUNEL 可用于多种细胞凋亡的检测，已经经过验证的应用范围: Vibratome® 神经组织切片, Jurkat 细胞, HL-60细胞这本技术小册子包括检测组织切片和茴香霉素诱导的HL-60细胞的细胞凋亡。

检测原理: DeadEnd™ Colorimetric TUNEL 系统使用改良的TUNEL (TdT-mediated dUTP Nick-End Labeling)对凋亡细胞的断裂DNA进行末端标记。

使用末端脱氧核苷转移酶(TdT)将生物素标记的核苷被掺入到DNA的3′-OH末端。

然后，辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素(Streptavidin HRP)结合在上述生物素标记的核苷上，可以通过过氧化物酶的底物——过氧化氢和稳定的显色剂氨基联苯胺(DAB)检测到。

用这种程序，凋亡细胞的核被染成深棕色。

2 产品内容G7361平衡缓冲液（G327B）——4.8ml末端脱氧核苷酰酶酸转移酶（M828B）——20ul抗生物素蛋白链菌素辣根过氧化物酶（G714A）——40ul生物素化的核苷混合物（G715A）——20ul蛋白酶K（V302A）——10mgG7362塑料盖玻片（G326B）——2020X SSC（G329B）——20mlDAB 20X 色原体（G716A）——200ul20X DAB底物缓冲液（G717A）——200ul20X过氧化氢（G718A）——200ul储存条件: 将平衡缓冲液, TdT酶, 生物素标记的核苷混合物和蛋白酶K 储存于–20°C。

罗氏TUNEL使用说明书(中文)

罗氏公司TUNEL细胞凋亡检测程序（In situ cell death detection kit-POD法）一、原理：TUNEL（TdT-mediated dUTP nick end labeling）细胞凋亡检测试剂盒是用来检测组织细胞在凋亡早期过程中细胞核DNA的断裂情况。

其原理是荧光素（fluorescein）标记的dUTP在脱氧核糖核苷酸末端转移酶（TdT Enzyme）的作用下，可以连接到凋亡细胞中断裂DNA的3’-OH末端，并与连接辣根过氧化酶（HRP，horse-radish peroxidase）的荧光素抗体特异性结合，后者又与HRP底物二氨基联苯胺（DAB）反应产生很强的颜色反应（呈深棕色），特异准确地定位正在凋亡的细胞，因而在光学显微镜下即可观察凋亡细胞；由于正常的或正在增殖的细胞几乎没有DNA断裂，因而没有3'-OH形成，很少能够被染色。

本试剂盒适用于组织样本（石蜡包埋、冰冻和超薄切片）和细胞样本（细胞涂片）在单细胞水平上的凋亡原位检测。

还可应用于抗肿瘤药的药效评价，以及通过双色法确定细胞死亡类型和分化阶段。

二、器材与试剂器材：光学显微镜及其成像系统、小型染色缸、湿盒（塑料饭盒与纱布）、塑料盖玻片或封口膜、吸管、各种规格的加样器及枪头等；试剂：试剂盒含TdT 10×、荧光素标记的dUTP 1×、标记荧光素抗体的HRP；自备试剂：PBS、双蒸水、二甲苯、梯度乙醇（100、95、90、80、70％）、DAB工作液（临用前配制，5 µl 20×DAB＋1μL30％H2O2＋94 µl PBS）、Proteinase K工作液（10-20 μg/ml in 10 mM Tris/HCl, pH 7.4-8）或细胞通透液（0.1% Triton X-100 in 0.1% sodium citrate，临用前配制）、苏木素或甲基绿、DNase 1（3000 U/ml– 3 U/ml in 50 mM Tris-HCl，pH 7.5, 10 mM MgCl2，1 mg/ml BSA）等。

细胞凋亡检测之Tunel法的实验步骤

细胞凋亡检测之Tunel法的实验步骤如今，细胞凋亡检测是目前非常热门的研究方向，它不仅可以用于肿瘤细胞和组织在内的不同种类病理标本研究，还能应用于临床诊疗、新药研制、生物制品开发、肿瘤放化疗、以及肿瘤的基因治疗等，对于相关疾病的早期发现、放化疗的疗效评价也具有举足轻重的地位。

目前研究组织体内细胞凋亡最广泛的方法是什么呢?无疑是——Tunel 法，它不仅能检测早期基因组的断裂，还能能通过标记的多少，进行半定量研究。

首先，我们先来看一下细胞凋亡和细胞坏死的区别：Tunel法应用Tunel是分子生物学与形态学相结合的研究方法，对完整的单个凋亡细胞核或凋亡小体进行原位染色，能准确地反应细胞凋亡典型的生物化学和形态特征，可用于石蜡包埋组织切片、冰冻组织切片、培养的细胞和从组织中分离的细胞的细胞形态测定，并可检测出极少量的凋亡细胞，因而在细胞凋亡的研究中被广泛采用。

Tunel法详细的实验步骤1. 常规方法制作石蜡切片，用二甲苯浸洗2次，每次5min;2. 用梯度乙醇(100、95、90、80、70%)各浸洗1次，每次3min;3. PBS漂洗2次;用Proteinase K工作液(20ug/ml)处理组织15-30 min 在21–37°C(温度、时间、浓度均需摸索)或者加细胞通透液8min;4. 加入含2%过氧化氢的PBS，室温反应5min，PBS漂洗2次5. 制备TUNEL反应混合液，处理组用50μl TdT+450μl 荧光素标记的dUTP液混匀;而阴性对照组仅加50μl 荧光素标记的dUTP液，阳性对照组先加入100μl DNase 1，反应在15~25℃×10min，后面步骤同处理组。

6. 玻片干后，用滤纸小心吸去切片周围多余液体，加50μl TUNEL反应混合液(阴性对照组仅加50μl 荧光素标记的dUTP液)于标本上，加盖玻片或封口膜在暗湿盒中反应37℃×1h。

7. 加入到已预热37℃的洗涤与终止反应缓冲液，37℃保温30min，PBS 漂洗3次;8. 可以加1滴PBS在荧光显微镜下计数凋亡细胞(激发光波长为450~500nm，检测波长为515~565nm);9. 玻片干后加50μl DIG-POD于标本上，加盖玻片或封口膜在暗湿盒中反应37℃×30min。

tunel检测步骤

tunel检测步骤
摘要：
一、Tunel检测简介
1.Tunel检测的定义
2.Tunel检测的应用场景
二、Tunel检测步骤
1.样本准备
2.固定细胞
3.通透细胞
4.标记荧光探针
5.孵育
6.检测
7.数据分析
正文：
Tunel检测是一种用于检测细胞凋亡的分子生物学方法，它通过检测细胞核内的DNA片段，来判断细胞是否发生了凋亡。

Tunel检测的应用场景广泛，包括细胞凋亡研究、药物筛选、肿瘤诊断等。

Tunel检测的具体步骤如下：
首先，进行样本准备。

这一步包括收集细胞、处理细胞、以及将细胞固定在载玻片上。

其次，对固定好的细胞进行通透处理。

这一步是为了让荧光探针能够进入
细胞内，与DNA结合。

然后，标记荧光探针。

这一步中，荧光探针会与DNA结合，从而使发生凋亡的细胞核发出荧光信号。

接着，进行孵育。

孵育的目的是让荧光探针与DNA结合得更紧密，从而提高检测的准确性。

然后，进行检测。

这一步中，使用荧光显微镜观察细胞核，看是否有荧光信号。

最后，进行数据分析。

通过统计发出荧光信号的细胞数量，可以得出细胞凋亡的比例。

tunel法检测细胞凋亡原理

tunel法检测细胞凋亡原理一、介绍细胞凋亡是细胞程序性死亡的一种形式，它在多种生理和病理过程中发挥重要作用。

tunel法（Terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling）是一种常用的检测细胞凋亡的方法，它利用细胞凋亡时DNA断裂产生的末端暴露的3’-OH末端为基础，通过连接dUTP标记的核苷酸，再经过酶促反应形成标记物，最终通过染色和显微镜观察来检测细胞凋亡。

本文将深入探讨tunel法检测细胞凋亡的原理、步骤以及其优缺点和应用。

二、tunel法的原理1.细胞凋亡的DNA断裂细胞凋亡在DNA断裂的过程中，导致DNA链上产生单链和双链断裂，这些断裂可暴露3’-OH末端。

这些断裂的末端会暴露出来，为tunel法提供了基础。

2.核苷酸连接在tunel法中，细胞内的3’-OH末端与dUTP（脱氧尿嘧啶核苷酸）结合，形成连接的核苷酸。

3.核酸标记连接的核苷酸可以通过酶促反应来标记。

一般使用terminaldeoxynucleotidyl transferase（TdT）酶，它能够将标记物连接到核苷酸的3’-OH末端。

4.核酸染色标记后的核酸可以通过荧光染色或者抗体染色来可视化。

tunel法通常使用具有荧光标记的抗体，这样可以直接观察细胞凋亡的情况。

三、tunel法的步骤tunel法的主要步骤包括样品的处理、反应体系的建立、酶促反应和染色。

下面是一个通常的tunel法的实验步骤：1.样品的制备将要研究的细胞或组织制备成切片或细胞悬液的形式。

对于固定的组织样品，可以通过切片的方式得到。

2.反应体系的建立根据实验的需要，建立适当的反应体系。

通常使用含有一定浓度TdT酶和dUTP的反应缓冲液，其中还包括辅酶和其他必要的试剂。

3.酶促反应将反应体系与样品共同处理，保持一定的反应时间，以便TdT酶能够与3’-OH末端发生连接作用。

4.染色完成酶促反应后，使用荧光标记的抗体或者其他染料染色，以便观察细胞凋亡的情况。

TUNEL法检测细胞凋亡实验原理和方法tunel完成

TUNEL
TUNEL的原理 TUNEL的操作步骤结果及注意事项
主要试剂
1. 缓冲液(Labeling Buffer)：
用于维持一定的反应条件，含有以下成分：500mmol/L二甲胂酸钾、 pH7.2 10mmol/L CoCl2 (氯化钴)、1mmol/L DTT(二硫苏糖醇)。
2.末端脱氧核糖核酸转移酶(TdT) ：
TUNEL的原理是：用荧光素（fluorescein）标记的脱氧核糖核苷酸，在TdT 的作用下连接到凋亡细胞中断裂DNA的3’-OH末端，用荧光显微镜即可观察结果。在此基础上连接辣根过氧化酶标记的荧光素抗体，可进一步放大检测信号，并且普通显微镜观察实验结果。由于正常的或正在增殖的细胞几乎没有 DNA的断裂，因而没有3’-OH形成，很少能够被染色。
TUNEL原理
标 ’-OH末端 dUTP反应的关键酶
3.荧光素-dUTP ：
TdT的底物和本实验的标记物
4.蛋白酶K：
消化组织，增加细胞通透性
TUNEL的原理
凋亡细胞的特征是:内源性核酸内切酶被激活，细胞自身的染色质DNA被切割，出现单链或双链缺口，并产生与DNA断点数目相同的 3’-OH末端。末端脱氧核糖核酸转移酶(Terminal deoxynucleotidyl Transferase TdT)能将脱氧核糖核苷酸连接到DNA 的3’-末端。

TUNEL 法测凋亡操作步骤

TUNEL 法测凋亡操作步骤一、TUNEL检测原理TUNEL 细胞凋亡检测试剂盒是采用非同位素方法来检测细胞在凋亡过程中DNA 的断裂情况，可在原位快速准确地检测单个凋亡细胞。

本试剂盒适用于组织样本（石蜡包埋、冰冻和超薄切片）和细胞样本（细胞涂片）的凋亡原位检测。

其原理是细胞凋亡发生时，内源性核酸酶激活，使DNA的双链断裂或一条链出现缺口，产生一系列3’-OH末端，在脱氧核糖核苷酸末端转移酶（TdT）作用下，组织细胞原位DNA切口可被标记上生物素-dUTP，即TUNEL（Terminal deoxynucleotidyl TransferaseBiotin-dUTP Nick End Labeling），可与连接了的辣根过氧化酶的链霉亲和素（Streptavidin-HRP）特异结合，在辣根过氧化酶底物二氨基联苯胺（DAB）的存在下，显示为棕色（过氧化物酶活性），特异准确地定位正在凋亡的细胞，在普通显微镜下即可观察和计数凋亡细胞；由于正的或正在增殖的细胞几乎没有DNA 的断裂，因而没有3'-OH 形成，很少能够被染色。

二、试剂盒组份组份10 assays25 assays 储存条件A：Equilibration Buffer 1.0 mL 2.5 mL -20 ℃B：Biotinylated Nucleotide Mix 10 μL 25 μL -20 ℃C：TdT Enzyme 10 μL 25 μL -20 ℃D：500×Proteinase K 10 μL 25 μL -20 ℃20×SSC 15 mL 38mL 4 ℃E：Streptavidin-HRP 10 μL 25 μL 4 ℃F：20×DAB Substrate Buffer 50 μL 125 μL 4 ℃G：20×DAB Chromogen 50 μL 125 μL 4 ℃H：20×Hydrogen Peroxide 50 μL 125 μL4 ℃三、操作流程1.操作流程概览2.细胞样本制备准备：● PBS：8.0g NaCl， 0.2 g KCl， 1.44g Na2HPO4，0.24g KH2PO4，溶于800ml去离子水中，HCl调pH至7.4，加水定容至1L。

TUNEL 法检测细胞凋亡的具体方法及详细步骤

TUNEL 法检测细胞凋亡的具体方法及详细步骤用了许多方法检测小鼠的肝脏、脑部、睾丸等组织的细胞凋亡，其中TUNEL 法做的最多，我购买的试剂盒主要是roche、promega 公司，结果大多数成功，偶尔也有失败。

TUNEL 法的实验原理基本原理：对不同组织切片先增加细胞膜通透性，然后让rTDT 和生物标记的dTUTP 进入细胞内，在rTDT 的辅助下dTUTP 与核断裂的 DNA 3』-OH 结合，再用HRP 标记的链霉亲和素与dTUTP 上的biotin 结合（每个链霉亲和素至少可以再结合3 个biotin 分子），最后用DAB、过氧化氢与SP 上的辣根过氧化物酶HRP 发生氧化、环化反应，形成苯乙肼聚合物而呈现棕褐色，最终通过计数每张切片上不同视野中TUNEL 阳性细胞的比例来判断细胞凋亡发生情况。

（小编碎碎念：掌握原理是做好实验的先决条件，不少人还以为是抗体抗原反应呢）TUNEL 实验中关键步骤1. 充分脱蜡和水化。

脱蜡可以先60ºC 20 min，再用使用二甲苯两次5-10 min；而水化用梯度乙醇从高浓度到低浓度浸洗，这些以便后面的结合反应充分、均匀；2. 把握好细胞通透的时间。

一般根据切片的厚薄，选择蛋白酶k 的孵育时间，常用10-30 min，几μm 切片用短时间；几十μm 切片用长时间，通过摸索达到既不脱片，有能够使后面的酶和抗体进入胞内。

3. 适当延长TUNEL 反应液的时间。

一般是37ºC 1 h，你也可以根据你的凋亡损伤程度，选择更长的时间，可长至2 h，但要结合你最终的背景着色。

4.DAB 显色条件的选择。

一般DAB 反应10 min 左右，结合镜下控制背景颜色，最长不超过30 min；promega 公司提供的DAB 液（桃红色），不利于辨认棕褐色，我不太喜欢。

5.PBS 的充分清洗。

我个人认为，在TUNEL 反应后和酶标反应后的清洗应十分严格，可增加次数达5 次，因为这些清洗直接决定最后切片的非特异性着色。

TUNEL检测细胞凋亡实验报告

TUNEL法检测细胞凋亡实验实验原理：细胞凋亡是生物体内细胞在特定的内源和外源信号诱导下,其死亡途径被激活,并在有关基因的调控下发生的程序性死亡过程。

细胞凋亡涉及caspase活化、线粒体跨膜电位下降，位于细胞膜脂内层的磷脂酰丝氨酸转位到蛋白表面，DNA呈规律性断裂等。

基于这些特征，多种检测凋亡的方法也迅速发展起来，常用的方法包括形态学检查，分子生物学方法，免疫电泳和细胞学检查。

TUNEL，为原位末端转移酶标记技术。

其原理是：先增加细胞膜通透性，让rTDT和荧光素生物素标记的dUTP进入细胞内，在脱氧核糖核苷酸末端转移酶的辅助下将脱氧核糖核苷酸和荧光素等形成的衍生物标记到DNA的3’末端，从而可进行凋亡细胞的检测。

最终通过计数每张切片上不同视野中TUNEL阳性细胞的比例来判断细胞凋亡发生情况。

实验前准备在开始实验前，确保所用到的试剂都准备到位。

如：0.2% TritonX 100，TUNEL检测试剂盒（包含10× TdT酶浓缩液、荧光素标记的1× dUTP、转化剂POD），DAB试剂盒，3%过氧化氢甲醇，磷酸缓冲液PBS等。

本实验所使用到的仪器和耗材有：芬兰百得公司提供的移液器，赛默飞公司的QSP盒装吸头，湿盒，恒温箱等。

本次TUNEL实验按照以下常规步骤来展开，首先样品处理，封闭内源性过氧化物酶干扰后进行细胞通透化。

滴加TUNEL反应液反应后POD转换，DAB显色后在显微镜下观察并进行结果分析。

样品处理在标有实验组，阳性对照组和阴性对照组的切片上滴加4%不含甲醇的甲醛室温固定10min。

弃去甲醛，用PBS洗两次，每次5min。

封闭用滤纸擦去周围多余的PBS，滴加3%过氧化氢甲醇，室温孵育10min，消除内源性过氧化物酶干扰后，弃去将载玻片用PBS洗2次，每次5min。

细胞通透化去尽PBS后，滴加100μl由PBS配制的0.2% TritonX 100。

于湿盒中室温孵育5min。

TUNEL染色方法

U /100µl
1000 U-2000 U 2000 U-3000 U 3000 U-5000 U
DNaseⅠ(50 U/µl) 用量
20μl-40μl
40μl-60μl
60μl-100μl
DNaseⅠBuffer 用量
80μl-60μl
60μl-40μl
40μl-0μl
9. 在一张样本上滴加 100µl 上述配制好的 DNaseⅠ反应液，室温～37℃处理 10～30min，
Streptavidin-HRP，即用即配，注意避光；
15. 样本周围用吸水纸吸干，每个样本上滴加 50µl Streptavidin-HRP 工作液，加盖玻片放入温盒中，37℃
避光反应 30min；
16. 反应后的样本片浸入 1×PBS 漂洗三次，每次 5min;
17. 配制 DAB 工作液: 计算好样本数量集中配制，每个样本样本用量为：50 µl dH2O 加入 2.5µl DAB -A
一、TUNEL 检测原理
凯基快速型 TUNEL 细胞凋亡检测试剂盒是用来检测细胞在凋亡过程中细胞核 DNA 的断裂情况，其原理是生物素（Biotin）标记的 dUTP 在脱氧核糖核苷酸末端转移酶（TdT Enzyme）的作用下,可以连接到凋亡细胞中断裂 DNA 的 3′-OH 末端，并可与连接辣根过氧化酶的链霉亲和素（Streptavidin-HRP）特异结合，在辣根过氧化酶底物二氨基联苯胺（DAB）的存在下，产生很强的颜色反应（呈深棕色），特异准确地定位正在凋亡的细胞，因而在普通显微镜下即可观察和计数凋亡细胞；由于正常的或正在增殖的细胞几乎没有 DNA 的断裂，因而没有 3′-OH 形成，很少能够被染色。本试剂盒适用于组织样本（石蜡包埋、冰冻和超薄切片）和细胞样本（细胞涂片或爬片）的凋亡原位检测。

TUNEL染色

TUNEL （TdT—mediated dUTP Nick-End Labeling)法检测细胞凋亡实验原理和方法原理：细胞凋亡中染色体DNA的断裂是个渐进的分阶段的过程，染色体DNA首先在内源性的核酸水解酶的作用下降解为50—300kb的大片段。

然后大约30 ﹪的染色体DNA在Ca ²和Mg²依赖的核酸内切酶作用下，在核小体单位之间被随机切断,形成180～200bp核小体DNA多聚体。

DNA双链断裂或只要一条链上出现缺口而产生的一系列DNA的3’-OH末端可在脱氧核糖核苷酸末端转移酶（TdT）的作用下，将脱氧核糖核苷酸和荧光素、过氧化物酶、碱性磷酸化酶或生物素形成的衍生物标记到DNA的3’—末端，从而可进行凋亡细胞的检测，这类方法一般称为脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法（TUNEL）。

由于正常的或正在增殖的细胞几乎没有DNA的断裂,因而没有3’—OH形成,很少能够被染色。

实验方法TUNEL检测对于贴壁细胞或细胞涂片a. PBS或HBSS洗涤一次.b。

如果细胞贴得不牢,可以干燥样品使细胞贴得更牢。

c. 用4%多聚甲醛或碧云天生产的免疫染色固定液（P0098)固定细胞30-60分钟。

d. 用PBS或HBSS洗涤一次.e。

加入含0。

1％Triton X—100的PBS，冰浴孵育2分钟。

f. 转步骤5。

TUNEL检测对于悬浮细胞或细胞悬液a. 收集细胞(不超过200万细胞)，PBS或HBSS洗涤一次。

b。

用4％多聚甲醛固定细胞30-60分钟.为防止细胞聚集成团,宜在侧摆摇床或水平摇床上缓慢摇动的同时进行固定。

c. 用PBS或HBSS洗涤一次。

d。

用含0。

1% Triton X-100的PBS重悬细胞，冰浴孵育2分钟。

e。

转步骤5。

TUNEL检测对于石蜡切片a. 二甲苯中脱蜡5-10分钟.换用新鲜的二甲苯,再脱蜡5—10分钟。

无水乙醇5分钟。

90％乙醇2分钟。

70％乙醇2分钟，蒸馏水2分钟.b。