Ca离子通透型AMPA受介导恐惧记忆的擦除的动力学研究

Ca离子通透型AMPA受介导恐惧记忆的擦除的动力学研究在啮齿类动物模型中，创伤性的恐惧记忆可以通过行为疗法或者消退训练得以抑制其显现，但是容易复发。

然而，在某些情况下这些疗法会对（动物）行为产生持久性的影响，同时间接表明这些疗法会对情绪记忆产生擦除效应。

这种另类副反应产生的神经学基础是未知的。

我们发现了一个在消退训练导致恐惧擦除的过程中十分重要的成分，即在杏仁体侧核与突触相关的AMPARs（α-氨基羟甲基恶唑丙酸受体）的消除。

对这种可调组分的短暂性的上调牵涉到AMPA受体的谷氨酸受体1亚基的磷酸化，解释了通过行为适应训练能够降低颞窗的恐惧记忆的原因。

这些结果为我们提供了有关恐惧记忆擦除和短时记忆的相对不持久性的一种分子机制解释。

恐惧条件反射是对中性刺激（条件刺激）产生的情绪上反应的一种升级，这个条件刺激与一种不好的活动（非条件刺激）相伴产生。

在初次学习的几个月后，恐惧记忆会作为对条件刺激的防御性反应而出现。

然而，当这些特定的受试者多次地遭受伴随没有附加非条件刺激的条件刺激时，受试者对于这种不会带来预期损害的条件刺激的恐惧反应会逐渐减少，这个过程我们称作消退训练。

这个模型跟人类对创伤记忆的基于暴露的治疗类似，在这种治疗方法中不好的恐惧会通过暴露于那些曾出现在创伤产生时的刺激中加以抑制。

然而，由于通过这些疗法恐惧记忆还是能复发，所以消退训练还是有可能保存了一些情绪性的记忆，这些记忆会在后来的时间里被特定的刺激信号激活。

许多研究表明更持久的恐惧减轻要取决于进行消退训练时的很多因素，比如受试者的年龄，治疗刺激的时间间隔，以及距离首次学习经历的时间。

因为在某些情况下甚至更强的暗示信号也不会导致有条件的刺激的复发，这个令人着迷的事情的原因可能是因为在消退训练的过程中产生了恐惧性记忆的持久性消除。

这种技术方法对于治疗情绪错乱也是有帮助的。

然而，要扩大这种方法的使用需要对引起恐惧消除的细胞和分子机制有一个理解，但这个机制至今仍不明朗。

大量证据表明杏仁体神经环路的可塑性构成了存在于动物模型和人类中的恐惧条件反射的基础。

认为位于杏仁体侧核的谷氨酸能突触传递的增效作用介导了信号依赖的恐惧条件反射的产生。

相应地，我们也观察到了经过听觉性恐惧条件反射刺激后位于丘脑到杏仁体侧核的传入神经的兴奋性突触后电流的一种增强放大作用。

这种放大作用不管对于诱发的AMPAR-NMDAR介导的电流（1图AB和S1图），还是对于对于大量AMPAR缩小EPSC（兴奋性突触后电流）都是明显的（1图CD和S2图）。

这些增强作用持续了7天，表明这种增强效应可能引起了恐惧记忆的长期维持。

在贯穿人脑的所有重要神经元中，包含有2型亚基谷氨酸盐受体(GluA2)的AMPARs 占有优势。

然而，在体内的过程导致了在其他大脑区域的AMPARs从包含GluA2到GluA2缺乏的一个转变，这个过程就是我们所知道的钙离子通透性。

我们因此就对恐惧条件反射之前和之后位于丘脑突触的钙离子通透型α-氨基羟甲基恶唑丙酸受体（CP-AMPARs）进行了分析。

在幼稚的动物中，AMPAR-EPSCs的伏安特性的情况揭示了轻微程度的内向整流（S3图），即CP-AMPARs的一个标记，而且这个整流效应可以被CP-AMPAR的抑制剂NASPM所消除。

很明显，对恐惧条件反射的反应的观察揭示了对于整流效应的一种缓慢持续增强作用（1图EF，图S4和S5），反映了通过NASPM对于AMPAR-EPSC抑制作用的一种增强（图S6）。

不管是增强的整流作用还是对于NASPM的敏感性都出现在接受条件刺激后的几个小时内，在24小时达到顶峰，到第七天的时候消失。

这样，突触恰恰在传输强度保持恒定的情况下被瞬时加入的CP-AMPARs修饰了。

一种过程依赖的突触衰弱的体内模型——长时程抑制伴随着其他系统中的CP-AMPARs的运输。

因此我们考察了在条件刺激之前和之后的大脑切片中，CP-AMPARs 的存在对于长时程抑制的影响。

在幼稚动物中，当杏仁体侧核神经被轻微地去极化连同低频率的成对脉冲刺激会诱导产生长时程抑制（LTD）（图1G）。

NMDARs和亲代谢性谷氨酸盐1型受体（mGluR1）而不是5型一起介导了对于这种形式的长时程抑制的诱导(图S7)。

当在低频率的成对脉冲刺激之后给予NASPM处理，神经元的EPSC振幅中不再显示出进一步的减少，除非当长时程通过被亲代谢性谷氨酸盐1型受体的抑制而阻断（图1G）表明长时程抑制可以通过选择性地移除CP-AMPARs而得以表现出来。

有意思的是，接受恐惧条件刺激24小时后，当CP-AMPARs被激发，长时程抑制的强度就会变得更大（图1H）。

CP-AMPARs的突触性移除也在这个时候介导长时程抑制，因为AMPAR的整流（图S8）和对NASPM的敏感性（图1H）都会被低频率的成对脉冲刺激所消除。

这些结果表明，CP-AMPAR也参与了在恐惧条件刺激后通过mGluR1依赖型的LTD来增强导致突触衰弱的能力。

由于突触的CP-AMPARs在接受恐惧刺激后一天时达到峰值，我们假设通过移除CP-AMPARs实现的恐惧依赖性突触强化的逆转在这个时候若采用特定的消退步骤方法可能更容易实现。

有趣的是，近期一个完全能够消除恐惧的消退训练流程（这里指的是”更新重建”训练）已经有了。

这个流程针对记忆再现后的一个不稳定的时期，这时给予遗忘性药物处理就会导致完全的记忆丢失。

同样道理，在这个时期进行消退训练也会永久性地减轻恐惧。

这种效应最关键的一点是在消退之前的十分钟到6小时之间暴露于单一孤立的条件刺激（记忆再现）中。

这样，我们将我们的小鼠在消退之前和随后的30分钟进行了记忆再现（图2A），我们在自发性的恢复和更新测试中检测到了恐惧的复发（图2DEF）。

自发性恢复随着时间推移被动地发展，而且在消退的背景下测量，虽然恢复可以在训练时的任何时间被条件刺激型暴露所触发。

作为阴性对照，采用相同的处理方式来检测，除了忽略掉了记忆重现，而且在消退训练中给予了一个额外的条件刺激以使全部的条件刺激数目跟实验组一样（图2ABC，没有恢复）。

当消退训练实施在条件反射形成之后（作为0天），两组在第二天都没有显示出自发性的恢复（图2D）。

然而，阴性对照组却在第二天，并直到第七天显示出明显的改善恢复，在消退训练的第一天就表现出自发恢复（图2E）。

相反，回忆再现在第一天就消失的小鼠在任何情况下都没有恐惧的恢复（图2DE），与恐惧擦除的情形一致。

为了测定是否”更新重建”（比如长时程抑制诱导的CP-AMPARs的消除（图1G））需要mGluR1的激活，我们检测了在那些在恢复消退前1小时接受系统性AIDA处理的小鼠的恐惧恢复情况（图2G）。

AIDA 注射的小鼠，不是打生理盐水的那一组，在第七天的自发性恢复和更新测试中显示出明显的恐惧恢复。

这样，”更新重建”和CP-AMPAR介导的LTD都需要mGluR的激活。

接下来我们就测量了已准备好的在”更新重建”后的第一天时的脑切片中是否是突触抑制引起了恐惧记忆擦除。

这里我们又加入了两个额外的控制因素来检测再现型和非再现型消退训练可能对突触性能不同影响的原因（图3A）。

接受了条件/非条件刺激的未配对对照对与记忆形成不相干的刺激影响的控制因素是明确的不成对的。

遭受了成对的条件刺激并暴露于消退训练的场景中仅给予背景处理的对照组并没有给予任何声音处理。

正如所预料的那样，仅给予背景处理的小鼠在背景暴露两小时后表现出很高的声音诱发的冻结（图3B）。

虽然在自发性恢复测试中无恢复的对照组比仅接受背景处理的小鼠明显显示出less freezing，在条件刺激背景下的恐惧重建消除了这种差异。

相反的，接受两种测试情况下的恢复小鼠比仅背景处理的对照组表现更低的freezing（图3B），而且在第七天再次测试时这种差异仍然存在（图S9）。

恢复组相比仅背景处理组和非恢复组在接受“更新重建”两小时后的电生理学记录很明显地显示出AMPAR介导的信号传输有明显的减少（图3CD和图S9），表明“更新重建”过程逆转与恐惧相关突触的能力加强了。

这种逆转伴随有选择性地移除CP-AMPARs突触，同样的AMPAR-EPSCs以及对NASPM的敏感性在“更新重建”后都有了极大的减少（图3EF）。

因为相比仅背景处理的对照组没有在未恢复动物的AMPAR-EPSCs中看到消退训练的影响，我们得出结论：“更新重建”可以通过移除CP-AMPARs来神奇地减少冲动传递。

此外，低频率的成对脉冲刺激揭示长时程抑制在仅背景处理和未恢复动物中有明显的加强（图3G），表明CP-AMPAR的参与可以增加突触衰弱的能力。

相反的，由于先前在恢复动物突触中CP-AMPARs的移除，更进一步的突触抑制被阻断了。

NASPM在LTD之后对此也没有影响，表明针对CP-AMPAR传输的大量突触活性减少并不能解释在LTD中的改变。

在上述的实验中，在恐惧条件刺激后第一天就接受了“更新重建”，此时CP-AMPARs 被短暂地激发，而且很容易通过“更新重建”而被移除。

为了检测一下在CP-AMPARs 平息时擦除是否依然有效，我们在第七天施用了“更新重建”。

在这个例子中我们在第十四天观察时发现未恢复组合恢复组都有明显的恐惧恢复（图2F）。

此外，在第七天，“更新重建”针对未恢复消退在降低恐惧方面没有任何益处，表明在消退训练时充足的CP-AMPARs使擦除成为可能。

我们已经证实了CP-AMPARs在“更新重建”中的一个作用，我们接下来研究他们突触传递分子方面的必须条件。

条件型的恐惧需要含有AMPARs的谷氨酸1型受体（GluA1），这些受体磷酸化依赖的信号传输构成突触可塑性的基础。

蛋白激酶A的磷酸化靶点是位于GluA1的845号丝氨酸，这个靶点跟CP-AMPARs的稳定性调控有关。

因此我们就在这个靶点被敲除的突变小鼠上考察了CP-AMPARs的动力学过程。

丙氨酸靶向替换掉PKC和CaMKII的831号丝氨酸，但接受条件刺激24小时之后在整流方面依然是增加的（图4AB）。

然而，明显可以看出PKA靶点845号丝氨酸的突变小鼠中因恐惧导致的CP-AMPAR电流的增强作用已完全无效（图4AC）。

尽管他们在蓄积CP-AMPARs方面是无效的，但S845A突触却仍然在恐惧条件刺激下是有效的（图4DEF）。

然而，由于CP-AMPAR动力学过程的缺失，在S845A的突变体中长时程抑制却没有受到恐惧条件刺激或者消退训练的影响（图4G）。

由于CP-AMPAR突触的移除构成了“更新重建”的基础，接下来我们在GluA1突变体小鼠检测了恐惧记忆的擦除。

在接受条件刺激的第0天对S845A 的动物还野生型的同窝动物给予同等程度的冰冷处理，并在第一天进行“更新重建”（图4HI和图S10）。