(精品)直接化学发光免疫分析用吖啶酯直接标记抗体抗原

- 间接偶联：用功能交联剂在标志物分子和被标志物之
间插入一条链或一个基团，使两种物质通过“桥”连接成
结合物。优点：增加反应活性，减弱空间位阻效应。
被标志物保持自身的特性（抗体特性），又具有标志物特性（发光/催化发光）
1. 碳二亚胺（EDC）缩合法
2. 过碘酸钠氧化法
3．重氮盐偶联法
4. N-羟基琥珀酰亚胺活化法
激发能不同:
化学发光:化学能 光照发光(荧光):光能
化学发光
化学发光（chemiluminescence）是指伴随化学反 应过程所产生的光的发射现象。某些物质(发光剂) 在化学反应时，吸收了反应过程中所产生的化学能， 使反应的产物分子或反应的中间态分子中的电子跃 迁到激发态，当电子从激发态回复到基态时，以发 射光子的形式释放出能量，这一现象称为化学发光。
化学发光剂
在化学发光反应中参与能量转移并最终以 发射光子的形式释放能量的化合物，称为化 学发光剂或发光底物。
㈠直接化学发光剂
直接化学发光剂在发光免疫分析过程中不需 酶的催化作用，直接参与发光反应，它们在化 学结构上有产生发光的特有基团，可直接标记 抗原或抗体。
1. 吖啶酯 在碱性条件下被H2O2氧化 时,发出波长为470nm的光，具有很高的 发光效率，其激发态产物 N-甲基吖啶 酮是该发光反应体系的发光体。
自动化免疫浊度分析
一、免疫透射比浊法
（一）原理：
一定波长的入射光线通过抗原抗体反应后的溶液 时，被其中的免疫复合物微粒吸收、反射和折射而 减弱，在一定范围内，吸光度与免疫复合物量呈正 相关，而形成的免疫复合物量与参与反应的抗原和 抗体的量呈正相关。与已知浓度的抗原标准品比较， 可确定标本中抗原含量。
N-甲基吖啶酮
2．三联吡啶钌 三联吡啶钌 [RU(bpy)3]2+是 电化学发光剂，它和电子供体三丙胺（TPA） 在阳电极表面可同时失去一个电子而发生氧化 反应。
三联吡啶钌
电化学发光剂反应原理
㈡ 酶促反应发光剂： 是利用标记酶的催化作用，使发光剂（底 物）发光，这一类需酶催化后发光的发光剂 称为酶促反应发光剂。
仪器测定技术要点
• 抗原抗体结合 • 洗涤、分离 • 加入氧化剂发光 • 信号检测
吖啶酯标记化学发光免疫测定示意图
吖啶酯标记化学发光免疫分析方法学评价
• 反应简单快速，不需要催化剂 • 发光迅速，背景噪音低，敏感性高 • 吖啶酯直接标记抗体 • 发光时间短，对信号检测仪要求高
二、化学发光酶免疫分析
式I θ中为与入射光成θ角处散射光强度；λ和I0为入 射光的波长和强度；dn/dc为校正因子，反映了溶液折 射指数和颗粒浓度的变化；M为颗粒分子量；c为浓度； N为阿佛加德指数；γ为颗粒到检测器的距离；θ为散 射光与入射光的夹角（散射夹角）。
散射颗粒与散射光
• 两种散射：Rayleigh-散射（颗粒直径<<入射光波长: 均匀散射）、Mile-散射（颗粒直径≈或>入射光波长: 不均匀散射）
• 大多数蛋白质分子直径比光波长小很多，因而只产 生Rayleigh-散射
• Rayleigh散射：散射光的强度与复合物的量呈正比、 与入射光波长成反比。
• 散射免疫比浊分析时一定要保持抗体过量，以维持 抗原抗体复合物的相对不溶解性；
• 测定的散射信号值应在曲线的上升臂部位，浊度信 号与待测抗原量呈正比。
冲洗后
（2） 加入碱 （pH>10）
发光
吖啶酯标记化学发光免疫分析仪
吖啶酯标记的化学发光免疫分析仪是一种用发光剂直接标 记抗体或抗原的一类免疫分析法。该仪器利用化学发光技术 和磁性微粒子分离技术，以吖啶酯为化学发光剂，以细小的 顺磁性微粒为固相载体。其测定原理有双抗体夹心法、双抗 原夹心法和竞争结合法等。
化学发光酶免疫分析（chemiluminescence enzyme immunoassay，CLEIA）是用参与催化某一化学发光反应的酶 如辣根过氧化物酶（HRP）或碱性磷酸酶(ALP)来标记抗原或抗 体，在与待测标本中相应的抗原(抗体)发生免疫反应后，形成固 相包被抗体-待测抗原-酶标记抗体复合物，经洗涤后，加入底物 (发光剂)，酶催化和分解底物发光，由光量子阅读系统接收，光 电倍增管将光信号转变为电信号并加以放大，再把它们传送至 计算机数据处理系统，计算出测定物的浓度。
2. 抗原过量检测
(1) 抗体适当过量 (2) 对抗原过量进行阈值限定
定时散射比浊法测定原理示意图
(二)速率散射比浊法（rate nephelometry）
速率散射比浊法是抗原抗体结合反应的动力学测定 法。连续测定各时间复合物形成的速率与其产生的散 射光信号联系在一起，形成动态的速率散射比浊法， 每项检测仅1～2min即可完成。
化学发光免疫分析的类型：
一：直接化学发光免疫分析 二：化学发光酶免疫分析 1.辣根过氧化物酶标记的化学发光 2.碱性磷酸酶标记的化学发光 三、电化学发光免疫分析
一、直接化学发光免疫分析
用吖啶酯直接标记抗体(抗原)，与待测标本中相应的抗原 (抗体)发生免疫反应后，形成固相包被抗体-待测抗原-吖啶 酯标记抗体复合物，这时只需加入氧化剂（H2O2）和 NaOH使成碱性环境，吖啶酯在不需要催化剂的情况下分 解、发光 。
1．鲁米诺及其衍生物 2．金刚烷衍生物（AMPPD）
1．鲁米诺 鲁米诺发光原理
2．AMPPD
〔3-(2‘-螺旋金刚烷)-4-甲氧基-4-(3“-磷酰氧基)苯-1,2-二氧杂环丁烷〕〕
发光剂的标记技术
• 分类： - 直接偶联：通过偶联反应使标志物分子中反应基团直
接连接到被标志物分子的反应基团上。
免疫散射比浊法
• 定时散射比浊法 • 速率散射比浊法
(一)定时散射比浊法（fixed time nephelometry）
定时散射比浊法是在保证抗体过量的情况下，加入 待测抗原，此时反应立即开始，在反应的第一阶段， 溶液中产生的散射光信号波动较大，所获取的信号 计算出的结果会产生一定的误差。定时散射比浊法 是避开抗原抗体反应的不稳定阶段，即散射光信号 在开始反应7.5s～2min内的第一次读数，专门在抗 原抗体反应的最佳时段进行读数，将检测误差降到 最低。
免疫比浊分析的影响因素和临床应用
（一）免疫比浊分析的影响因素
1.抗原抗体比例 2.抗体的质量 3.增浊剂的使用
4.伪浊度 5.入射光光源和波长 6.结果报告中的计量单位
7.标准曲线制备与质量控制
（二）临床应用
免疫比浊分析法主要用于检测免疫球蛋白IgG、IgA、 IgM、κ链、λ链、免疫球蛋白亚类；补体C3、C4；血 浆蛋白如前白蛋白(PAB)、白蛋白(ALB)、α1-抗胰蛋白 酶(α1-AT)、β2-微球蛋白(β2-MG)、转铁蛋白(TRF)、 铜蓝蛋白(CER)、结合珠蛋白(HP)、，C-反应蛋白 (CRP)、载脂蛋白ApoAI、ApoB、脂蛋白(a)、类风湿 因子(RF)、尿微量蛋白系列和某些治疗性药物浓度等。
（二）仪器工作过程
1.将待检标本和抗原参考品作适当稀释。
2.将待测标本和标准抗原溶液（5个浓度抗原标准品） 与适当过量的抗血清混合，在一定条件下，抗原抗体 反应完成后，在340nm处测定各管吸光度。
3.按log-logit转换或y=ax3+bx2+cx+d方程进行曲线 拟合，制备剂量-反应曲线，由计算机处理，计算 出抗原浓度。
由集光器和光电倍增管接收、记录单位时间内所产生的 光子能，这部分光的积分与待测抗原的量成正比，可从标准 曲线上计算出待测抗原的含量。
磁微粒技术
顺磁性微粒示意图
Y
磁微粒标记抗体
磁微粒在
电磁场中分离
直接化学发光的机理
--- 夹心法
+ + 磁微粒 抗体
被测抗原
带吖啶酯 标记物抗
体
（1） 加入H2O2 （pH<10）
三、免疫散射比浊法
原理
粒子对光线的散射作用是溶液中的微粒子受到光 线照射后，微粒子对光线产生反射和折射而形成散 射光。悬浮微粒对光散射形成的散射光强度与微粒 的大小、数量、入射光的波长和强度、测量角度等 因素密切相关，其公式如下：
Iθ＝ I0［4π2（dn/dc) 2 Mc(1+cosθ)］ Nγ2λ4
1. 仪器测定技术要点
• 检测分两时间进行： – ①预反应阶段----加少量样本与抗体反应，测定第 一次散射光信号（7.5-120s）； – ②反应阶段----加入全量待测样本，4分钟内测定 第二次散射光信号。
• 第二次散射光信号作为待测抗原与抗体形成复合物 颗粒产生的信号峰值，经计算机软件处理转换为待 测抗原浓度。
免疫自动化仪器分析技术
第一节 免疫浊度测定的自动化分析 第二节 发光免疫测定的自动化分析 第三节 荧光免疫测定的自动化分析 第四节 酶联免疫测定的自动化分析
第一节免疫浊度测定的自动化分析
免疫浊度分析的基本原理是：抗原、抗体在特定的电解质溶液 中反应，形成小分子免疫复合物（<19S），在增浊剂（如PEG、 NaF等）的作用下，迅速形成免疫复合物微粒（>19S），使反 应液出现浊度。在抗体稍微过量且固定的情况下，形成的免疫 复合物量随抗原量的增加而增加，反应液的浊度亦随之增大， 即待测抗原量与反应溶液的浊度呈正相关。
速率散射比浊原理图
仪器测定技术要点
• 开启机器，进行定标 • 反应阶段 • 抗原过量检测
图20-6 抗原抗体反应散射光峰值的动态变化
抗原过量检测
(三)散射比浊方法评价
散射比浊法是目前临床应用较多的一种方法，本 法自动化程度高，具有快速、灵敏、准确、精密 等优点。采用抗原过量检测方法，保证了结果的 准确性。但仪器和试剂价格比较贵, 对抗体的质量 要求很高。
• 速率-----指抗原抗体结合反应过程中，每一单位 时间内两者结合的速度。
抗原抗体复合物形成表
累积时间（秒）
复合物形成的量
形成速率值
5
8
-
10
13
5
15
25
12
20
60
35
25
150
90
30
230
80
35
300
70
40
360
60
45
415
55
50
450
45
55
Baidu Nhomakorabea
480
30
60
500
20
• 基本原理：抗原与相应抗体以一定比例混合后， 随着反应时间的延长，免疫复合物的总量逐渐增 加，而速率的变化由慢－快－慢，反应时间最快 的某一时刻称为速率峰。当反应液中的抗体量保 持过剩时，速率峰的高低与抗原含量成正比，仪 器自动通过标准曲线将速率峰值转化为所测抗原 的终浓度。
（三）方法评价
优点: 灵敏度高，稳定性好，操作简便，结果准确
不足: ①抗体用量较大； ②溶液中存在的抗原－抗体复合物分子应足够大 ③透射比浊测定在抗原－抗体反应的第二阶段，检 测需在抗原抗体反应达到平衡后进行，耗时较长。
二、免疫胶乳比浊法
（一）原理：
用抗体致敏的大小适中、均匀一致的胶乳颗粒（一般为0.2 μm），在 遇到相应抗原时，胶乳颗粒上的抗体与抗原特异结合，引起胶乳颗粒 凝聚 ，使透射光和散射光即出现显著变化。如图所示：a为单个胶乳 颗粒不阻碍光线透过，b为抗原抗体结合形成的凝聚胶乳大颗粒使透 射光减弱或散射光增强。
（二）方法评价
本法敏感度大大高于普通比浊法，可达ng/L水平， 操作简便，易自动化；血清中的类风湿因子(RF)可 与IgG Fc段结合，使IgG致敏胶乳颗粒出现非特异 性凝集，用F(ab’)2片段代替IgG既可消除此干扰， 又可克服IgG致敏胶乳的自凝现象；免疫胶乳轻度 自凝或抗体活性降低会严重影响结果。
记技术以及计算机技术的出现，自动化免疫分析 技术引入临床
- 提高检测灵敏度，增加检测项目 - 缩短检测时间 - 提高实验结果的精确度和准确度
自动化免疫分析仪的共同特点
主机系统
样本处理 系统
试剂 系统
温育反应 系统
信号检测 系统
计算机系统
自动稀释 自动进样 自动清洗
信号处理及 数字转换
信号储存 分析报告
第十四章 临床免疫检验自动化分析
免疫检验自动化 （automation of immunoassays) 是将免疫学反应检测过程中的取样、加试剂、混合、 温育、固相载体分离、信号检测、数据处理、打印报 告和检测后的仪器清洗等步骤由计算机控制，自动化 进行。
• 20世纪50-80年代:免疫学检测主要是手工操作 • 20世纪80年代末:随着单克隆抗体技术、免疫标
第二节发光免疫测定的自动化分析
三大经典标记技术
术放
酶
发
射
免
光
免
疫
免
疫
技
疫
技
术
技
术
自动化发光免疫分析系统的组成
1.样本盘 2.试剂盘 3.温育反应系统 4.固相载体清洗和分离系统 5.信号产生和检测系统 6.计算机数据处理和控制系统
基本概念
发光:是指分子或原子中的电子吸收能量后，由基 态（较低能级）跃迁到激发态（较高能级），然后 再返回到基态，并释放光子的过程。 根据形成激发态分子的能量来源不同可分为: 光照发光、生物发光、化学发光等。