复旦大学免疫实验小鼠脾脏单个核细胞分离及细胞计数
脾脏单个核细胞的制备
脾脏单个核细胞的制备脾脏单个核细胞的制备: 将5 只小鼠断颈椎处死, 无菌取出脾脏, 分别剪碎, 置200 目无菌尼龙网上, 分次滴入4~ 5 ml RPMI1640 培养液, 轻轻研磨脾脏, 直到脾脏变白;收集细胞悬液( 由于红细胞所占比例很低且对实验影响不大, 故无需作红细胞裂解处理) , 1 000 r/ min( 离心半径17. 5 cm) 离心5 min, 弃上清; 加入2 ml pH7. 4 的PBS, 混匀后1 000 r/ min( 离心半径17. 5 cm) 离心5min, 弃上清; 加入4 ml RPMI1640 培养液, 混匀, 用RPMI1640 培养液稀释200 倍后滴加在细胞计数板上进行细胞计数, 根据计数结果用RPMI1640 将细胞悬液调成2 × 10 / 300 µl 的浓度。
《流式细胞术检测小鼠脾细胞内细胞因子刺激方案的筛选》单细胞悬液的制备：将大鼠颈椎脱位处死后, 置70%乙醇中浸泡5 m in, 无菌取出脾脏和胸腺置于平皿中, 除掉结缔组织, 用生理盐水清洗3次。
加入2 mL RPM I- 1640完全培养液, 用剪刀分别将脾和胸腺剪成1 mm 1 mm 1 mm 碎块后, 用毛玻片轻柔研磨组织碎片, 经8层纱布过滤制成单细胞悬液, 经H anks液离心洗涤后, 将细胞悬浮于含10%小牛血清的RPM I- 1640 培养液。
台盼蓝染色, 计数活细胞在95%以上, 调整细胞数至5×10 cells /L。
《粗江蓠多糖对大鼠淋巴细胞周期的影响》610制备脾细胞悬液脾淋巴细胞的获取:手术刀、解剖剪、解剖镊、止血钳等手术器械,300 目尼龙网等须经消毒处理; 以颈椎脱臼法处死小鼠, 用7 5 % 乙醇浸泡小鼠10-15min 。
沿腹腔中线剪开小鼠胸腔, 取出脾脏置于培养皿中, 剪去脂肪和筋膜组织, 用R PMI-1640培养液漂洗。
粗剪成小块, 用注射器芯轻轻挤压, 加人基础培养液, 混悬, 用300目尼龙网过滤到玻璃离心管中, 再加人基础培养液冲洗网上剩余组织细胞。
小鼠脾脏细胞原代培养及观察计数
小鼠脾脏细胞原代培养及观察计数【实验目的】1.学习掌握细胞培养的基本原理以及具体方法，并对小鼠脾细胞进行原代培养；2.掌握无菌操作的具体过程及无菌操作台的使用；3.学习掌握染色法鉴别细胞的生死状态的原理及方法；4.学习使用血球计数板对细胞总数及活细胞数进行计数；【实验原理】A.细胞培养细胞培养指的是在无菌条件下，把动、植物细胞从组织中取出，在体外模拟体内的生理环境，使离体的细胞在体外生长和繁殖，并且维持其结构和功能的一种培养技术。
动物细胞培养可分为原代培养和传代培养。
从供体获得组织细胞，在无菌条件下，用胰蛋白酶消化或机械分散等方法，将动物组织分散成单个细胞开始首次培养长出单层细胞的方法称为细胞的原代培养。
当培养的动物细胞生长增殖达到一定密度，形成致密的单层细胞时，用胰蛋白酶将细胞消化分散成单细胞，从一个容器中以1：2或其他比例转移到另一个容器中扩大培养的方法，称为细胞的传代培养。
传代培养的累计次数就是细胞的培养代数。
高等生物是由多细胞构成的整体，在整体条件下要研究单个细胞或某一群细胞在体内的功能活动是十分困难的。
但如果把活细胞拿到体外培养、增殖并进行观察和研究，则要方便和简单得多。
被培养的动物细胞是非常好的实验对象和实验研究材料，对体外培养的活细胞进行研究可以帮助人类揭开生、老、病、死的规律，探索优生、抗衰老和防治各种疾病的途径和机制，也可以人为地诱导和改变细胞的遗传性状和特性，使其向有利于人类健康长寿的方向发展。
因此动物细胞体外培养技术是研究细胞分子机制非常重要的实验手段，被广泛应用于医学、生物技术、基因工程等研究领域。
细胞培养的意义:具有其他生物技术无可比拟的优点；培养条件易改变和控制，便于单因子分析；便于人们直接对细胞内结构、细胞生长及发育等过程的观察；在生物学的各个领域（如分子生物学、细胞生物学、遗传学、免疫学、肿瘤学及病毒学等）已被广泛应用。
细胞培养的局限性：在脱离机体复杂环境下，细胞培养条件与躯体环境有一定距离；观察到的结果有时难以正确反映机体内的状况；细胞培养得到的产物少。
复旦大学免疫实验小鼠脾脏单个核细胞分离及细胞计数
小鼠脾脏单个核细胞分离及细胞计数实验时间：实验地点：实验人：1实验原理小鼠脾脏位于上腹部左后侧，体积较大，长条形，属于外周免疫器官。
外周血中淋巴细胞可经再循环驻如脾脏等外周免疫器官的特定区域，所以富含各类免疫细胞。
免疫细胞的分离：采用红细胞裂解法，是根据细胞对渗透压变化的敏感度。
红细胞由于细胞结构较为简单，仅有细胞膜结构，对于膨胀的耐受能力较差，因此绝大部分就会涨破，受到破坏。
是一种比较温和的去除红细胞最简便易行的方法。
2实验材料：1)健康小鼠2)手术器械（剪刀、镊子）、解剖板3)70%乙醇4)PBS缓冲液、红细胞裂解液（ACK）5)0.2%台盼蓝6)细胞计数板、计数器7)离心机8)显微镜3实验方法：3.1取小鼠脾脏●将小鼠颈椎脱位处死，用酒精消毒。
●用剪刀剪开背部皮肤，再找到脾脏，用镊子夹出脾脏并剪除周围组织。
3.2制备单个核细胞悬液●将取出的脾脏置于盛有3mlPBS缓冲液的平皿中，然后再置于尼龙指套中，用针芯轻轻碾压使得单个核细胞悬浮于平皿中。
●吸取平皿中细胞悬液置于刻度离心管（15ml）中，以1500rpm离心10min，弃去上清液，加入ASK至2-3ml，轻轻吹打混匀并放置2min，以破坏红细胞。
然后加入PBS缓冲液至10ml，以1500rpm离心10min。
●弃去上清液，用PBS缓冲液定容至2ml，吹打混匀即为小鼠脾脏单个核细胞悬液。
3.3计算细胞浓度稀释十倍，随机选取一个大方格计数细胞计数为324个，计算细胞浓度为324×104×10=3.24×107/ml3.4计算细胞活力在总计为324个细胞中计数，死亡细胞有16个，计算细胞活力为：324-16/324×100%=95.1%在理论范围之内4实验结果4.1研磨脾脏得到细胞悬液本实验中将小鼠的脾脏放入尼龙指套内，置于少量PBS液中缓慢研磨，获得细胞悬液。
实验中，我们发现尼龙指套不能滤去所有结缔组织，操作中会有结为絮状团块的结缔组织。
复旦大学免疫实验小鼠脾脏单个核细胞分离及细胞计数
小鼠脾脏单个核细胞分离及细胞计数实验时间：____________ 实验地点：_____________ 实验人：__________________ 1实验原理小鼠脾脏位于上腹部左后侧，体积较大，长条形，属于外周免疫器官。
外周血中淋巴细胞可经再循环驻如脾脏等外周免疫器官的特定区域，所以富含各类免疫细胞。
免疫细胞的分离：采用红细胞裂解法，是根据细胞对渗透压变化的敏感度。
红细胞由于细胞结构较为简单，仅有细胞膜结构，对于膨胀的耐受能力较差，因此绝大部分就会涨破，受到破坏。
是一种比较温和的去除红细胞最简便易行的方法。
2实验材料：1）健康小鼠2）手术器械（剪刀、镊子）、解剖板3）70汇醇4）PBS缓冲液、红细胞裂解液（ACK5）0.2%台盼蓝6）细胞计数板、计数器7）离心机8）显微镜3实验方法：3.1取小鼠脾脏将小鼠颈椎脱位处死，用酒精消毒。
用剪刀剪开背部皮肤，再找到脾脏，用镊子夹出脾脏并剪除周围组织。
3.2制备单个核细胞悬液将取出的脾脏置于盛有3mlPBS缓冲液的平皿中，然后再置于尼龙指套中，用针芯轻轻碾压使得单个核细胞悬浮于平皿中。
吸取平皿中细胞悬液置于刻度离心管（15ml）中，以1500rpm离心10min, 弃去上清液，加入ASK至2-3ml，轻轻吹打混匀并放置2min,以破坏红细胞。
然后加入PBS缓冲液至10ml，以1500rpm离心10min。
弃去上清液，用PBS缓冲液定容至2ml，吹打混匀即为小鼠脾脏单个核细胞悬液。
3.3 计算细胞浓度稀释十倍，随机选取一个大方格计数细胞计数为324个，计算细胞浓度为324X 104X 10=3.24 X 107/ml3.4 计算细胞活力在总计为324个细胞中计数，死亡细胞有16 个，计算细胞活力为：324- 16/324 X 100%=95.1%在理论范围之内4 实验结果4.1 研磨脾脏得到细胞悬液本实验中将小鼠的脾脏放入尼龙指套内，置于少量PBS液中缓慢研磨，获得细胞悬液。
小鼠脾脏、胸腺单个核细胞分离及流式染色实验-复旦精品课程
计算细胞活力：计数200个细胞中活细胞的百 分率，一般活力应在95%以上。
（四）流式细胞术检测
PE-CD3 T cells
注意事项：
镜下有两个以上细胞组成的细胞团，按单个细胞计算，若细胞团10% 以上，说明分散不好，需重新制备细胞侧面观
支持堤
计数池
1mm 支持堤
（0.1mm）
细胞计数注意事项
细胞数量明显增大时可适当加大稀释倍数。 充池要一次完成，不能产生气泡或充池不足的现象。 若每个中方格之间相差超过20个以上，要重新充池计
数。正常范围内，两次红细胞计数相差不得超过5%。 白细胞计数时，各大方格间的细胞数相差不超过10%
。
如微量吸管内壁沾有白细胞稀释液，会使红细胞破坏， 故应先做红细胞计数
稀释液要过滤，试管、计数板均清洁干燥，以免杂质、 微粒等被误认为细胞。
（四）计算细胞活力
50μl细胞悬液+ 50μl的0.2%苔盼兰溶液并混 匀；
上，待它与混合体系中的细胞反应后，利用磁力的作用，使与致 敏结合的细胞与其它物质分离，达到纯化、分离的目的。
密度梯度离心法
Ficoll-Hypaque密度梯度离心法：人外周血单个核细 胞(peripheral blood mononuclear cell PBMC)包 括淋巴细胞和单核细胞，其体积、形状和比重与其他细 胞不同，利用密度在1.077±0.001g/L之间近于等渗的 Ficoll-Hypaque混合溶液(称为淋巴细胞分层液)作密 度梯度离心时,•各种血液成分将按密度梯度重新分布聚 集。
五年制免疫实验课 小鼠脾脏单个核细胞分离-新
E花环分离法
（纯化T细胞）
T细胞表面的CD2分子－绵羊红细胞受体（E受体）
尼龙纤维分离法
B细胞和单核细 胞具有易粘附特性， 将淋巴细胞悬液加 到尼龙纤维上， 37℃作用1－2小时 后，洗脱的为非粘 附性T细胞。
PBMC
B细胞 单核细胞
尼龙纤维 毛柱
T细胞
流式细胞术
（Flow Cytometry，FCM）
一 、 T细 胞 增 殖 试 验
1. 形态学检查
T细胞增殖试验 原毒的行正理刺分常素激裂：）人后的T、转细能淋非化胞转巴率特体化为母异（外为细7性形0受体％胞有态特积左，丝学异较右以分示性大。此裂意抗、测原原图代定（物）谢T如质细旺P（胞盛HA的如、、功细且C能菌能on类进。A） 4P8H~A72刺小激时
NOTE：尽量少吸分层液；
6、每管加 PBS 到1ml，重悬细胞，3000转离心5分钟。
7、计数：吸弃上清，用100ml PBS重悬细胞，取出20ml加入新 的EP管中，再加入20ml细胞计数液，混匀后取出10ml，加到 计数板内，显微镜下计数。
细胞计数方法
4
查出四个大方格的总细胞数(X) 算出每个大方格的平均细胞数：Y=X/4 每个大方格的体积为V=1mm×1mm×0.1mm=0.1mm3=10-4ml 制备的细胞悬液的细胞浓度（/ml)=Y×104×稀释倍数
2.
3 H-TdR掺 入 法 T细胞增殖试验 原激胞养腺DD淋素NN活巴经进理液嘧AAβ后入细：中中啶的，胞-S淋加，液核原期进对巴入根体苷，料入刺细据闪3H细(被（细激T胞同烁标胞d摄胞物3位仪被RH记合入)周的素检-有，的T成期应细掺测d丝则DDR进答入胞。N分N掺3H行水A细A，裂入合-明有平胞T原掺法成d显丝。的RC入）原分掺增量o新n作料加裂入则A合为或脱，的，可成合P当同在氧推H细位的培成测胸A
最新94 小鼠脾脏胸腺单个核细胞分离ppt课件
• 烂鳃病病原菌平板划线分离： 取病鱼鳃丝一小块，置于滴有无菌水的载玻片
的边缘，10分钟，用接种环蘸水，在胰胨琼脂培养 基上划线。 • 肠炎病病原菌划线分离：
用70%酒精棉球擦拭鱼体，无菌条件下，取病 鱼的肝或脾或肾或心于普通营养琼脂基划线分离。 • 赤皮病病原菌划线分离：
用刀片刮除病灶腐烂部分后用接种环挂取病料， 在普通营养琼脂培养基上平板划线。28℃培养24h。
度法 4. 2）根据细胞黏附特性：B细胞黏附于尼龙棉 5. 3）根据细胞对渗透压变化的敏感度：红细胞对低渗敏感
4
T细胞表面标志及其亚群
➢ CD3+CD4+CD8-辅助性T细胞 （help T cell,Th）
➢ CD3+CD4-CD8+细胞毒性T细胞 （cytotoxic T cell,Tc or CTL）
2. 在用ACK破坏红细胞时，不要时间过长，以免破坏其他细胞。
32
细菌分离与鉴定方法 —嗜水气单胞菌分离鉴定
分离方法 细菌的生长状况观察 氧化酶试验 AHM鉴别培养 吲哚试验 革兰氏染色法 糖发酵试验 脱脂奶平板试验（酪蛋白胨化试验）
分离方法
用途:
• 在检查含两种或两种以上的待检材料（如肝、脾、肾、 心、肌肉等）中的某种细菌时，须先将待检材料进行 分离培养。常用的分离培养方法是琼脂平皿分区划线 法，是借划线将混杂的细菌在琼脂平皿表面分散开来， 使个别的细菌能固定在某一点，经培养生长繁殖后形 成单个菌落，以达到分离获得纯种细菌的目的。
普通琼脂平板
牛肉膏
3.0g
蛋白胨
10.0g
氯化氯化钠（NaCL）
5.0g
磷酸二氢钾（KH2PO4） 1.0g
琼脂
15.0g
小鼠脾脏单个核细胞分离
-
特异性 敏感性
优点
缺点
细胞生物 低 学方法 免疫学方 高 法
分子生物 高 学方法
高
可确定活 性
易操作， 可大量检 测 既可定量 又可定位
繁琐费时 不能确定是 否有活性
不能反映浓 度和活性
较高
高
小鼠脾单个核细胞的分离—密度梯度离心法
原理 根据物理学中颗粒沉降原理，不同密度的物质颗 粒在其沉降运动中可因其比重的差别而处于不同 的分布位置。利用此原理可设计一定密度的液体 界面，将各种不同密度的细胞通过离心沉降而达 到使其彼此分离的目的。已知小鼠淋巴细胞和单 核细胞的密度大约在1.088之间，而红细胞与粒细 胞 的 密 度 均 大 于 1.088 。 因 此 ， 若 用 密 度 为 1.088±0.001 的分离液则可通过密度梯度离心方 法，在分离液界面上收集单个核细胞。
T:表达CD2(SRBC受体） B:不表达CD2
免疫细胞功能检测
淋巴细胞转化试验
细胞毒试验
细胞因子检测 溶血空斑实验
T
PHA, ConA,PWM
或Ag
形态学观察Lc 与淋巴母细胞 的比值
3H-TdR掺入法测cpm值
细胞因子检测
细胞生物学方法: CK细胞敏感株
密度梯度离心法
聚蔗糖—泛影葡胺 Ficoll-Hypaque: 1.088±0.001
LC, M :1.088 RBC, 粒细胞：>1.092
在1ml小鼠脾脏细胞悬液混匀，然后用滴管沿盛有 2ml淋巴 细胞分离液的试管壁轻轻铺于分离液面上。 将该试管置水平式离心机中离心（1800rpm）15分钟。 用滴管小心地直接插入白色絮状的细胞层（含单个核细 胞），吸出界面层细胞，移入另一试管内。 在该细胞收集管内加入生理盐水，用滴管轻轻上下冲洗混 匀，然后在离心（1000rpm）10分钟，弃去上清液，将沉 淀细胞充分摇匀，再用生理盐水离心洗涤1次。 用0.3ml生理盐水（约6滴）将沉淀细胞稀释，摇匀。 取细胞悬液一滴加入等量白细胞稀释液于另一试管中充分 混匀，用计数板在显微镜下计数，计算单个核细胞浓度 （个/ml）。 检查细胞活力：取细胞悬液一滴加入等量锥兰溶液于另一 试管中充分混匀，用载玻片在显微镜下计数100~200个单 个核细胞中着色的死细胞数
4 脾脏单个核细胞分离及流式细胞术染色(1)
lived dead
实验材料：
小鼠 手术器械（剪刀、镊子）、酒精喷壶 平皿，尼龙膜指套、研磨棒
PBS缓冲液、红细胞裂解液（ACK）
细胞计数板 0.2%台盼蓝染液 显微镜（关掉之前，请把光度调到最小！！）
实验步骤
（一）取小鼠脾脏：
小鼠颈椎脱位处死（注意安全）； 用75%酒精喷小鼠腹部，使其皮毛沾湿。用剪刀，剪开皮肤 暴露腹腔，再找到脾脏，劲量剪除脾脏周围组织；
• • • •
实验小鼠处死方法
• 1．颈椎脱臼法：是大、小鼠最常用的处死方法。用拇指和食指用力往下按住 鼠头，另一只手抓住鼠尾，用力稍向后上方一拉，使之颈椎脱日，造成脊髓 与脑髓断离，动物立即死亡。
注意： 细胞总数和细胞活力可以一起做 细胞总数=视野内活细胞数+死细胞数 细胞活力=活细胞数/总数x100%
1.颈椎脱臼处死小鼠：用拇指和食指用力往下按住鼠头，另一只手抓住 鼠尾，用力稍向后上方一拉，使之颈椎脱臼，造成脊髓与脑髓断离 2.摘取脾脏：用75%酒精喷小鼠腹部，使其皮毛沾湿。用剪刀，剪开皮 肤暴露腹腔，再找到脾脏，尽量剪除脾脏周围组织 3.研磨脾脏：在培养皿中加入3mlPBS，将脾脏放入过滤网制成的指套中， 再放入培养皿中，用注射器的活塞棒或研棒将脾脏研碎。将含有脾脏细 胞的PBS移入15ml离心管。再取3mlPBS冲洗培养皿后移入15ml离心管。
（三）计算细胞浓度
将上述细胞悬液做一定倍数（10倍左右）的稀释（小鼠脾 脏细胞一般为1x107-2x108）； 混匀稀释后，取10uL加至细胞计数板中(不要有气泡），计 数细胞计数板中4大方格细胞总数； 计算细胞总数：
细胞浓度=4个大方格细胞总数/4*104*稀释倍数。
细胞总数=细胞浓度x细胞悬液的体积
地塞米松调节T细胞免疫应答保护小鼠急性炎性肝损伤的作用
地塞米松调节T细胞免疫应答保护小鼠急性炎性肝损伤的作用刘焕荣;陆芸;张正国;王健;王昱;刘光伟;薛峰【摘要】背景：在小鼠急性炎性肝损伤中，地塞米松（Dex）可通过抑制天然免疫细胞功能抑制肝损伤进展，然而T 细胞是否参与此保护作用尚少见报道。
目的：探讨 Dex 在急性炎性肝损伤中对 T 细胞免疫应答的调节效应。
方法：6只雄性C57BL/6J 小鼠随机分为实验组和模型组，在以脂多糖诱导急性炎性肝损伤模型前1 h，两组分别腹腔注射 Dex 5 mg/ kg 和等体积 PBS。
建模12 h 后处死小鼠，行临床评分并检测肝功能；分离脾脏单个核细胞，分析 T 细胞活化情况以及各 T细胞亚群的细胞因子表达、分泌和转录因子表达。
结果：实验组小鼠临床评分和血清转氨酶水平均明显低于模型组，脾脏 CD44+ CD62L - T 细胞（活化或记忆性 T 细胞）比率显著降低，Th1型细胞因子 IFN-γ表达、分泌减少，Th2型细胞因子IL-4表达、分泌增加，调节性 T 细胞（Treg 细胞）比率、Th2/ Th1、Treg/ Th1比值增加；同时，Th1细胞特异性转录因子表达下调，Th2、Treg 细胞特异性转录因子表达上调。
结论：Dex 通过抑制 T 细胞活化并调节 T 细胞亚群分化（抑制Th1细胞分化，促进 Th2、Treg 细胞分化），在急性炎性肝损伤中起一定保护作用。
%Background:Dexamethasone can protect mice against the acute inflammatory liver injury by inhibiting innate immune cell function. However,the roles of T cell in this protective effect remain unknown. Aims:To investigate the regulatory effect of dexamethasone on T cell immune response in acute inflammatory liver injury. Methods:Six maleC57BL/ 6J mice were randomly divided into 2 groups. One hour before induction of acute inflammatory liver injury by lipopolysaccharide,dexamethasone 5 mg/ kg and PBS were given intraperitoneally in experimental group and model group,respectively. All the mice were sacrificed 12 hours after model construction. The clinical score and liver function parameters were assessed;splenic mononuclear cells were isolated for measurements of T cell activation,as well as cytokineexpression,secretion, and transcriptional factor expression for different T-cell subsets. Results:Clinical score and serum levels of transaminase were significantly lower in experimental group when compared with the model group. Meanwhile,percentage of CD44 +CD62L - T cells(i. e. activated or memory T cells)from spleen was significantly decreased in experimental group. Among splenic T cell population,expression and secretion of IFN-γ,a Th1-type cytokine,was decreased;expression and secretion of IL-4,aTh2-type cytokine,percentage of regulatory T cells(Treg cells),and ratios of Th2 / Th1 and Treg/ Th1 were increased;transcriptional factor specific for Th1 cells was down-regulated,and those for Th2 and Treg cells were up-regulated. Conclusions:Dexamethasone inhibits T cell activation and directs the reciprocal T cell lineage differentiation (repressing Th1 cell differentiation,promoting Th2 and Treg cell differentiation),which may contribute to the protection against acute inflammatory liver injury.【期刊名称】《胃肠病学》【年(卷),期】2015(000)006【总页数】5页(P324-328)【关键词】肝损伤;地塞米松;淋巴细胞活化;细胞分化;Th1-Th2 平衡【作者】刘焕荣;陆芸;张正国;王健;王昱;刘光伟;薛峰【作者单位】上海交通大学医学院附属仁济医院肝脏外科 200127; 复旦大学基础医学院免疫学系;复旦大学基础医学院免疫学系;复旦大学基础医学院免疫学系;复旦大学基础医学院免疫学系;复旦大学基础医学院免疫学系;复旦大学基础医学院免疫学系;上海交通大学医学院附属仁济医院肝脏外科 200127【正文语种】中文* Email:*****************背景：在小鼠急性炎性肝损伤中，地塞米松(Dex)可通过抑制天然免疫细胞功能抑制肝损伤进展，然而T细胞是否参与此保护作用尚少见报道。
脾淋巴细胞分离
小鼠脾脏单个核细胞的分离一、实验目的1. 熟悉细胞分离的基本原理2. 掌握小鼠脾脏单个核细胞的分离的方法3. 掌握流式细胞术检测细胞表面标志的方法二、实验原理1.台盼蓝染色：正常的活细胞，胞膜结构完整，能够排斥台盼蓝，使之不能够进入胞内。
丧失活性或细胞膜不完整的细胞，胞膜的通透性增加，可被台盼蓝染成蓝色。
通常认为细胞膜完整性丧失，即可认为细胞已经死亡。
2.脾是人和脊椎动物最大的淋巴器官。
人的脾脏位于左季肋区的后外侧部，呈卵圆形，脾是血循环中重要的滤过器，能清除血液中的异物、病菌以及衰老死亡的细胞，特别是红细胞和血小板。
三、实验材料小鼠手术器械（剪刀、镊子）、酒精喷壶、杀鼠板平皿，尼龙膜指套、研磨棒、吸管、试管、EP管、移液器和tipsPBS缓冲液、红细胞裂解液（ACK）细胞计数板0.2%台盼蓝染液8.显微镜四、实验步骤（一）取小鼠脾脏1.小鼠颈椎脱位处死——用拇指和食指往下按住鼠头，另一只手抓住鼠尾，用力稍向后上方一拉，使之颈椎脱臼，造成脊髓与脑髓断离。
2.取其后右侧卧位，消毒左侧背腹交界处皮肤，剪取脾脏并尽量将去除脂肪及筋膜组织。
（二）制备单个核细胞悬液：1.将脾脏置于盛有5mLPBS缓冲液的平皿中，然后再置于尼龙指套中。
用针芯轻轻碾磨使单个核细胞通过尼龙指套悬浮于平皿中；2.吸取平皿中细胞悬液（再次用尼龙指套过滤）置于刻度离心管中，加PBS缓冲液（可冲洗培养皿）至10mL，以1500rpm离心5min。
弃去上清，弹散细胞沉淀，加ACK2ml，轻轻吹打混匀并放置3-4min，以破坏红细胞。
然后加PBS缓冲液至10ml，以1500rpm离心5min；3.弃去上清，弹散细胞沉淀，加PBS缓冲液至2ml，吹打混匀即为小鼠脾脏单个核细胞悬液。
(放置冰上)4.取100uL至EP管中，进行计数和活力测定（建议5倍稀释）5.以1500rpm离心5min，根据计数结果稀释到合适的浓度a)注：减少操作的时间，并放置冰上或低温离心机里以保证细胞活力（三）计算细胞浓度1.将上述细胞悬液做一定倍数的稀释；（建议5倍稀释）。
实验二__小鼠脾细胞提取及计数
实验二小鼠脾细胞提取及计数一、介绍本次实验整体情况（8：00－8：05，5分钟）：本次实验的操作包括三部分：包被和封闭ELISA板、眼球取血、脾细胞的提取及计数。
其中包被和封闭ELISA板以及眼球取血是为实验三ELISA实验做准备。
ELISA（enzyme linked immunosorbent assay）酶联免疫吸附试验具体原理下次课讲解。
二、包被和封闭ELISA板：备注：提前10分钟到实验室发放包被和封闭ELISA板所用试剂1. 讲解内容(8：05－8：15，10分钟)包被和封闭ELISA板是为下一次实验酶联免疫吸附试验（ELISA）做准备。
包被就是将已知抗原或抗体吸附于固相载体表面并保持其免疫原性。
在ELISA 板上加上抗原以后，因为电荷数与板不同，所以抗原吸附板上，但是吸附后固相载体表面尚有未被占据的空隙；封闭就是让大量不相关的蛋白质充填这些空隙，从而防止在ELISA其后的步骤中干扰物质的再吸附。
下面介绍如何包被ELISA反应板及微量加样器使用注意事项。
（1）包被ELISA板：1) 试剂和器材（老师已经在ELISA板上统一标记好）a. pH9.6的碳酸盐缓冲液 ;b. 绵羊红细胞抗原－SRBC;（a和b为包被液，实验室老师已经配好）c.聚乙烯塑料板，微量加样器2) 操作方法a. 包被液：碳酸盐缓冲液1：200 稀释抗原SRBC；b. 聚乙烯塑料板：8孔/2人，每孔加100ul包被液，37度恒温2小时。
（2）微量加样器使用方法及注意事项(让学生自己操作一下，老师教学生看量程):1) 量取样品时选择适当量程的加样器，（P20： 0.5～20.0µl；P200： 20～200 µl； P1000：200～1000 µl）。
老师结合不同型号的微量加样器，指导如何读数，白色由左至右读数，黑/蓝色由上至下读数。
2)转动旋钮，调整量取体积。
顺时针旋转增加体积，逆时针减少体积。
小鼠脾脏内皮祖细胞的分离和培养
小鼠脾脏内皮祖细胞的分离和培养赵晓辉;黄岚;尹扬光;周健;方玉强;朱光旭;陈剑飞;刘兰;崔斌【期刊名称】《心脏杂志》【年(卷),期】2006(18)5【摘要】目的探讨小鼠脾脏内皮祖细胞(endothelial progen itor cell,EPC)的体外分离,定向分化和培养方法。
方法梯度密度离心法从小鼠脾脏中分离单个核细胞,用含血管内皮生长因子的M199培养液培养,每4 d更换培养基去除非贴壁细胞,观察经过不同时间培养后的细胞形态、结构和功能变化。
结果培养4 d可发现梭形贴壁细胞,7d后细胞成集落状,14 d左右可观察到条索状、网状血管样结构,原代细胞培养21 d左右接近融合并呈典型的鹅卵石样排列。
培养7 d透射电镜可见特征性的W e ib le-Palade小体存在,细胞CD31表达阳性,细胞D iI-LDL摄取试验阳性,FITC-UEA-I染色阳性;流式细胞仪检测细胞Sca-1及VEGFR-2的总阳性率分别为(34.6±3.8)%和(50.5±4.9)%,且该细胞具有体外成血管能力。
结论通过密度梯度离心联合贴壁筛选可以获得脾脏EPC。
【总页数】4页(P532-535)【关键词】内皮祖细胞;细胞培养;脾脏;小鼠【作者】赵晓辉;黄岚;尹扬光;周健;方玉强;朱光旭;陈剑飞;刘兰;崔斌【作者单位】第三军医大学新桥医院全军心血管内科中心【正文语种】中文【中图分类】R363【相关文献】1.大鼠脾脏内皮祖细胞的分离培养及鉴定 [J], 邓梦杨;陶剑群;朱晋坤;王航;赵晓辉;崔斌;尹扬光;黄岚2.小鼠骨髓源性内皮祖细胞的分离培养与鉴定 [J], 罗伟;李翔翮;杨先腾;李森磊;王远政;张一;田晓滨;孙立3.小鼠骨髓来源内皮祖细胞的分离、培养及鉴定 [J], 胡若愚;承燕;李好;张雷;景华;吴海卫4.小鼠髓源性内皮祖细胞体外培养的两种不同分离方法的比较 [J], 吴瑞影;许建华5.小鼠骨髓源性内皮祖细胞的分离培养与鉴定 [J], 李美玲;刘凤姣;刘玲因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
不同分离方法对小鼠脾脏调节性T细胞表达特征的影响
中国耳鼻咽喉头颈外科/2011年9月，第18卷，第9期CHIN ARCH OTOLARYNGOL HEAD NECK SURG/September 2011, Vol.18, No.9 509近年来，随着以变应性鼻炎（AR ）和变应性哮喘为代表的呼吸道变应性疾病在全球范围内发病率的升高，与之发病机制密切相关的CD4+CD25+T 细胞及其特异性标志物Foxp3成为近年来的研究热点。
在此前的实验中，我们对AR 小鼠外周调节性T 细胞（regulatory T cell ，Treg ）的表达特征进行了研究，发现实验组与正常对照组外周血表达有显著性差异，而脾脏表达两组间无显著性差异[1]。
经查阅相关资料及总结经验，我们改进了脾脏单个核细胞的分离方法，并通过流式分选仪对用两种不同方法分离获得的小鼠脾脏单个核细胞的检测，对其分选活性进行比较，从而证明分离获得单个核细胞的方法不同对细胞活性及功能有显著性影响。
1.1 实验材料。
8周以上体重在18～22 g 成熟雌性BALB/C 小鼠30只，购于首都医科大学实验动物科学部，SPF 级别饲养环境，随机分成两组，实验组10只为卵清蛋白（ovalbumin ，OVA ）致敏组，对照组20只以生理盐水代替OVA 。
1.2 AR 动物模型制备。
致敏阶段：实验组将OVA （V 级，美国Sigma 公司）以50 μg/只加入免疫佐剂Al （OH ）3（5 mg/只）制成生理盐水混悬液1 ml ，予小鼠腹腔注射，隔天1次，共7次，对照组以0.9%生理盐水替代。
激发阶段：第14天开始，实验组以5% OVA 20 μl/只点鼻，1次/d ，共7次。
对照组以生理盐水替代点鼻。
末次激发24 h 后，断颈处死动物取脾脏置于冰上备用。
1.3 行为学观察及病理形态学检测。
在每次激发后观察小鼠是否出现烦躁、搔鼻、挠痒、进食减少等行为学改变。
末次激发24 h 后，断颈处死动物取整个鼻腔中性甲醛固定，行常规石蜡包埋、切片，HE 染色后光镜下观察。
小鼠脾脏细胞原代培养及死、活细胞计数
细胞生物学实验报告题目：小鼠脾脏细胞原代培养及死、活细胞计数姓名：余振洋学号：200900140156 系年级：09级生科三班时间：2011/5/26一、【实验目的】1、了解原代细胞培养的基本方法及操作过程，初步掌握无菌操作的方法。
2、学习细胞计数的方法。
3、学习并掌握死活细胞鉴别的原理及方法。
二、【实验材料】1．实验仪器：解剖刀、解剖镊、解剖盘、无菌培养皿、滴管、“L”形针头、Eppendorf 管、塑料培养皿、移液枪、离心机、试管及试管架、血球计数板、显微镜、标记笔、超净工作台、CO2培养箱等2．实验试剂：PBS液、台盼蓝染液，75%酒精、生理盐水3．材料：小白鼠三、【实验原理】1．细胞原代培养原代细胞培养是指直接从动物体内获首取的细胞、组织或器官，经体外培养后，直到第一次传代为止。
这种培养，首先用无菌操作的方法，从动物体内取出所需的组织（或器官），经消化，分散成为单个游离的细胞，在人工培养下，使其不断的生长和繁殖。
细胞能在体外长期生长，必须满足两个基本要求：一是供给细胞存活所必须的条件，如适量的水、无机盐、氨基酸、维生素、葡萄糖及其有关的生长因子、氧气、适宜的温度，注意外环境酸碱度与渗透压的调节。
二是严格控制无菌条件。
细胞培养技术目前已经被广泛地应用于生物学各个领域。
如分子生物学、细胞生物学、遗传学、免疫学、肿瘤学以及病毒学等。
2．细胞死活鉴定。
常用细胞死活鉴定方法有台盼蓝法：细胞损伤或死亡时，台盼蓝可穿透变性的细胞膜，与解体的DNA 结合，使其着色呈蓝色。
而活细胞能阻止染料进入细胞内，呈无色。
故可以鉴别死细胞与活细胞。
本次实验即采用此方法。
伊红Y 法：细胞悬液与3倍量的0.15%伊红染液混合，2min后制片镜检，死细胞被染成红色而活细胞呈无色。
3．细胞计数：血球计数板（如图1所示）是一块特制的厚载玻片，载玻片上由4条槽而构成3个平台。
中间的平台较宽，其中间又被一短横槽分隔成两半，每个半边上面各有一个方格网，每个方格网共分9大格，其中的一大格即为计数室。
小鼠脾单个核细胞的分离-20141113硕士班
器 材
（1）水平式离心机
（2）显微镜
（3）血球计数板、血盖片
（4）一次性试管、滴管 （5）擦镜纸、卷筒纸、镊子
试 剂：
（1）小鼠脾脏细胞悬液
（2）淋巴细胞分离液（市售，比重：1.088±0.001）
（3）生理盐水
（4）白细胞稀释液 （5）0.4%锥兰生理盐水溶液
操作步骤
将1ml小鼠脾细胞悬液混匀，用滴管沿盛有2ml淋巴细胞分离液的 试管壁轻轻铺于分离液面上 ↓ 将该试管置水平式离心机中离心（2000rpm）15 min ↓ 用滴管小心地直接插入白色絮状的细胞层（含单个核细胞）， 吸出界面层细胞，移入另一离心管内 ↓ 加入足量生理盐水，用滴管轻轻上下冲洗混匀 ↓ 离心（1000rpm）10 min ↓ 弃去上清液，将沉淀细胞充分摇匀，加生理盐水，洗涤 1 次 ↓ 离心（1000rpm）10 min ↓ 弃去上清液，将沉淀细胞充分摇匀 ↓ 用生理盐水将沉淀细胞稀释至0.3ml(约6滴），摇匀 ↓ 取细胞悬液一滴加入等量白细胞稀释液于另一试管中充分混匀，用计数板在显微镜下计数， 计算出白细胞总数（/ml）
×10×2×103 个/ml
15
1. 细胞数量明显增大时可适当加大稀释倍数。 2. 充池时要一次完成，不能产生满溢、气泡或充池不足的现象。
3. 大小方格内压线细胞的计数遵循数上不数下、数左不数右的原则，
避免多数或漏数。
1.
红细胞计数时，如果每个中方格之间相差超过20个以上，要重新充池
计数。正常数值范围内，两次红细胞计数相差不得超过5%
3. 加入脾细胞悬液时应十分小心，注意保护分离液的界面，勿使混淆
影响分离效果；
4. 每个吸取细胞悬液的步骤，均要混匀细胞； 5. 做细胞活力检查时，锥兰染色后应尽快计数完毕，时间过长则细胞
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小鼠脾脏单个核细胞分离及细胞计数
实验时间：实验地点：实验人：
1实验原理
小鼠脾脏位于上腹部左后侧，体积较大，长条形，属于外周免疫器官。
外周血中淋巴细胞可经再循环驻如脾脏等外周免疫器官的特定区域，所以富含各类免疫细胞。
免疫细胞的分离：采用红细胞裂解法，是根据细胞对渗透压变化的敏感度。
红细胞由于细胞结构较为简单，仅有细胞膜结构，对于膨胀的耐受能力较差，因此绝大部分就会涨破，受到破坏。
是一种比较温和的去除红细胞最简便易行的方法。
2实验材料：
1)健康小鼠
2)手术器械（剪刀、镊子）、解剖板
3)70%乙醇
4)PBS缓冲液、红细胞裂解液（ACK）
5)0.2%台盼蓝
6)细胞计数板、计数器
7)离心机
8)显微镜
3实验方法：
3.1取小鼠脾脏
●将小鼠颈椎脱位处死，用酒精消毒。
●用剪刀剪开背部皮肤，再找到脾脏，用镊子夹出脾脏并剪除周围组织。
3.2制备单个核细胞悬液
●将取出的脾脏置于盛有3mlPBS缓冲液的平皿中，然后再置于尼龙指套中，
用针芯轻轻碾压使得单个核细胞悬浮于平皿中。
●吸取平皿中细胞悬液置于刻度离心管（15ml）中，以1500rpm离心10min，
弃去上清液，加入ASK至2-3ml，轻轻吹打混匀并放置2min，以破坏红细胞。
然后加入PBS缓冲液至10ml，以1500rpm离心10min。
●弃去上清液，用PBS缓冲液定容至2ml，吹打混匀即为小鼠脾脏单个核细胞
悬液。
3.3计算细胞浓度
稀释十倍，随机选取一个大方格计数
细胞计数为324个，计算细胞浓度为324×104×10=3.24×107/ml
3.4计算细胞活力
在总计为324个细胞中计数，死亡细胞有16个，计算细胞活力为：
324-16/324×100%=95.1%
在理论范围之内
4实验结果
4.1研磨脾脏得到细胞悬液
本实验中将小鼠的脾脏放入尼龙指套内，置于少量PBS液中缓慢研磨，获得细胞悬液。
实验中，我们发现尼龙指套不能滤去所有结缔组织，操作中会有结为絮状团块的结缔组织。
这些结缔组织在离心后会和细胞绞缠在一起，去除十分麻烦，而且会损失细胞。
应该在离心之前尽早用吸管吹打后小心弃去（这样损失的细胞比较少，造成较小的误差）。
研磨脾脏时的力度、时间、温度都会影响细胞的活性。
所以应置于冰上快速、轻柔地研磨，置于液体中避免干磨。
我们在实验室室温下碾磨，造成细胞破碎较多，影响最终实验结果。
4.2白细胞计数
在使用血球计数板时，遇到了镜下看不到计数板格子线的问题:起初，我们小组能够在镜下观察到细胞，但是细胞清晰时无法找到计数板格子线。
后来我们
意识到，这可能是因为充池后立即观察，细胞还悬浮在液体中，和方格线不在同一个平面上。
静置2分钟后再调焦观察，只能隐约看到方格线。
在反复调试中发现，减小光圈并降低光源亮度可以增加方格线的清晰度。
另外，一定要注意在充池前对计数板的清洁。
我们小组起初用卫生纸对计数板清洁，在镜下发现残留很多纸纤维，严重影响观察。
改用擦镜纸清理后，就大大减少了杂物对视野的影响。