生化实验：血清清蛋白的分离与电泳鉴定(修改)

三、实验步骤（电泳）
<4> 搭桥 点样端于负极，平衡5min 后通电。 <5>电泳100V，30min <6> 氨基黑10B染色，5min。 <7> 漂洗2次，每次3min。 除漂洗液外，其余溶液均回收。
三、实验结果
（1）样品本身：带电量、分子大小、形状。 （2）电场强度：X越大，V越大 （3）缓冲液：
-
+
层析液
血清
γ
β α2 α1 albumin
➢实验名称 ➢ 摘要（目的、方法、结果、结论） ➢实验原理 ➢ 操作要点（主要步骤） ➢ 实验结果 ➢ 结论和讨论 （结果分析、思考题等）
预习
实验三 过氧化氢酶Km的测定
pH 决定Q，(pH-PI)越大，Q越多，V越大
结果分析
蛋白质名称
清蛋白 α1球蛋白 α2球蛋白 β球蛋白 γ球蛋白
纤维蛋白
等电点
4.88 5.06 5.06 5.12 6.85~7.50
5.40
分子量
电泳迁 移速度
69000
200000
300000
9000-150000
156000300000
结果
在溶液中加入中性盐使生物大分子沉淀析出的过程 称为“盐析”。 蛋白质水溶胶的稳定因素：水化膜和电荷。 中性盐的亲水性大于蛋白质分子的亲水性。 1. 破坏水化膜，暴露出疏水区域， 2. 中和电荷，破坏亲水溶胶
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二、实验原理（盐析）
Salting-in
Salting-out
溶 解 度
盐浓度
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水化膜
血清清蛋白的分离与电泳鉴定
1
临床意义
1.血清清蛋白增高 2.血清清蛋白降低
严重失水，血浆浓缩所致。 急性清蛋白浓度降低主要
尚未发现单纯清蛋白浓
见于大量出血和严重灼
度升高的疾病。
伤。
慢性清蛋白浓度降低主要 见于肝、肾疾病
2
一、实验目的
1.掌握盐析法、分子筛层析、离子交换层析等实 验原理及操作技术。
2.熟悉醋酸纤维素薄膜电泳分离蛋白质的方法和应 用。
3
二、实验原理
实验流程
盐析
脱盐
Hale Waihona Puke Baidu
电泳
4
常用的蛋白质分离纯化技术
依据性质
溶解度 分子大小
带电特性 吸附特性 对配体分子 的亲和性
方法
用于粗分
用于细分
盐析、等电点沉淀、 有机溶剂沉淀
透析、超过滤
密度梯度离心、凝 胶过滤
电泳、离子交换层析
吸附层析
亲和层析、金属 螯合层析
5
透析
6
超滤
7
电 泳法
8
层析
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1.强酸型阳离子交换树脂：主要含有强酸性的反应基如磺酸 基（－SO3H），此离子交换树脂可以交换所有的阳离子。
2. 弱酸型阳离子交换树脂：具有较弱的反应基如羧基（－ COOH基），此离子交换树脂仅可交换弱碱中的阳离子如
Ca2+ 、Mg2 +
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二、实验原理（盐析）
以醋酸纤维薄膜为支持物，在pH=8.6的巴比妥缓 冲液中，血清蛋白的PI均小于8.6，带负电荷，电泳 时向正极移动，由于迁移率不同而被分离。
净电荷量 分子量 分子形状
相对迁移率
三、实验步骤（盐析）
<1> 取2ml血清稀释液于10ml刻度试管。 <2> 逐滴加入2ml饱和(NH４)２SO４溶液，
滴入后，立即摇匀，边加边摇。 <3> 混匀后于室温中放置10min。 <4> 蒸馏水润湿后的双层滤纸过滤，弃沉淀，留滤液。
++ +
碱
+
+
++ +
酸
带正电荷蛋白质
（亲水胶体）
碱
酸
等电点时的蛋白质 （亲水胶体）
带负电荷蛋白质 （亲水胶体）
脱水
不稳定蛋白颗粒
不同的蛋白质分子，由于其分子表面的极性基团的种类、数目 以及排布的不同，其水化层厚度不同，故盐析所需要的盐浓度 也不一样，因此调节蛋白质的中盐浓度，可以使不同的蛋白质 分别沉淀。
继续蒸馏水，用1%BaCl2检测无白色后封柱。
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三、实验步骤（电泳）
<1> 画点样线 无光泽面，距一端2cm铅笔画点样线。
2.5cm
姓名
层析液
粗糙面
血清
<2> 浸泡薄膜后，滤纸拭干（不能有多余水渍，也不能晾 干薄膜）。
<3> 点样
蘸层析液于点样线上方（量多），血清下方（1-2mm高度 ）垂直点样，立刻提起。
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三、实验步骤（脱盐—凝胶柱层析）
<1> G-25混匀后上柱 一气呵成，无气泡，无断层。
<2> 调流速 20滴/min。
<3> 上液面与凝胶面齐平时，加样1ml滤液；再次齐平时，加蒸馏
水。收集洗脱液，每管15滴。全程凝胶柱不能干！
<4> 检测。
一同学收集，另一检测。
收集液一半用10%三氯醋酸（2滴）检测，沉淀最多的电泳。
(NH4)2SO4
血清
球蛋白
半饱和
析出
饱和
清蛋白
析出
二、实验原理（脱盐—凝胶层析）
原理： 1、分子量大的物质不能进入 凝胶粒子内部，随洗脱液从凝 胶粒子之间的空隙挤落下来， 所以大分子物质迁移速度快；
2、小分子物质要通过凝胶网 孔进入凝胶粒子内部，所以小 分子物质迁移速度慢。
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二、实验原理（电泳）