血清蛋白的分离、提纯与鉴定
血清球蛋白提纯实验报告
血清球蛋白提纯实验报告血清球蛋白提纯实验报告引言：血清球蛋白是一种重要的生物分子，具有多种生物学功能。
为了深入研究其结构和功能，本实验旨在通过一系列的步骤，从血清中提纯球蛋白，以获得高纯度的样品。
材料与方法：1. 血清样品：从健康人体中采集的血清样品。
2. 氨硫脲：用于沉淀球蛋白。
3. 离心管：用于离心沉淀。
4. 0.1 M磷酸盐缓冲液：用于洗涤球蛋白。
5. 0.01 M磷酸盐缓冲液：用于稀释。
6. 蛋白质含量测定试剂盒：用于测定球蛋白的浓度。
7. SDS-PAGE凝胶：用于分离蛋白质。
8. Coomassie蓝染色剂：用于染色。
实验步骤：1. 将血清样品加入离心管中，加入适量的氨硫脲，使其浓度达到10%。
2. 将离心管置于离心机中，以10000 rpm的速度离心10分钟，以沉淀球蛋白。
3. 弃去上清液，加入适量的0.1 M磷酸盐缓冲液洗涤沉淀，重复此步骤3次。
4. 加入适量的0.01 M磷酸盐缓冲液稀释球蛋白，使其浓度适宜。
5. 使用蛋白质含量测定试剂盒，测定球蛋白的浓度。
6. 将提纯后的球蛋白样品进行SDS-PAGE凝胶电泳分离。
7. 将凝胶染色剂浸泡在凝胶中，染色15分钟，然后用脱色剂洗净凝胶。
结果与讨论：通过上述步骤，我们成功地从血清中提纯出了球蛋白。
首先，我们通过离心的方式，将球蛋白从血清中沉淀下来。
然后，通过洗涤步骤，去除了与球蛋白不相关的杂质。
最后，我们对提纯后的球蛋白样品进行了浓度测定，并进行了SDS-PAGE凝胶电泳分离。
通过SDS-PAGE凝胶电泳的结果，我们可以看到凝胶上出现了明显的蛋白质条带。
根据分子量标记，我们可以初步判断出这些条带对应的是球蛋白。
进一步的实验可以通过Western blot等方法来确认这些条带的确为球蛋白。
在实验过程中，我们需要注意一些问题。
首先，血清样品的采集和保存要注意避免污染和降解。
其次，实验操作要严格控制温度和时间，以确保实验的准确性和重复性。
血浆清蛋白的分离纯化与鉴定实验原理不同的蛋白质的分子量
血浆清蛋白的分离纯化与鉴定实验原理不同的蛋白质的分子量、溶解度、以及在一定条件下带电的情况有所不同，可以更据这些性质的差别，分离及提纯各种蛋白质。
利用硫酸铵分段盐析法将血清中的清蛋白及球蛋白分离，清蛋白液再利用葡聚糖凝胶过滤法除盐，即可得到较纯的清蛋白。
纯化后的清蛋白可利用醋酸纤维薄膜电泳法鉴定其纯度。
盐析：是指将中性盐（如硫酸铵）加入蛋白质溶液中，中和Pr蛋白质表面电荷及破坏水化膜，使蛋白质相互聚集在析出。
分段盐析：各种蛋白质盐析时所需的盐浓度和PH不同，利用不同盐浓度下Pr溶解度不同，将蛋白质分段沉淀下来。
半饱和硫酸铵沉淀血清中球蛋白（清蛋白溶解）将血清清蛋白和球蛋白初步分离。
常用的除盐方法：半透膜透析；凝胶过滤（层析）。
在葡聚糖凝胶层析柱中，由于蛋白质和盐的分子量不同，洗脱速度也不同，大分子蛋白质不能进入凝胶的网孔内而先流出，小分子盐则可进入网孔滞留在凝胶内，收集蛋白洗脱液，即可得到脱盐的蛋白质。
用三氯醋酸液鉴定洗脱的蛋白液，以BaCL2检测硫酸铵。
纯化后的清蛋白用醋酸纤维薄膜电泳鉴定蛋白质分离效果。
实验试剂1．饱和硫酸溶液：称固体硫酸铵85g于100ml蒸馏水中，在70～80℃水浴中搅拌溶解，用浓氨水调PH为7.2，室温放置过夜，瓶底析出白色结晶，上层液即为饱和硫酸铵液。
2．生理盐水：称取分析纯NaCl 0.89克，蒸馏水稀释至1000ml.3．葡聚糖凝胶Sephadex G-25: 称取10克Sephadex G-25，加入200ml 0.02mol/lPH6.5磷酸盐缓冲液溶胀24小时。
4．10％三氯醋酸。
5．1％氯化钡溶液6．pH8.6，离子强度0.06巴比妥电极缓冲液：称取巴比妥钠12.76g，巴比妥1.66g，蒸馏水加热溶解后再加水至1000ml。
7．氨基黑10B染色液：称取氨基黑10B 0.5g，用甲醇50ml，冰醋酸10ml，蒸馏水40ml 溶解。
8．漂洗液：95％乙醇45ml，加冰醋酸5ml及蒸馏水50ml。
血清球蛋白的提纯实验报告
1. 了解血清球蛋白的组成及特性。
2. 掌握血清球蛋白的提纯方法，包括盐析法、凝胶层析法和醋酸纤维素薄膜电泳法。
3. 熟悉实验操作步骤，提高实验技能。
二、实验原理血清中的蛋白质按电泳法可分为五类：清蛋白、1-球蛋白、2-球蛋白、-球蛋白和-球蛋白。
其中，-球蛋白含量约占16%，100 mL血清中约含1.2 g左右。
不同种类的蛋白质具有不同的分子量、溶解度和带电荷情况，因此可以根据这些性质的差异进行分离和提纯。
盐析法：利用清蛋白和球蛋白在高浓度中性盐溶液中溶解度的差异进行沉淀分离。
半饱和硫酸铵溶液可使球蛋白沉淀析出，清蛋白则仍溶解在溶液中，经离心分离，沉淀部分即为含有-球蛋白的粗制品。
凝胶层析法：利用蛋白质与无机盐类之间分子量的差异进行分离。
当溶液通过Sephadex G-25凝胶柱时，分子直径大的蛋白质不能进入凝胶颗粒的网孔，而分子直径小的无机盐能进入凝胶颗粒的网孔之中。
在洗脱过程中，小分子的盐会被阻滞而后洗脱出来，从而达到去盐的目的。
醋酸纤维素薄膜电泳法：利用蛋白质在电场中的迁移速度差异进行分离。
纯化后的-球蛋白可利用醋酸纤维素薄膜电泳法鉴定其纯度。
三、实验材料1. 血清样品2. 硫酸铵3. Sephadex G-25凝胶4. 醋酸纤维素薄膜5. 电泳仪6. 显色剂7. 实验器材：离心机、移液器、烧杯、玻璃棒等1. 盐析法提纯（1）将血清样品与硫酸铵溶液混合，使硫酸铵浓度达到半饱和状态。
（2）室温下静置一段时间，待球蛋白沉淀析出。
（3）用离心机分离沉淀和上清液，收集沉淀。
（4）将沉淀用蒸馏水洗涤，去除中性盐。
2. 凝胶层析法提纯（1）将Sephadex G-25凝胶柱连接到层析柱上，用蒸馏水平衡凝胶柱。
（2）将提纯后的沉淀溶解于适量蒸馏水中，制成蛋白质溶液。
（3）将蛋白质溶液加入凝胶柱，用蒸馏水进行洗脱。
（4）收集洗脱液，检测蛋白质含量。
3. 醋酸纤维素薄膜电泳法鉴定纯度（1）将收集到的蛋白质溶液制成醋酸纤维素薄膜电泳样品。
血清免疫球蛋白的提取分离、纯化及鉴定-1
血清免疫球蛋白的提取分离、纯化及鉴定-1血液及组织样品的制备分析组织中某种物质的含量、探索物质代谢的过程和规律，经常使用动物的肝、肾、脑、粘膜和肌肉等组织，也选用全血、血浆、血清或者无蛋白血滤液等血液样品，有时也采用尿液、胃液等完成各种生化实验。
掌握以上各种实验样品的正确处理和制备方法是保证生化实验顺利进行的关键。
一、血液样品(一）采血测定用的血液，多由静脉采集。
一般在饲喂前空腹采取，因此时血液中化学成分含量比较稳定，采血时所用的针头、注射器，盛血容器要清洁干净；接血时应让血液沿着容器壁慢慢注入，以防溶血和产生泡沫。
(二）血清、全血及血浆的制备1.血清的制备血清是全血不加抗凝剂自然凝固后析出的淡黄清亮液体。
制备方法是：将刚采集的血液直接注入试管或离心管中。
将试管放成斜面，让其自然凝固，一般经3h 血块自然收缩而析出血清；也可将血样放入37 ℃恒温箱内，促使血块收缩，能较快约析出血清。
为了缩短时间，也可用离心机分离（未凝或凝固的均可离心），分离出的血青，用吸管吸出置于另一试管中，若不清亮或带有血细胞，应重离心，加盖冷藏备用。
2.全血及血浆的制备取清洁干燥的试管或其它容器，收集动物的新鲜血液，立即与适量的抗凝剂充分混合，所得到的抗凝血为全血。
每毫升血液中加入抗凝剂的种类可以根据实验的需要进行选择，但是用量不宜过大，否则将影响实验的结果。
将已抗凝的全二于 2，000r / min 离心10min ，沉降血细胞，取上层清液即为血浆。
血浆比血清分离得快而且量多：两者的差别，主要是血浆比血清多含一种纤维蛋白原，其它成分基本相同。
3.抗凝剂凡能够抑制血液凝固反应进行的化合物称为抗凝剂。
抗凝剂种类甚多，实验室常用的有如下几种，可根据情况选择使用。
（1）草酸钾（钠）优点是溶解度大，可迅速与血中钙离子结合，形成不溶性草酸钙，使血液不凝固。
每毫升血液用1-2mg 即可。
配制方法：配制10％草酸钾水溶液二吸取此液0.1ml 放入一试管中，慢慢转动试管，泛草酸钾尽量铺散在试管壁上，置80 ℃ 烘箱烤干（若超过150 ℃ 则分解），管壁即呈一薄层三色粉末，加塞备用。
血清白球蛋白的分离、纯化及鉴定-10-10
（三）分离纯化的一般程序
选择材料 生物大分子的分离纯化一般 可分为以下几个阶段： 可分为以下几个阶段： ①材料的选择和预处理 破碎细胞及提取（ ②破碎细胞及提取（有时还 需要进行细胞器的分离） 需要进行细胞器的分离） 分离纯化： ③分离纯化：包括粗分级分 离和细分级分离 其中前两个阶段为生物大分 子分离纯化的前处理。 子分离纯化的前处理。 破碎细胞 提取 分离纯化 分析及鉴定
脱水 阳离子
带负电荷蛋白质 （疏水胶体）
蛋白质聚集沉淀 蛋白质聚集沉淀
中性盐的选择
常用的中性盐： 常用的中性盐：(NH4)2SO4 1) 溶解度大： 溶解度大： 0℃ 70.6 70. 4.9 1.6 20℃ 20℃ 75.4 75. 18.9 18. 7.8 80℃ 80℃ 95.3 95.01
Salting-out
溶 解 度
盐浓度
水化膜
带正电荷蛋白质 亲水胶体） （亲水胶体）
+ + + + + + ++ +
碱 酸
等点电时的蛋白质 亲水胶体） （亲水胶体）
碱 酸
带负电荷蛋白质 亲水胶体） （亲水胶体）
脱水 + + + + + + ++ +
带正电荷蛋白质 （疏水胶体）
脱水 阴离子
不稳定蛋白颗粒
二．特点
1、高效能 、 2、高度选择性 、 3、高灵敏度 、 4、操作简单 、 不足之处：定量精确， 不足之处：定量精确，但定性较差
三、色谱的种类
气－液色谱 气相色谱 气－固色谱 色谱 液－液色谱 液相色谱 液－固色谱
按原理分类
1、吸附色谱法 、 2、分配色谱法 、 3、离子交换色谱法 、 4、凝胶色谱法 、 5、亲和色谱法 、
电泳分离血清蛋白实验报告
竭诚为您提供优质文档/双击可除电泳分离血清蛋白实验报告篇一：醋酸纤维薄膜电泳法分离血清蛋白实验报告前言血清蛋白：血清蛋白是血液中脂肪酸的携带者。
当身体需要能量或者需要建造材料时，脂肪细胞就把脂肪酸释放到血液中，脂肪酸被血清蛋白获取，并被运送到需要的部位。
牛血清白蛋白的相对分子质量为10的4次方这个级别，它不是一定的，是多聚物，有的地方测的70000，这就是一个数据了。
在做pcR的时候会用到它。
牛血清蛋白是血液的主要成分，分子量68kD。
等电点4.8。
含氮量16%，含糖量0.08%。
仅含已糖和已糖胺，含脂量只有0.2%。
白蛋白由581个氨基酸残基组成，其中35个半胱氨酸组成17个二硫键，在肽链的第34位有一自由巯基。
白蛋白可与多种阳离子、阴离子和其他小分子物质结合。
血液中的白蛋白主要起维持渗透压作用、ph缓冲作用、载体作用和营养作用。
在动物细胞无血清培养中，添加白蛋白可起到生理和机械保护作用和载体作用。
醋酸纤维薄膜电泳：醋酸纤维薄膜电泳以醋酸纤维薄膜为支持物。
它是纤维素的醋酸酯，由纤维素的羟基经乙酰化而制成。
它溶于丙酮等有机溶液中，即可涂布成均一细密的微孔薄膜，厚度以0.1mm—0.15mm为宜。
太厚吸水性差，分离效果不好；太薄则膜片缺少应有的机械强度则易碎。
应用醋酸纤维薄膜电泳操作简单、快速、廉价。
已经广泛用于血清蛋白，血红蛋白，球蛋白，脂蛋白，糖蛋白，甲胎蛋白，类固醇激素及同工酶等的分离分析中，尽管它的分辨力比聚丙酰胺凝胶电泳低，但它具有简单，快速等优点。
特点：1.（1）醋酸纤维薄膜对蛋白质样品吸附极少，无“拖尾”现象，染色后背景能完全脱色，各种蛋白质染色带分离清晰，因而提高了测定的精确性。
（2）快速省时。
由于醋酸纤维薄膜亲水性较滤纸小，薄膜中所容纳的缓冲液也较少，电渗作用小，电泳时大部分电流是由样品传导的，所以分离速度快，电泳时间短，一般电泳45—60min即可，加上染色，脱色，整个电泳完成仅需90min左右。
血清球蛋白提纯实验报告
一、实验目的1. 掌握血清球蛋白的提取和纯化方法；2. 熟悉盐析法、凝胶层析法等分离纯化技术；3. 了解血清球蛋白的生物学功能和应用。
二、实验原理血清球蛋白是人体免疫系统中的一种重要蛋白质，具有多种生物学功能。
本实验采用盐析法和凝胶层析法对血清球蛋白进行提取和纯化，通过比较纯化前后球蛋白的生物学活性，验证实验结果的可靠性。
三、实验材料1. 血清样本：取健康人血清，低温保存；2. 试剂：硫酸铵、醋酸纤维素薄膜、凝胶层析柱、染色剂等；3. 仪器：离心机、电泳仪、凝胶成像仪等。
四、实验步骤1. 盐析法提取血清球蛋白（1）取一定量血清样本，加入适量的硫酸铵，搅拌均匀；（2）静置沉淀，离心分离，收集沉淀物；（3）将沉淀物溶解于适量的去离子水中，得到初步纯化的血清球蛋白溶液。
2. 凝胶层析法纯化血清球蛋白（1）将凝胶层析柱装满Sephadex G-25凝胶；（2）将初步纯化的血清球蛋白溶液加入凝胶层析柱，收集流出的溶液；（3）收集含有血清球蛋白的洗脱液，进行蛋白浓度测定。
3. 醋酸纤维素薄膜电泳鉴定血清球蛋白纯度（1）制备醋酸纤维素薄膜，将其固定在电泳槽中；（2）取一定量的血清球蛋白溶液，加入适量电泳缓冲液，制成样品；（3）进行电泳，观察血清球蛋白的迁移情况，分析纯度。
五、实验结果与分析1. 盐析法提取血清球蛋白：实验结果表明，通过盐析法可以有效地提取血清球蛋白，提取率约为80%。
2. 凝胶层析法纯化血清球蛋白：实验结果显示，经过凝胶层析法纯化后，血清球蛋白的纯度得到了显著提高，纯度达到90%以上。
3. 醋酸纤维素薄膜电泳鉴定血清球蛋白纯度：电泳结果显示，纯化后的血清球蛋白在醋酸纤维素薄膜上呈现出明显的单一条带，证明纯化效果良好。
六、实验结论本实验采用盐析法和凝胶层析法对血清球蛋白进行了提取和纯化，实验结果表明，该方法能够有效地提高血清球蛋白的纯度，为后续的生物学研究和应用奠定了基础。
七、实验讨论1. 实验过程中，盐析法提取血清球蛋白的效率较高，但纯度相对较低。
牛血清实验报告
1.配胶（分离胶，浓缩胶），如下表：
分离胶
浓缩胶
30%胶贮存液（ml)
2.7
0.67
分离胶缓冲液（ml)
2.5
0
浓缩胶缓冲液（ml)
0
0.5
10%SDS（ml)
0.1
0.04
10%过硫酸铵（ml)
0.1
0.04
TEMED（ml)
0.006
0.004
H2O（ml)
4.6
2.7
总体积（ml)
三、牛血清白蛋白的SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳
【实验目的】
熟悉用SDS—聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳对蛋白质纯度的鉴定。
【实验原理】
蛋白质在高于或低于其pI的溶液中为带电的颗粒，在电场中能向阳级或阴极移动。这种通过蛋白质在电场中泳动而达到分离各种蛋白质的技术，称为电泳。在蛋白质样品和聚丙烯酰胺凝胶系统中加入带负电荷的十二烷基硫酸钠（SDS)，可使所有蛋白质颗粒表面覆盖一层SDS分子，导致蛋白质分子间原有的电荷差异消失，加之聚丙烯酰胺凝胶具有分子筛效应，据此，蛋白质在电场中的泳动速率仅与蛋白质颗粒的大小有关。
0.016
0.021
0.020
【实验结果】
取9、10、22、23号试管进行计算，得结果如下：
管号
U
9
10
22
23
蛋白质含量g
97
2.6
2.4
4.2
4
【实验思考与讨论】
本次试验犯的错误真是让人无语，吸光度测出来竟然有负值。原因是什么呢？竟然是做对照实验的比色杯没有擦干净，甚至能看到指纹，导致后来测出的一系列数据的不准。通过此次实验，我明白，做实验一定不能慌，不能急，哪怕别人都走了，我也要坚持做好自己要做的。做实验年一定要细心，注意细节。
血清白蛋白的分离
生化大实验学院: 化学与生命科学专业: 生物技术*名：**学号: ********血清白蛋白的分离、纯化与鉴定一.实验目的掌握血清白蛋白分离纯化的方法；学会用盐析和离子交换柱层析法分离纯化蛋白质的原理与操作；学会用考马斯亮蓝法测定蛋白质含量；学习检测蛋白质纯度的方法；掌握SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质分子量的原理和方法。
二.实验原理1.血清白蛋白的初步分离血清白蛋白约占血浆蛋白总量的60%，水溶性很强，结构稳定，能结合多种小分子，如脂肪酸，胆红素，血红素等，起维持血液的正常渗透压作用。
此外白蛋白还有解毒、参与脂类代谢及血浆中微溶物质的运输、维持血液酸碱平衡等作用，在医学临床及生物领域应用广泛。
可以根据不同蛋白质的相对分子质量、溶解度以及在一定条件下带电的情况的不同来分离及提纯各种蛋白质。
盐析是广泛使用的分离蛋白质的方法，所谓的盐析就是用大量中性盐使蛋白质从溶液中析出的过程。
在高浓度的中性盐影响下，蛋白质分子的水化膜被剥夺及所带的电荷被中和，因而破坏了蛋白质溶胶的稳定因素，使蛋白质沉淀析出。
但中性盐并不会使蛋白质变性，因此，若除去中性盐或减低盐的浓度，蛋白质就可以重新溶解。
在半饱和硫酸铵溶液中，血清白蛋白不沉淀，球蛋白沉淀，离心后白蛋白主要在上清液中。
由于血清白蛋白的相对分子质量较硫酸铵大得多，故盐析初步分离的白蛋白可用透析法或凝胶层析法除去硫酸铵。
奈氏试剂是络盐K2[HgI4]加KOH的溶液，在无机化学定性分析中，用其检验氨或铵盐2.血清白蛋白的纯化离子交换层析是一种用离子交换树脂作支持剂的层析方法。
本实验采用的是DEAE－纤维素阴离子交换剂（中强碱型），可电离基团是二乙基氨基乙基，适用于大分子的分离。
在离子交换层析中，蛋白质对离子交换剂的结合力取决于彼此之间相反电荷基团的静电吸引，而这又和溶液的pH与盐离子浓度有关。
因此，蛋白质混合物的分离可以由改变溶液中盐离子浓度和pH来完成，对离子交换剂结合力最小的蛋白质首先从层析柱中洗脱出来。
血清球蛋白的提纯
血清球蛋白的提纯【原理】应用不同浓度硫酸铵分段盐析法将血清中γ—球蛋白与白蛋白及α、β球蛋白分离，最后用透析法或凝胶过滤法除去，即可得到比较纯的γ—球蛋白。
【操作】一、盐析：1．取离心管一支加入血清1mL，加入等量PBS稀释血清，摇匀后逐滴加入pH7.2饱和硫酸铵溶液2mL，边加边摇，然后静置10分钟，再离心（4000转/分）15分钟，将上清液（主要含清蛋白）倾入试管中（留供后面实验用）。
2．离心管底部的沉淀用PBS缓冲液0.5mL搅拌溶解，再逐滴加入饱和硫酸铵0.25mL（相当于33%饱和硫酸铵），摇匀后再放置10分钟，离心（4000转/分）15分钟，倾弃上清液（主要含α、β球蛋白），其沉淀即为初步纯化的γ—球蛋白。
（如要得更纯的γ—球蛋白，可重复这步盐析过程2次）。
二、脱盐：1．装柱：称取葡聚糖凝胶G-250 1g，放入100mL烧杯内加入蒸馏水约500mL，用小火煮沸1小时（注意：随时补充蒸馏水，以免干）静置冷却后倾弃上层蒸馏水，再加入PBS缓冲液10mL，将杯内的凝胶用玻璃棒轻轻搅拌使之悬起，倾入有少量玻璃棉（或尼龙布）堵住下口的20×1cm层析柱内，层析柱下口套一小段橡皮管。
待全部凝胶倾入柱内（注意：凝胶要装填均匀，若分多次加入凝胶应在放胶前将柱内凝胶顶部搅动悬起，再将凝胶液倾入），且液面始终高于凝胶面，用螺旋夹调节PBS缓冲液的流速，控制在每分钟6滴，注意陆续不断的加入PBS缓冲液，不要使液面低于凝胶面。
2．脱盐：在盛有γ—球蛋白沉淀物的离心管内，加入PBS缓冲液5滴，并用玻璃棒轻轻搅拌，至全部沉淀物溶解后用滴管吸出γ—球蛋液，将滴管插入凝胶层析柱内，管口靠近凝胶面缓慢滴入3滴蛋白质液，待全部蛋白质液进入凝胶层后，用滴管轻轻靠近凝胶面加入PBS 缓冲液30滴（注意：不要搅动凝胶面），待大部分液体流入凝胶柱后，再陆续小心加入PBS 缓冲液5~10mL，不要使液面低于凝胶面。
洗脱流速始终控制在6滴/分。
血清白球蛋白的分离、纯化及鉴定
阳离子交换剂具有带负电荷的酸性基团作 为离子交换基团，能吸附流动相中的阳离 子。
阴离子交换剂具有带正电荷的碱性基团作 为离子交换基团，能吸附流动相中的阴离 子。
0.02M NH4AC
AC-
++
AC-
+
AC- + AC++
AC- AC-
蛋白样品
NH4AC
-
++ -
- +-
- +-
++
- --
AC-
原理: 当高浓度盐存在时，蛋白质往往凝 聚并析出沉淀。该技术为“盐析”。
• 不同的蛋白质在不同浓度的盐中形成沉淀。在 半饱和硫酸铵溶液中，血清球蛋白会沉淀，经 离心后，可与白蛋白分离开。
• 影响因素：PH、温度、蛋白质纯度等。 • 逐渐改变硫酸铵浓度可分段盐析出不同的蛋白。
操作
一、盐析
－－ 白蛋白、γ球蛋白的粗分离
血清白蛋白、γ-球蛋白 的分离、纯化及鉴定
分离纯化的一般程序
选择材料 破碎细胞
提取 （预处理） 分离纯化 （粗分级，细分级） 分析及鉴定
实验目的
通过从血清中分离、纯化、鉴定血 清白蛋白和γ-球蛋白的实验，培养学 生综合应用盐析、离心、色谱、电泳 分光等技术来分离纯化特定蛋白质的 技能。
实验原理
++
AC-
+
AC- + AC- 阴离子交换剂 ++
AC- AC- γ-球蛋白带正电
NH4+
+ +
得到纯化的γ-球蛋白
白蛋白,α、β
球蛋白带负电
-
-
血清清蛋白、γ-球蛋白的分离、提纯与鉴定-2012医学-第六实验室
生物化学实验报告姓名：学号：专业年级：组别：第六实验室生物化学与分子生物学实验教学中心一、实验室规则1．实验前应认真预习实验指导，明确实验目的和要求，写出预实验报告。
2．进入实验室必须穿白大衣。
严格遵守实验课纪律，不得无故迟到或早退。
不得高声说话。
严禁拿实验器具开玩笑。
实验室内禁止吸烟、用餐。
3．严格按操作规程进行实验。
实验过程中自己不能解决或决定的问题，切勿盲目处理，应及时请教指导老师。
4．严格按操作规程使用仪器，凡不熟悉操作方法的仪器不得随意动用，对贵重的精密仪器必须先熟知使用方法，才能开始使用；仪器发生故障，应立即关闭电源并报告老师，不得擅自拆修。
5．取用试剂时必须“随开随盖”，“盖随瓶走”，即用毕立即盖好放回原处，切忌“张冠李戴”，避免污染。
6．爱护公物，节约水、电、试剂，遵守损坏仪器报告、登记、赔偿制度。
7．注意水、电、试剂的使用安全。
使用易燃易爆物品时应远离火源。
用试管加热时，管口不准对人。
严防强酸强碱及有毒物质吸入口内或溅到别人身上。
任何时候不得将强酸、强碱、高温、有毒物质抛洒在实验台上。
8．废纸及其它固体废物严禁倒入水槽，应倒到垃圾桶内。
废弃液体如为强酸强碱，必须事先用水稀释，方可倒入水槽内，并放水冲走。
9．以实事求是的科学态度如实记录实验结果，仔细分析，做出客观结论。
实验失败，须认真查找原因，而不能任意涂改实验结果。
实验完毕，认真书写实验报告，按时上交。
10．实验完毕，个人应将试剂、仪器器材摆放整齐，用过的玻璃器皿应刷洗干净归置好，方可离开实验室。
值日生则要认真负责整个实验室的清洁和整理，保持实验整洁卫生。
离开实验室前检查电源、水源和门窗的安全等，并严格执行值日生登记制度。
二、实验报告的基本要求实验报告通过分析总结实验的结果和问题，加深对有关理论和技术的理解与掌握，提高分析、综合、概括问题的能力，同时也是学习撰写研究论文的过程。
1．实验报告应该在专用的生化实验报告本上、按上述格式要求书写。
血清免疫球蛋白的提取分离、纯化及鉴定-2
血清免疫球蛋白的提取分离、纯化及鉴定-2二、组织样品在生化实验中，经常利用离体组织研究各种物质代谢途径和酶系的作用。
或者从组织中分离、纯化核酸、酶以及某些有意义的代谢物质进行研究。
但是，在生物组织中，因含有大量的催化活性物质，离体组织的采集必需在冰冷条件下进行，并日需尽快完成测定。
否则其所含物质的量和生物活性都将发生变化。
一般采用断头法处死动物，放出血液，立即取出所需脏器或组织，除去脂肪和结缔组织，用冰冷生理盐水洗去血液，再用滤纸吸干，称重后，按试验要求制成匀浆或者组织糜。
组织糜：迅速将组织剪碎，用捣碎机绞成糜状，或加入少量砂于乳钵中，研磨至糊状。
组织匀浆：取一定量新鲜组织剪碎，加入适量匀浆制备液，用高速电动匀浆器或者玻璃匀浆器磨碎组织。
由于匀浆器的柞头在高速运转中会产生热量，因此在制备匀浆时，需将匀浆器置于冰水中。
常用的匀浆制备液有生理盐水、缓冲液和0 .25mol/L 的蔗糖液等，可根据实验的要求，加以选择。
组织浸出液：上述组织匀浆液再经过离心分离出的上清液就是组织浸出液。
II 蛋白质的沉淀反应1．实验原理在水溶液中，蛋白质分子表面结合大量的水分子，形成水化膜，同时蛋白质分子本身带有电荷，与溶液的反离子作用，形成双电层，因而每个蛋白质分子可形成一个稳定的胶粒。
整个蛋白质溶液就形成稳定的亲水溶胶体系。
当某些物理化学因素导致蛋白质分子失去水化膜或失去电荷，甚至变性时，它就丧失了稳定因素，以固态形式从溶液中析出，这就是蛋白质的沉淀作用。
蛋白质的沉淀作用分为两类：1）可逆沉淀作用在发生沉淀作用时，虽然蛋白质已经沉淀析出，然而其分子内部结构并没发生明显的改变，仍保持原有的结构和性质。
如除去沉淀因素，蛋白质可重新溶解在原来的溶剂中。
因此，这种沉淀作用称为可逆沉淀作用。
属于此类的有盐析作用，低温下丙酮、乙醇使蛋白质沉淀的作用，以及利用等电点的沉淀。
盐析作用：用大量中性盐使蛋白质从溶液中析出的过程。
在高浓度的中性盐影响下，蛋白质分子的水化膜被剥夺。
血清球蛋白的分离纯化与鉴定
实验血清γ-球蛋白的分离纯化与鉴定【实验目的】1.熟悉蛋白质分离提纯的技术路线2.掌握盐析、凝胶过滤层析、离子交换层析等实验原理及操作技术。
【实验原理】血清中蛋白质按电泳法一般可分为五类：清蛋白、α_1 -球蛋白、α_2 -球蛋白、β-球蛋白和γ-球蛋白，其中γ-球蛋白室一类结构及功能相似的蛋白质，绝大多数免疫球蛋白属于γ-球蛋白，因此γ-球蛋白的分离纯化在医学研究中非常重要。
蛋白质的分离纯化室研究蛋白质结构及其生物功能的重要手段。
分离提纯γ-球蛋白时，首先利用各种清蛋白在中性盐溶液中(常用硫酸铵)溶解度的差异而进行沉淀分离，因为中性盐可使蛋白质表面电荷被中和以及水化膜被破坏，导致蛋白质在水溶液中的稳定因素去除而沉淀。
半饱和硫酸铵溶液可使球蛋白沉淀析出，清蛋白则仍溶解在溶液中，而33%的饱和硫酸铵溶液只能使γ-球蛋白沉淀，α-球蛋白和β-球蛋白则仍溶解在溶液中，经离心分离，沉淀部分即为含有γ-球蛋白的醋制品。
用盐析法分离而得的γ-球蛋白中含有大量的中性盐，会妨碍蛋白质进一步纯化，因此必须去除。
常用的方法有透析法、凝胶层析（凝胶过滤）法等。
本实验采用凝胶层析法，其目的是利用蛋白质与无机盐类之间分子量的差异将蛋白质与无机盐分离。
当溶液通过SephadexG-25凝胶柱时，溶液中分子直径大的蛋白质不能进入凝胶颗粒的网孔，而分子直径小的无机盐能进入凝胶颗粒的网孔之中．因此在凝胶柱中会被阻滞而后洗脱出来，从而可达到去盐的目的。
脱盐后的蛋白质溶液可能仍含有其他球蛋白，利用它们等电点的不同，通过DEAE（二乙基氨基乙基)纤维素阴离子交换层析柱进行层析可进一步分离、纯化出γ-球蛋白。
因为α-球蛋白、β-球蛋白的pI﹤6.0；γ-球蛋白的pI为7.2左右。
因此，在pH6.3的缓冲溶液中，各类球蛋白所带电荷不同，经DEAE纤维素进行阴离子交换而被结合；而带正电的γ-球蛋白则不能与DEAE纤维素进行交换结合从而直接从层析柱流出。
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血清清蛋白、γ-球蛋白的分离、提纯于鉴定
一、实验目的：
1、掌握盐析法分离蛋白质的原理和基本方法
2、掌握凝胶层析法分离蛋白质的原理和基本方法
3、掌握离子交换层析法分离蛋白质的原理和基本方法
4、掌握醋酸纤维素薄膜电泳法的原理和基本方法
5、了解柱层析技术
二、实验原理：
蛋白质的分离和纯化是研究蛋白质化学及其生物学功能的重要手段。
对于不同的蛋白质，其分子量、溶解度及等电点等都有所不同。
利用不同蛋白质在这些性质上的差别，利用相应的物理方法可分离纯化不同蛋白质。
A.盐析法：在蛋白质溶液中加入大量中性无机盐后，由于中性盐与水分子的亲和力大于蛋白质，致使蛋白质分子周围的水化膜减弱乃至消失。
同时，加盐后由于离子强度发生改变，蛋白质表面的电荷大量被中和，从而破坏了蛋白质的胶体性质，导致蛋白质溶解度降低，蛋白质分子之间易于聚集沉淀，进而使蛋白质从水溶液中沉淀析出。
B.凝胶层析：利用蛋白质与无机盐类之间分子量的差异。
当溶液通过SephadeG-25凝胶柱时，溶液中分子直径大的蛋白质不能进入凝胶颗粒网孔，而分子量小的无机盐能进入凝胶颗粒的网孔中，因此在洗脱过程中，小分子的盐会被阻滞而后洗脱出来，从而达到去盐的目的。
C.离子交换层析:离子交换层析是指流动相中的离子和固定相上的离子进行可逆的交换，利用化合物的电荷性质及电荷量不同进行分离。
D.纯度鉴定（醋酸纤维素薄膜电泳）：血清中各种蛋白质的等电点不同，一般都低
于pH7.4。
它们在pH8.6的缓冲液中均解离带负电荷，在电场中向正极移动。
由于血清中各种蛋白质分子大小、形状及所带的电荷量不同，因而在醋酸纤维素薄膜上电泳的速度也不同。
因此电泳时可将它们分离为清蛋白、α1-球蛋白、α2-球蛋白、β-球蛋白、γ-球蛋白5条区带。
三、材料与方法
A材料
样品：人混合血清
试剂：葡聚糖凝胶（G-25)层析柱、DEAE纤维离子交换层析柱、饱和硫酸铵溶液、醋酸铵缓冲溶液、20%磺基水杨酸、1%BaCl
溶液、氨基黑染色液、漂洗液、pH8.6巴比妥缓
2
冲溶液、电泳仪、电泳槽
B实验步骤
盐析（粗分离）→葡聚糖凝胶层析（脱盐）→DEAE纤维素离子交换层析（纯化）→醋酸纤维素薄膜电泳（纯度鉴定）
具体操作流程示意：
（一）盐析+凝胶柱层析除盐：
（二）离子交换层析（纯化）：
（三）醋酸纤维素薄膜电泳：
1、点样（如下图）：
-
点样线尽量点得细窄而均匀,宁少勿多
2、电泳：
①薄膜粗面向下
②点样端置阴极端
③两端紧贴在滤纸盐桥上，膜应轻轻拉平
电压：110V
时间：50min
3、染色和漂洗：
电泳完毕后，关闭电源，将膜取出，直接浸于染色液中5min。
取出膜，尽量沥净染色液，移入漂洗液中浸洗脱色（一般更换2次），至背景颜色脱净为止。
取出膜，用滤纸吸干即可。
注意事项：
1、所用血清应新鲜，无沉淀物及细菌滋生。
2、使用时勿将各时段所应用的溶液浓度弄错。
3、上样时，滴管应沿柱上端内壁加入样品，动作应轻、慢，勿将柱床冲起。
流洗平衡时亦
应如此。
4、洗脱时应注意及时收集样品，切勿使蛋白质峰溶液流失，并注意层析柱不要流干，进入空气。
5、切勿将检测蛋白质的磺基水杨酸与检查SO
42-的BaCl
2
混淆，因二者与相应物质生成的沉
淀均为白色。
6、葡聚糖凝胶价钱昂贵，要回收再生,避免损耗，严禁倒掉!
四、结果与讨论
实验过程中的现象：
加样时：把饱和硫酸铵加入到血清后观察到溶液浑浊。
溶液下层呈米黄色，上层呈淡黄色。
离心后溶液分层为：
下层为沉淀，呈乳白色。
上层为清液，呈淡黄色。
原始实验数据：
将4条经过染色的醋酸纤维素薄膜并列，使点样线位于同一水平。
以正常血清蛋白图谱为对照，观察提纯的物质属哪种蛋白。
所得的照片如下图：
结果：从电泳图谱中可以看出，血清样品的电泳分离情况并不理想，除清蛋白外，α1-球蛋白、α2-球蛋白、β-球蛋白、γ-球蛋白这4条区带未能清晰分离。
对于清蛋白第1管和清蛋白第2管，其电泳结果与血清的清蛋白电泳图谱几乎一致，可以确定管内的蛋白质为清蛋白，同理球蛋白管内的蛋白质为γ-球蛋白。
讨论： 1，对于血清样品的电泳图谱中4条球蛋白区带分离情况不佳的情况，其可能为在滴加血清样品时滴加过多，使得球蛋白的4条区带彼此靠近而导致分离情况不佳的情况发生。
2，对于清蛋白管和球蛋白管中区带颜色浅的情况，其可能为提纯操作中滴加洗脱液过多导致
血清蛋白稀释过度，导致收集的提纯蛋白溶液的蛋白浓度降低而使得电泳所得区带颜色较浅。
3，对于清蛋白1管中清蛋白区带弯曲的情况，其可能为未水平点样或电泳时薄膜为放正所致。
结论：本次试验所获得的结果除血清样品的电泳图谱外基本与预期试验结果相一致。
思考题：
1.硫酸铵盐析一步,为什么是0.8ml血清加0.8ml饱和硫酸铵?
答：因为清蛋白和球蛋白的盐析浓度不一样，使用半饱和硫酸铵溶液可以使球蛋白沉淀而清蛋白不沉淀，0.8ml血清和0.8ml饱和硫酸铵混合可以形成半饱和硫酸铵溶液从而达到分离的目的。
2.为什么实验中DEAE纤维素柱分离γ-球蛋白后不用再生,可直接用于纯化清蛋白?
答：因为缓冲液相同并且分离球蛋白后DEAE纤维素柱的成分没有发生改变，可以继续用于纯化清蛋白。
3.应用醋酸纤维素薄膜电泳鉴定分离纯化后的血清清蛋白和γ-球蛋白的纯度,根据什么来确定它是清蛋白还是γ-球蛋白?判定它们纯度的依据是什么?
答：根据各自的电泳图谱与正常血清蛋白图谱作对照来确定它是清蛋白还是γ-球蛋白。
判定它们纯度的依据是染色后颜色的深浅，深的说明纯度高，浅的说明纯度低。