肿瘤自杀基因治疗及中药方药的增效作用和机.pptx

技术路线 获得目的基因 酶切酶切鉴定 质粒重组 重组质粒鉴定
病毒滴度测定 病毒感染胃癌细胞
斑点杂交鉴定 GCV杀伤试验
病毒包装和阳性克隆筛选
目的基因（tk基因）的获得
由美国匹兹堡大学药理教研室Huang L.教授惠赠，广州军区总医院赵亚刚博士 提供 （ pICl9R/MCl-tk质粒）
pICl9R/MCl-tk质粒酶切鉴定结果
5：Marker(λDNA /EcoRⅠ+ HindⅢ)
重组质粒的限制性内切酶鉴定结果
▪1 2 34 5 6
a：pLXSN-tk质粒结构图
b：pLXSN-tk质粒的酶切鉴定电泳图谱
1．DNA marker Ⅸ(分子量分别为2.5kb, 2.0kb , 1.5kb , 1.0 kb, 500bp, 300bp) 2．pLXSN-tk经EcoR I单酶切 3．4．pLXSN-tk经EcoR I/BamH I双酶切 5． pLXSN-tk质粒 6． DNA/ EcoR I/Hind Ⅲmarker
苷类似物
araM
5-FC
CB1954，MTZபைடு நூலகம் NFT
6TG 6TX
CPA，IFA
CMDA
Mep-dr
RARP，Lamins Rb， U1-70kD等 －
产物
磷酸化的核苷 类似物
araATP
5-FU
羟胺衍生物
6-硫代鸟嘌呤酸 碱性化的底物
芥类药物 6-甲嘌呤 被降解 失活的底物
－
旁杀伤效应 有
研究最多
死亡
“细胞凋亡”机 制
▪ 自杀基因引起细胞死亡的形式为细胞凋 亡
▪ tk+细胞凋亡形成凋亡小体为tk-细胞吞噬 引起tk-细胞死亡
细胞死亡
tk-细胞
介质扩散
5-Fc CD
5-Fu
5-Fu
CD-细胞死亡
5-Fu 5-Fu
抗肿瘤血管生成
注： 自杀基因
单纯自杀基因治疗存在主要问题
目的基因转染率低而杀伤力不足；缺 乏靶向性，自杀基因的表达缺乏组织 特异性和时序性等，单纯自杀基因治 疗难以完全消除肿瘤细胞
重组质粒的测序图鉴定结果
PT67包装细胞筛选结果
a：G418筛选5d后的PT67 b：筛选2w后形成的阳性克隆细胞 图3 pLXSN-tk质粒转染包装细胞PT67结果
病毒滴度测定及结果
本实验测定滴度最高为1×104cfu/mL
旁杀伤效应
旁杀伤效应作用机制
▪ “缝隙连接”机制 ▪ 免疫介导机制 ▪ “细胞凋亡”机制 ▪ 介质机制 ▪ 抗肿瘤血管生成
缝隙连接机制
免疫介导机制
1
tk+
免疫抑制
2 免疫增强
死亡 免疫激活
大量抗原释放 免疫细胞浸润 细胞因子释放
免疫炎症系统介导的 非特异性杀伤
诱发特异性 抗肿瘤免疫反应
旁杀伤效 应增强
基因治疗的策略
基因治疗的临床试验
肿瘤的基因治疗
恶性肿瘤由于患者来源广，用于治疗的基因多， 容易复制动物模型等原因而成为首选对象
目前常用的肿瘤基因治疗方案
•肿瘤的免疫基因治疗 •肿瘤抑制基因治疗 •自杀基因治疗（最有应用前景） •肿瘤多药耐药性基因治疗 •抑制血管生成的基因治疗
自杀基因的概念
内
容
• 研究背景及研究思路 •HSV-tk/GCV肿瘤自杀基因治疗系统的构建 •中药方药对肿瘤自杀基因治疗的增效作用 •中药方药增效作用的机制 •肿瘤自杀基因治疗系统的改进工作
研究背景及研究思路
基因治疗的概念
基因治疗就是将外源性基因导入到正常或病变细胞中， 利用其转录或翻译产物发挥治疗作用的一种方法
肿瘤自杀基因治疗及中药方药的增效作用和机制
主讲人：杜标炎 广州中医药大学
课题资助情况
▪ 国家自然科学基金（编号：30171201;30572433;
30672747 ）
▪ 广东省科技攻关计划（编号：2005B3030102 ） ▪ 广州市科委（编号：2002J1-C7401） ▪ 广东省中医药管理局（编号：A401028；1050079） ▪ 广州中医药大学(K0050031)
肿瘤自杀基因疗法的增效方法
▪ 双自杀基因治疗 ▪ 联合治疗
联合免疫基因治疗 联合放射治疗 联合化学治疗 联合其他基因
▪ 靶向基因治疗 ▪ 增强旁杀伤效应
研究思 路
单纯自杀基因治疗 载体转染效率低
易复发
靶向性不够
联合治疗增效
• 肯定的免疫药理作用
• 多靶点作用
联合免疫基因 联合放化疗
• 给药方便，价格低廉，毒副
多基因间互相干扰，
作用小或无明显毒副作用
难以保证导入基因 表达或长期表达；
联合中药方药
使用病毒载体量增 多，潜在毒副作用
提高旁杀伤效应
增大；操作过程复 杂，成本较高
增强免疫功能
增强“缝 隙连接”
增强杀伤 敏感性
自杀基因疗法联合中药方药可能是功一能种更为有效和可行的方案
HSV-tk/GCV肿瘤自杀基因治疗系统的构建
12 3 45
a：pICl9R/MCl-tk质粒结构图
b：pICl9R/MCl-tk质粒的酶切鉴定电泳图谱
注（b）：1：Marker(λDNA HindⅢ)；
2：pICl9R/MCl-tk质粒
3：pICl9R/MCl-tk质粒/BamHⅠ； 4：pICl9R/MCl-tk质粒/BamHⅠ+EcoRⅠ
－ 有 有
有 有 有 有 － 有
备注 已上临床
已上临床 研究正在兴
起
自杀基因治疗的优势
①特异性杀伤基因表达细胞 ②杀伤多药耐药性（MDR）肿瘤细胞 ③基因的表达只需将一定量的前药转换成足以杀 伤肿瘤细胞的剂量即可，而无需基因的长期表达 ④绝大部分自杀基因存在极明显的“旁杀伤效 应”，体外只需有10％以上的肿瘤细胞表达自杀 基因，就可以杀伤绝大部分甚至全部肿瘤细胞 ⑤良好的瘤苗
大肠杆菌胞嘧啶脱氨酶 （EC-CD）
大肠杆菌硝基还原酶 （NTR）
大肠杆菌黄嘌呤-鸟嘌呤 磷酸核糖转移酶（EC-
XGPRT或gpt基因）
细胞色素P450 CYP 2B1
细胞羧肽酶G2（CPG2）
大肠杆菌DeoD 基因 （PNP）
白细胞介素1β转化酶 （ICE）
p53
底物 GCV，ACV，PCV，
BCV，BVDU， BVDC，IVDU等核
所谓自杀基因是指在一定条件下，可以引 起细胞自动死亡的基因
目前研究的多数自杀基因是通过编码病毒或细菌的酶 介导敏感性，这些酶能把药物的无活性形式转化为毒性代谢 产物，引起细胞死亡
目前应用于实验室和临床主要的自杀基因治疗系统
基因名称
单纯疱疹病毒胸苷激酶 （HSV-tk）
水痘带状疱疹病毒胸苷激 酶（VZV-tk）