抗菌药物敏感试验

操作方法：1.抗菌药物的稀释和融解
2.抗菌药物母液的稀释
3.在微量聚乙烯微板孔中加各种不同浓度的抗生素 100μl，从低浓度往高浓度加样，不需要更换吸管。
4.挑选18~24小时的菌落置M-H肉汤增菌4~6小时。
5.制备0.5麦氏比浊管，然后1:200稀释，使之最终 浓度105 CFU/ml。
除肺炎链球菌外的其他链球菌：红霉素、青霉素、克 林霉素、万古霉素、头孢曲松、左氧氟沙星。
7.用无菌镊子或纸片分配器将抗菌纸片粘贴于M-H琼脂 的表面，一旦纸片贴上，不能移动；各抗菌纸片中 心距离应大于24mm，纸片距平板内缘应大于15mm。
8.经过35℃16～24h孵育。
9.取抑菌环直径，根据 CLSI（clinical and laboratory standards institute ）标准，报 告细菌对该抗生素 敏感(susceptible,S)、 耐药(resistant,R)、 中介(intermediate,I)。
纸片扩散法（KirbyBauer法）
原理：
将含有定量抗菌药物的纸片贴在已接种测 试菌的琼脂平板上，纸片中所含的药物吸收琼 脂中水分溶解后不断向纸片周围扩散形成递减 的梯度浓度，在纸片周围抑菌浓度范围内测试 菌的生长被抑制，从而形成无菌生长的透明圈 即为抑菌圈。
抑菌圈的大小反映测试菌对测定药物的敏 感程度，并与该药对测试菌的MIC呈负相关。
第四章 抗菌药物的敏感性试验
药敏试验的意义
1、可预测抗菌治疗的效果 2、指导临床抗菌药物的使用 3、发现或提示细菌耐药机制，帮助临床医生合理使 用抗菌药物 4、监测细菌的耐用性，分析耐药菌的变化，预防和 控制耐药菌感染的发生和流行
抗菌药物的敏感性试验
常用方法：
纸片扩散法 微量液体稀释法 E-TEST法
微量液体稀释法 (microdilution test)
原理：
聚乙烯板内含有各种稀释度的抗菌药物，实验时 加入100μl浓度为105 CFU/ml的菌液，盖上盖板，35℃ 16～20h观察结果。孔底部清晰不出现细菌沉淀的最低 抗菌药物浓度即为该抗菌药物对细菌的最小抑菌浓度， 通过CLSI标准判断其敏感和耐药。再取0.01ml容量接种 环取肉眼观察无菌生长的液体接种于血琼脂平板作次代 培养，经35℃过夜培养后观察最低抗菌药物浓度能杀死 99.9％原始种入的细菌即为该菌的最低杀菌浓度(MBC)。
5.孵育，置平板于35℃孵育16～24h。
6.孵育后形成一椭圆形抑菌圈，抑菌圈和试条的相交 处的刻度即为抗菌药物对该菌的最低抑菌浓度(MIC) 。
第九节 细菌的分类命名
一、分类原则:细菌的分类原则上分为传统 分类和种系分类。
分类方法： （1）人为分类法：
以细菌形态和生理生化特征为依据，分为： 传统分类法 和 数值分类法
5.盖上平板的盖子，放置培养箱内孵育，放置3~10分钟 后贴上标准抗生素纸片。
6.根据选择的菌株挑选相应的抗菌纸片。
肠杆菌科：氨苄西林、阿米卡星、哌拉西林/ 他唑巴坦、头孢噻肟、环丙沙星、亚胺培 南、氨曲南、庆大霉素；
铜绿假单胞菌：头孢他啶、庆大霉素、哌拉西林、 阿米卡星、环丙沙星、头孢吡肟、亚胺培南；
操作方法 ：
1.将在约56℃恒温的无菌M-H（水解硌蛋白）琼脂倾 注直径为90mm的平板，其厚度 4mm。
2.无菌挑取孵育16～24h的血平板上4~5个菌落。
3.置于无菌生理盐水中，校正其浊度于McFarland No 0.5管。
4.用无菌棉签浸入细菌悬 液中，将拭子在试管上壁 轻轻挤压以挤去过多的菌 液。棉签在三个方向均匀 抹琼脂表面（每次转60℃） 使菌液均匀分布，最后沿 平板内缘涂抹一周。
6.用微量加样器接种100μl 到96孔中，盖上盖板。 同时作阳性、阴性对照。
7.手工看浊度或仪器自动 判读。按照CLSI标准报 告细菌对某抗菌药物为 敏感、耐药和中介。
E-TEST
原理：
E试条是一条5mm×50mm无孔试剂载体，一面 固定有一系列预先制备的浓度呈连续指数增长稀释抗 菌药物，另一面有读数和判别的刻度。抗菌药物的梯 度可覆盖有20个MIC对倍稀释浓度的宽度范围。将E 试条放在细菌接种过的琼脂平板上，经孵育过夜，围 绕试条明显可见椭圆形抑菌圈，圈的边缘与试条交点 的刻度浓度即为抗菌药物抑制细菌的最小抑菌浓度， 对照CLSI标准判断其敏感、耐药、中介。
操作方法：
1.挑取16～20h的菌落 2.用无菌生理盐水制备成0.5麦氏比浊管浊度的菌液。
3.用无菌棉签浸入细菌悬液中，将拭子在试管上壁轻 轻挤压以挤去过多的菌液。棉签在三个方向平均涂抹 琼脂表面（每次转60℃）使菌液均匀分布，最后沿平 板内缘涂抹一周。
4.用镊子将E-TEST试条的抗菌药物的一面贴向琼脂表 面，有刻度的一面向外，直径140mm的平板可放置 6条，90mm平板只能放置1～2试条 。
葡萄球菌属：头孢西丁、青霉素、红霉素、万古霉 素、环丙沙星、庆大霉素、利福平 ；
肠球菌属：青霉素 、万古霉素 、甲氧苄啶/磺胺异 噁唑 、庆大霉素、环丙沙星、红霉素、氨苄西林
不动杆菌属：头孢他啶 、亚胺培南、阿米卡星、哌拉 西林/他唑巴坦、头孢吡肟 、头孢曲松 、环丙沙 星、米诺环素；
洋葱伯克霍德菌：头孢他啶 、米诺环素、甲氧苄啶/磺 胺异噁唑 、美罗培南 ；
（2）系统分类法： 以细菌大分子物质（核酸、蛋白质）结构的同源 程度进行分类，称为种系分类或自然分类
具体到细菌鉴定和分类的方法包括 ⒈表型分类：以细菌的形态和生理特征为依据的 分类方法，即选择一些较为稳定的生物学性状，如菌 体形态与结构、染色性、培养特性、生化反应、抗原 性等作为分类的标记，它奠定了传统分类的基础。
嗜麦芽窄食单胞菌：甲氧苄啶/磺胺异噁唑、左氧氟沙 星、米诺环素 ；
嗜血杆菌属：氨苄西林、甲氧苄啶/磺胺异噁唑、头孢 他啶、美罗培南、阿奇霉素、环丙沙星、头孢克洛；
淋病奈瑟菌：头孢曲松、环丙沙星、青霉素、大观霉素、 四环素 ；
肺炎链球菌：红霉素 、苯唑西林 、甲氧苄啶/磺胺异噁唑、 克林霉素、左氧氟沙星、四环素、万古霉素 ；