实验3蛋白质的等电点测定和沉淀反应
蛋白质等电点测定实验报告
蛋白质等电点测定实验报告蛋白质等电点测定蛋白质等电点测定及性质实验一、目的：了解等电点的意义及其与蛋白质分子聚沉能力的关系。
初步学会测定蛋白质等电点的基本方法，了解蛋白质的性质。
二、原理：固体颗粒在液体中为什么能够带电？当固体与液体接触时，固体可以从溶液中选择性吸附某种离子，也可以是固体分子本身发生电离作用而使离子进入溶液，以致使固液两相分别带有不同符号的电荷，由于电中性的要求，带电表面附近的液体中必有与固体表面电荷数量相等但符号相反的多余的反离子。
在界面上带电表面和反离子形成了双电层的结构。
在两种不同物质的界面上，正负电荷分别排列成的面层。
对于双电层的具体结构，一百多年来不同学者提出了不同的看法。
最早于1879年Helmholz提出平板型模型；1910年Gouy和1913年Chapman修正了平板型模型，提出了扩散双电层模型；后来Stern又提出了Stern模型。
根据O.斯特恩的观点，一部分反离子由于电性吸引或非电性的特性吸引作用（例如范德华力）而和表面紧密结合，构成吸附层（或称紧密层、斯特恩层）。
其余的离子则扩散地分布在溶液中，构成双电层的扩散层（或称滑移面）。
由于带电表面的吸引作用，在扩散层中反离子的浓度远大于同号离子。
离表面越远，过剩的反离子越少，直至在溶液内部反离子的浓度与同号离子相等。
紧密层：溶液中反离子及溶剂分子受到足够大的静电力，范德华力或特性吸附力，而紧密吸附在固体表面上。
其余反离子则构成扩散层。
滑动面：指固液两相发生相对移动的界面，是凹凸不平的曲面。
滑动面至溶液本体间的电势差称为ζ电势。
固体颗粒带电量的大小及测量方式？ζ电势只有在固液两相发生相对移动时才能呈现出来。
ζ电势的大小由Zeta电位表示，其数值的大小反映了胶粒带电的程度，其数值越高表明胶粒带电越多，扩散层越厚。
一般来说，以pH值为横坐标，Zeta电位为纵坐标作图，Zeta电位为零对应的pH值即为等电点。
对于蛋白质分子来说：蛋白质分子的大小在胶粒范围内，约1～100微米。
实验三蛋白质等电点测定-文档资料
蛋白质等电点测定
• 二、操作 1. 取4支洁净的试管，按表顺 序分别精确加入各试剂，然 后混匀。 2. 向上述试管中各加入酪蛋白 的醋酸钠溶液1ml，随加随摇。 观察其混浊度。静置10分钟 后，再观察其混浊度。混浊 度以‘＋’的多少来表示。 沉淀最多的一管即为酪蛋白 的等电点。判断其等电点。
• 一、原理 蛋白质是一种两性电解质。在 溶液中存在下列平衡。其解 离状态和程度爱溶液的pH值 影响。当溶液的pH达到一定 数值时，会导致蛋白质颗粒 上正负电荷的数目相等，此 时，蛋白质不移动，此时溶 液的pH值称为该蛋白质的等 电点。等电点时，其溶解度 最小。
2. 不可逆沉淀反应 • 重金属离子沉淀蛋白质 取 1支试管，加鸡蛋清1ml+硝酸银 液1滴，观察现象并记录。加水， 沉淀溶解？解释。 • 有机酸沉淀蛋白质 取 1支试管，加鸡蛋清2ml+三氯乙 酸1ml，混匀，观察现象并记录。 加水，沉淀溶解？为什么？ • 乙醇引起的变性与沉淀 取 三支试管，编号。按表加入试剂。 混匀后，观察各管有何变化，记 录现象。放置片刻后，向各管中 加水8ml，然后在2、3号管中各 加1滴甲基红，再分别用0.1M的 醋酸和0.05M的碳酸钠中和。观 察各管颜色变化和沉淀的生成并 记录。每管再加0.1M的盐酸数滴， 有何现象发生？记录并解释全部 现象。
• 1. 2.
3.
二、操作 蛋白质的盐析 不同浓度的盐析出不同 的蛋白质。如球蛋白可在半 饱和硫酸铵溶液中析出，而 清蛋白则在饱和硫酸铵溶液 中析出。 取一支试管：鸡蛋清液 3ml+饱和硫酸铵液3ml，混 匀后静置数分钟，观察现象 并记录。然后倒出少量混浊 液，加少量水，沉淀是否溶 解，为什么？向管内添加硫 酸铵粉末到不再溶解为止， 又有何现象？加水，沉淀是 否溶解？记录并解释。
蛋白质的两性反应和等电点测定
蛋白质的两性反应和等电点测定一、实验目的1.熟悉蛋白质的沉淀反应、颜色反应和两性反应及其机理。
2.掌握蛋白质等电点的测定方法及其原理。
3.掌握蛋白质电荷的测定方法及其机理。
二、实验原理(一)蛋白质的沉淀反应原理蛋白质的水溶液是一种比较稳定的亲水胶体，这是因为蛋白质颗粒表面带有很多极性基团，如—NH3+，—COO-，—SH，—CONH2等和水有高度亲和性，当蛋白质与水相遇时，就很容易被蛋白质吸住，在蛋白质颗粒外面形成一层水膜(又称水化层)。
水膜的存在使蛋白颗粒相互隔开，颗粒之间不会碰撞而聚成大颗粒。
因此蛋白质在溶液中比较稳定而不会沉淀。
蛋白质能形成较稳定的亲水胶体的另一个原因，是因为蛋白质颗粒在非等电状态时带有相同电荷，使蛋白质颗粒之间相互排斥，保持一定距离，不致相互凝集沉淀。
蛋白质由于带有电荷和水膜，因此在水溶液中形成稳定的胶体。
当某些物理化学因素破坏了蛋白质的水膜或中和了蛋白质的电荷，则蛋白质胶体溶液就不稳定而出现沉淀现象。
蛋白质可因加入下列试剂而产生沉淀：1.加盐类如硫酸铵、硫酸钠、氯化钠等可以破坏蛋白质胶体周围的水膜，同时又中和了蛋白质分子的电荷，因此使蛋白质产生沉淀，这种加盐使蛋白质沉淀析出的现象称盐析。
盐析法是分离制备蛋白质的常用方法，不同蛋白质盐析时所需的盐浓度不同，因此调节盐浓度，可使混合蛋白质溶液中的几种蛋白质分段析出，这种方法叫做分段盐析。
但中性盐并不破坏蛋白质的分子结构和性质，因此，若除去或降低盐的浓度，蛋白质就会重新溶解。
2.加有机溶剂如酒精、丙酮等可使蛋白质产生沉淀，这是由于这些有机溶剂和水有较强的作用，破坏了蛋白质分子周围的水膜，因此发生沉淀作用。
若及时将蛋白质沉淀与丙酮或乙醇分离，蛋白质沉淀则可重新溶解于水中。
3.重金属盐如氯化汞、硝酸银、醋酸铅及三氯化铁等。
这是因为蛋白质在碱性溶液中带负离子，可与这些重金属的正离子作用而生成不易溶解的盐而沉淀。
4.某些酸类如苦味酸、单宁酸、三氯乙酸等能和蛋白质化合成不溶解的蛋白质盐而沉淀。
蛋白质的性质实验二-蛋白质的等电点测定和沉淀反应
蛋白质沉淀反应结果分析
要点一
蛋白质沉淀反应原理
当溶液的pH值低于或高于蛋白质的 等电点时，蛋白质带负电荷或正电荷 ，容易与其他带相反电荷的物质发生 静电吸引而产生沉淀。沉淀反应可用 于分离纯化和测定蛋白质含量。
要点二
实验结果
实验观察到在pH值低于或高于等电 点时，蛋白质出现沉淀现象。通过离 心分离和称重，测定了沉淀物中蛋白 质的质量和含量。实验结果表明，该 蛋白质在不同pH值下的沉淀效果显 著，可用于蛋白质的分离纯化和含量 测定。
实验试剂
盐酸、氢氧化钠、醋酸、醋酸钠、磷酸盐缓冲液等。
配置不同pH值的缓冲液
选择适当的缓冲液，如醋酸-醋酸钠缓 冲液、磷酸盐缓冲液等。
根据需要配置不同pH值的缓冲液，确 保缓冲液的准确性和稳定性。
蛋白质溶液的等电点测定
将蛋白质溶液与不同pH值的缓冲液混合，观察蛋白质的溶解度变化。
当蛋白质溶解度最低时，记录对应的pH值，即为该蛋白质的等电点。
了解蛋白质的沉淀反应及原理
沉淀反应
蛋白质在某些条件下，失去溶解性从 溶液中析出的现象。
原理
蛋白质的沉淀反应通常与溶液的pH值 、离子强度、温度等因素有关，当这 些因素发生变化时，蛋白质的溶解度 可能会降低，导致沉淀的产生。
02
实验原理
蛋白质等电点的概念及影响因素
蛋白质等电点
蛋白质分子在溶液中处于净电中性状态时的pH值，此时蛋白质的溶解度最低。
通过测定不同pH值下的蛋白质电导率，确定了蛋 白质的等电点。
在实验过程中，观察到了蛋白质的溶解度变化和 电荷性质的变化。
分析实验结果与理论预期的差异
实验结果与理论预期基本一致，没有出现明显的偏差。
实验结果支持了蛋白质等电点沉淀的理论，即当溶液pH值等于蛋白质等电点时，蛋白质溶解度最低， 容易发生沉淀。
实验三 蛋白质的两性反应和等电点的测定
实验三蛋白质的两性反应和等电点的测定一、目的和要求1.了解蛋白质的两性解离性质。
2.初步学会测定蛋白质等电点的方法。
二、原理蛋白质由许多氨基酸组成，虽然绝大多数的氨基与羧基成肽键结合，但是总有一定数量自由的氨基与羧基，以及酚基等酸碱基团，因此蛋白质和氨基酸一样时两性电解质。
调节溶液的酸碱度达到一定的氢离子浓度时，蛋白质分子所带的正电荷和负电荷相等，以兼性离子状态存在，在电场内该蛋白质分子既不向阴极移动，也不向阳极移动，这时溶液的PH值称为该蛋白质的等电点（PI）。
当溶液的PH低于蛋白质等电点时，即在氢离子较多的条件下，蛋白质分子带正电荷成为阳离子；当溶液的PH高于蛋白质等电点时，即在氢氧根离子较多的条件下，蛋白质分子带负电荷成为阴离子。
在等电点时蛋白质溶解度最小，容易沉淀析出。
三、试剂和器材1.试剂0.5%酪蛋白溶液；酪蛋白醋酸钠溶液；0.04%溴甲酚绿指示剂；0.02N盐酸；0.1N醋酸溶液；0.01N醋酸溶液；1N醋酸溶液；0.02N氢氧化钠溶液2.器材试管及试管架；滴管；吸量管（1、5ml）四、操作方法1.蛋白质的两性反应（1）取1支试管，加0.5%酪蛋白溶液20滴和0.04%溴甲酚绿指示剂5-7滴，混匀。
观察溶液呈观的颜色，并说明原因。
（2）用细滴管缓慢加入0.02N盐酸溶液，随滴随摇，直至有明显的大量沉淀发生，此时溶液的PH 接近与酪蛋白的等电点。
观察溶液颜色的变化。
（3）继续滴入0.02N盐酸溶液，观察沉淀和溶液颜色的变化，并说明原因。
（4）再滴入0.02N氢氧化钠溶液进行中和，观察是否出现沉淀，解释其原因。
继续滴入0.02N氢氧化钠溶液，为什么沉淀又会溶液？溶液的颜色如何变化？说明了什么问题？2.酪蛋白等电点的测定（1）取9支粗细相近的干燥试管，编号后按下表的顺序准确地加入各种试剂。
加入每种试剂后应混合均匀。
试管编号9蒸馏水（ml）2.43.2—1.60.8———2.03.03.51.52.753.38————————加1N醋酸溶液入0.1N醋酸溶液—的0.01N醋酸溶液—试酪蛋白醋酸钠剂溶液最终PH沉淀出现情况4.02.01.00.5—————2.51.250.621.01.01.01.01.01.01.01.01.03.53.84.14.44.75.05.35.65.9（2）静置约20分钟，观察每支试管内溶液的混浊度，以—，+，++，+++，++++符号表示沉淀的多少。
蛋白质的等电点测定与沉淀实验
实验项目一、蛋白质的等电点测定及沉淀反应姓名：指导教师：实验室：组员：成绩：第三部分：实验记录与分析实验现象记录及分析：（一）蛋白质等电点测定（二）蛋白质的盐析1．蛋白质的盐析2．重金属离子沉淀蛋白质3．有机酸沉淀蛋白质4．有机溶剂沉淀蛋白质5．乙醇引起的变性与沉淀第四部分：课后研讨题1.通过本次合作实验后，有否对该项目改进的合理建议。
适当增加对照组和空白组，使实验数据更加科学可信。
2.鸡蛋清为何可做铅、汞中毒的解素剂？铅、汞是重金属离子，与蛋白质结合能使蛋白质分子内部结构发生重大改变，发生变性而沉淀，不再溶于原来的溶剂中。
3.氯化汞为何能做为杀菌剂？细菌由蛋白质构成，氧化汞是重金属盐，与蛋白质结合能使蛋白质分子内部结构发生重大改变，发生变性而沉淀，不再溶于原来的溶剂中。
4.在等电点时，蛋白质溶液为什么容易发生沉淀？蛋白质颗粒上正负电荷的数目相等，在水溶液中的蛋白质分子由于表面生产水化层和双电层而成为稳定的亲水胶体颗粒，在一定的理化因素影响下，蛋白质颗粒可因失去电荷和脱水而沉淀。
5.将本实验中所涉及到的几种蛋白质沉淀方法各举一应用实例加以说明。
（1）盐析：硫酸铵的浓溶液能析出蛋白质。
（2）乙醇引起的变性与沉淀：低温下用乙醇或丙酮短时间作用于蛋白质，用于提纯蛋白质。
（3）重金属离子沉淀蛋白质：取一支离心管，加入2ml的蛋白质溶液，再加入3%硝酸银溶液1-2滴，振荡试管，观察现象。
（4）某些有机酸沉淀蛋白质：取一支离心管，加入2ml蛋白质溶液，再加入1ml 5%三氯乙酸溶液，振荡试管，观察现象。
（5）有机溶剂沉淀蛋白质：取一支离心管，加入2ml蛋白质溶液，再加入2ml 95%乙醇，观察现象。
教师评阅：签名。
实验三蛋白质的沉淀与变性反应一、实验目的1、加深对蛋白质胶体溶液
实验三蛋白质的沉淀与变性反应一、实验目的1、加深对蛋白质胶体溶液稳定因素的认识。
2、了解沉淀蛋白质的几种方法及其实用意义。
3、了解蛋白质变性与沉淀的关系。
二、实验原理多数蛋白质是亲水胶体，在水溶液中，蛋白质分子的表面，由于形成水化层和双电层而称为稳定的胶体颗粒，所以蛋白质溶液和其他亲水胶体溶液相类似。
但是，蛋白质胶体颗粒的稳定性是有条件的、相对的。
在一定的物理化学因素影响下，蛋白质颗粒失去电荷，脱水，甚至变性以固态形式从溶液中析出，这个过程称为蛋白质的沉淀反应。
这种反应可以分为以下两种类型。
1、可逆沉淀反应：在发生沉淀反应时，蛋白质虽已沉淀析出，但它的分子内部结构并未发生显著变化，基本上保持原有的性质，沉淀因素出去后，能在溶于原来的溶剂中。
这种作用称为可逆沉淀反应，又叫做不变性沉淀反应。
属于这一类的反应有盐析作用、利用等电点的沉淀以及在低温下，乙醇、丙酮对蛋白质的短时间作用等。
2、不可逆沉淀反应：在发生沉淀反应时，蛋白质分子内部结构、空间构象遭到破坏，失去原来的天然性质，这时蛋白质已发生变性。
这种变性蛋白质的沉淀不能再溶于原来溶剂中的作用叫做不可逆沉淀反应。
重金属盐、生物碱试剂、过酸、过碱、加热、震荡、超声波，有机溶剂等都能使蛋白质发生不可逆沉淀反应。
三、仪器、试剂和材料1、仪器试管及试管架，移液管，玻璃漏斗，滤纸，玻璃棒，烧杯，量筒。
2、试剂（1）蛋白质溶液：取5ml鸡蛋蛋清，用蒸馏水稀释至100ml，搅拌均匀后用4~8层纱布过滤，新鲜配制；（2）饱和硫酸铵溶液：称取固体（NH4）2SO4加于1000ml蒸馏水中，在70~80°C下搅拌促溶，室温中放置过夜，瓶底析出白色结晶，上清液即为饱和硫酸铵溶液。
（3）饱和苦味酸溶液：称取2g苦味酸放入三角烧瓶，加蒸馏水100ml，80℃水浴约10min 使之完全溶解，于室温下冷却后瓶底析出黄色结晶，上清液即为饱和苦味酸，此溶液可存放数年；（4）其他试剂硫酸铵粉末，3%硝酸银，1%醋酸铅，1%硫酸铜，10%三氯乙酸，0.5%磺基水杨酸，95%乙醇，1%醋酸，5%鞣酸。
实验一、蛋白质的等电点测定和沉淀反应课件PPT
0.2M 醋酸-醋酸钠缓冲液，pH4.7 3%硝酸银溶液 5%三氯乙酸溶液 95%乙醇 饱和硫酸铵溶液：25℃，100mL水＋76.7g硫酸铵 0.1 M盐酸溶液 0.1 M氢氧化钠溶液 0.05 M碳酸钠溶液 0.1 M醋酸溶液
甲基红溶液：pH变色范围为4.4-6.2，由红变黄
2021/3/10
12
四、实验操作
（一）酪蛋白等电点的测定
（1）取4支试管，按下表顺序分别加入各试剂，混匀。
试管号 蒸馏水 0.01 M醋酸 0. 1 M醋酸 1. 0 M醋酸
mL
mL
mL
mL
1
8.4
0.6
-
—
2
8.7
-
0.3
—
3
8.0
-
1.0
—
4
7.4
-
-
1.6
2021/3/10
13
（2）向以上试管中各加酪蛋白的醋酸钠溶液1mL， 加一管，摇匀一管。此时1、2、3、4管的pH依次为 5.9、5.5、4.7、3.5。观察其混浊度。静置10分钟 后，再观察其混浊度。最混浊（有颗粒沉淀）的一 管pH即为酪蛋白的等电点。
如：盐析作用、低温下用乙醇（丙酮）短时间 作用于蛋白质。
提纯蛋白质时，常利用此类反应。
问题：提纯蛋白质时常用的沉淀方法有哪些?
2021/3/10
7
➢ 不可逆沉淀反应
蛋白质分子内部结构发生重大改变，蛋白质常 变性而沉淀，不再溶于原来溶剂中。
加热引起的蛋白质沉淀与凝固，蛋白质与重金 属离子或某些有机酸的反应都属于此类。
2021/3/10
实验五 蛋白质的性质实验(二)(打好生化基础哦)
蛋白质的等电点测定和沉淀反应
蛋白质等电点测定
一、目的： 了解蛋白质的两性解离性质 学习测定蛋白质等电点的一种方法
二、原理：
• 蛋白质是两性电解质，在酸性溶液中成阳离子， 在碱性溶液中成阴离子：
当溶液的pH达到一定数值时，蛋白质颗粒上正 负电荷的数目相等，在电场中，蛋白质既丌向阴 极移动，也丌向阳极移动，此时溶液pH值称为此 种蛋白质的等电点。丌同蛋白质各有其特异性的 等电点。在等电点时，蛋白质的理化性质都有变 化，可利用此种性质的变化测定各种蛋白质的等 电点。最常用的方法是测其溶解度最低时的溶液 pH值。 用醋酸不醋酸钠（醋酸钠混合在酪蛋白溶液 中）配制成各种丌同pH值的缓冲液。向缓冲液溶 液中加入酪蛋白后，沉淀出现最多的缓冲液的pH 值即为酪蛋白的等电点。
四、操作步骤
• 1．蛋白质的盐析 无机盐（硫酸铵、硫酸钠、氯化钠等） 的浓溶液能析出蛋白质。盐的浓度丌同，析出的蛋白质也 丌同。 • 如球蛋白可在半饱和硫酸铵溶液中析出，而清蛋白则在饱 和硫酸铵溶液中才能析出。 • 由盐析获得的蛋白质沉淀，当降低其盐类浓度时，又能再 溶解，故蛋白质的盐析作用是可逆过程。 • 加5%卵清蛋白溶液5 ml于试管中，再加等量的饱和硫酸铵 溶液，混匀后静置数分钟则析出球蛋白的沉淀。倒出少量 混浊沉淀，加少量水，观察是否溶解，为什么？将管中内 容物过滤，向滤液中添加硫酸铵粉末到丌再溶解为止，此 时析出的沉淀为清蛋白。 • 叏出部分清蛋白，加少量蒸馏水，观察沉淀的再溶解。
• 2．重金属离子沉淀蛋白质 重金属离子不蛋白质 结合成丌溶于水的复合物。 • 叏1支试管，加入蛋白质溶液2 ml，再加3%硝酸银 溶液1~2滴，振荡试管，有沉淀产生。放置片刻， 倾去上清液，向沉淀中加入少量的水，沉淀是否 溶解？为什么？ • 3．某些有机酸沉淀蛋白质 叏1支试管，加入蛋白 质溶液2 ml，再加1 ml 5%三氯乙酸溶液，振荡试 管，观察沉淀的生成。放置片刻，倾出上清液， 向沉淀中加入少量水，观察沉淀是否溶解。 • 4．有机溶剂沉淀蛋白质 叏1支试管，加入2 ml蛋 白质溶液，再加入2 ml 95%乙醇。混匀，观察沉 淀的生成。
实验三蛋白质的沉淀反应
加水
沉淀是否溶解？ 沉淀是否溶解？
沉淀？ 沉淀？ 加入1%醋酸4 1%醋酸 加入5% 5%鞣酸数滴 加入1%醋酸4-5滴，加入5%鞣酸数滴
蛋白质溶液2 蛋白质溶液2 ml 加入
混匀
沉淀？ 沉淀？
加水
沉淀是否溶解？ 沉淀是否溶解？
加入1%醋酸4 加入1%醋酸4-5滴，加入饱和苦味酸数滴 1%醋酸
实验三、蛋白质的沉淀反应
1、实验目的
• 熟悉蛋白质的沉淀反应 • 进一步掌握蛋白质的性质
2、实验难点与重点
• 2.1蛋白质沉淀的方法有哪些 • 2.2蛋白质沉淀反应的原理
3、实验原理
• 蛋白质胶体溶液稳定的因素:水化膜、表面电荷 蛋白质胶体溶液稳定的因素:水化膜、 • 加入适当试剂使蛋白质分子处于等电点状态或失去水 化层，或者与某些试剂结合成不解的盐后， 化层，或者与某些试剂结合成不解的盐后，蛋白质的 胶体溶液就不稳定，并将产生沉淀。 胶体溶液就不稳定，并将产生沉淀。
• 改变蛋白质表面的水化层及电荷的主要途 径有：
–改变溶液的离子强度 –改变溶液的pH –改变溶液的介电常数 –改变溶液的温度
• 蛋白质沉淀可逆与不可逆的区别
• 能使蛋白质沉淀的试剂有： 能使蛋白质沉淀的试剂有：
高浓度中性盐
（NH4)2SO4、Na2SO4、NaCl（中和蛋白质的电荷，可逆） NH4)2SO4、Na2SO4、NaCl（中和蛋白质的电荷，可逆） 这种加入盐使蛋白质沉淀析出的现象称为盐析 盐析， 这种加入盐使蛋白质沉淀析出的现象称为盐析，用于蛋白质分 离制备
生物碱试剂沉淀：三氯乙酸，苦味酸，钨酸等（必须在溶液pH 生物碱试剂沉淀：三氯乙酸，苦味酸，钨酸等（必须在溶液pH 沉淀 大于pI pI时 蛋白质带正电荷，可以与生物碱试剂结合） 大于pI时，蛋白质带正电荷，可以与生物碱试剂结合） 加热变性沉淀 变性沉淀： 加热变性沉淀：豆腐 等电点沉淀 Glu的生产 沉淀： 等电点沉淀：Glu的生产
蛋白质沉淀条件实验报告
一、实验目的1. 掌握蛋白质沉淀的基本原理和实验方法。
2. 了解不同沉淀剂对蛋白质沉淀效果的影响。
3. 探究蛋白质沉淀的最佳条件。
二、实验原理蛋白质在特定条件下，如pH、温度、离子强度等，会发生沉淀现象。
蛋白质沉淀的原理主要有以下几种：1. 盐析：中性盐对蛋白质的溶解度有显著影响，一般在低盐浓度下随着盐浓度升高，蛋白质的溶解度增加，此称盐溶；当盐浓度继续升高时，蛋白质的溶解度不同程度下降并先后析出，这种现象称盐析。
2. 等电点沉淀：蛋白质在等电点时溶解度最低，此时加入少量电解质即可使蛋白质沉淀。
3. 重金属盐沉淀：重金属离子与蛋白质中的巯基、羧基等官能团结合，使蛋白质变性沉淀。
4. 酶促反应：某些酶可以催化蛋白质变性，使其沉淀。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：鸡蛋清、硫酸铵、氯化钠、硝酸银、氢氧化钠、盐酸、氢氧化铵、蒸馏水等。
2. 实验仪器：离心机、烧杯、玻璃棒、移液器、pH计、电子天平等。
四、实验方法1. 盐析实验：将鸡蛋清溶液与不同浓度的硫酸铵溶液混合，观察蛋白质沉淀现象。
2. 等电点沉淀实验：将鸡蛋清溶液调至不同pH值，观察蛋白质沉淀现象。
3. 重金属盐沉淀实验：将鸡蛋清溶液与不同浓度的硝酸银溶液混合，观察蛋白质沉淀现象。
4. 酶促反应实验：将鸡蛋清溶液与不同浓度的氢氧化钠溶液混合，观察蛋白质沉淀现象。
五、实验结果与分析1. 盐析实验：随着硫酸铵浓度的升高，蛋白质沉淀现象逐渐明显。
当硫酸铵浓度达到0.8 mol/L时，蛋白质基本完全沉淀。
2. 等电点沉淀实验：当鸡蛋清溶液的pH值为4.7时，蛋白质沉淀现象最为明显。
3. 重金属盐沉淀实验：随着硝酸银浓度的升高，蛋白质沉淀现象逐渐明显。
当硝酸银浓度达到0.1 mol/L时，蛋白质基本完全沉淀。
4. 酶促反应实验：随着氢氧化钠浓度的升高，蛋白质沉淀现象逐渐明显。
当氢氧化钠浓度达到0.5 mol/L时，蛋白质基本完全沉淀。
六、实验结论1. 盐析是蛋白质沉淀的有效方法，随着盐浓度的升高，蛋白质沉淀效果逐渐增强。
蛋白质的等电点测定与沉淀实验
实验项目一、蛋白质的等电点测定及沉淀反应姓名：指导教师：实验室：组员：成绩：第三部分：实验记录与分析实验现象记录及分析：（一）蛋白质等电点测定（二）蛋白质的盐析1．蛋白质的盐析2．重金属离子沉淀蛋白质3．有机酸沉淀蛋白质4．有机溶剂沉淀蛋白质5．乙醇引起的变性与沉淀第四部分：课后研讨题1.通过本次合作实验后，有否对该项目改进的合理建议。
适当增加对照组和空白组，使实验数据更加科学可信。
2.鸡蛋清为何可做铅、汞中毒的解素剂铅、汞是重金属离子，与蛋白质结合能使蛋白质分子内部结构发生重大改变，发生变性而沉淀，不再溶于原来的溶剂中。
3.氯化汞为何能做为杀菌剂细菌由蛋白质构成，氧化汞是重金属盐，与蛋白质结合能使蛋白质分子内部结构发生重大改变，发生变性而沉淀，不再溶于原来的溶剂中。
4.在等电点时，蛋白质溶液为什么容易发生沉淀蛋白质颗粒上正负电荷的数目相等，在水溶液中的蛋白质分子由于表面生产水化层和双电层而成为稳定的亲水胶体颗粒，在一定的理化因素影响下，蛋白质颗粒可因失去电荷和脱水而沉淀。
5.将本实验中所涉及到的几种蛋白质沉淀方法各举一应用实例加以说明。
（1）盐析：硫酸铵的浓溶液能析出蛋白质。
（2）乙醇引起的变性与沉淀：低温下用乙醇或丙酮短时间作用于蛋白质，用于提纯蛋白质。
（3）重金属离子沉淀蛋白质：取一支离心管，加入2ml的蛋白质溶液，再加入3%硝酸银溶液1-2滴，振荡试管，观察现象。
（4）某些有机酸沉淀蛋白质：取一支离心管，加入2ml蛋白质溶液，再加入1ml 5%三氯乙酸溶液，振荡试管，观察现象。
（5）有机溶剂沉淀蛋白质：取一支离心管，加入2ml蛋白质溶液，再加入2ml 95%乙醇，观察现象。
教师评阅：签名。
蛋白质的等电点测定与沉淀实验
实验项目一、蛋白质的等电点测定及沉淀反应姓名：指导教师：实验室：组员：成绩：第三部分：实验记录与分析实验现象记录及分析：（一）蛋白质等电点测定（二）蛋白质的盐析1．蛋白质的盐析2．重金属离子沉淀蛋白质3．有机酸沉淀蛋白质4．有机溶剂沉淀蛋白质5．乙醇引起的变性与沉淀第四部分：课后研讨题1.通过本次合作实验后，有否对该项目改进的合理建议。
适当增加对照组和空白组，使实验数据更加科学可信。
2.鸡蛋清为何可做铅、汞中毒的解素剂？铅、汞是重金属离子，与蛋白质结合能使蛋白质分子内部结构发生重大改变，发生变性而沉淀，不再溶于原来的溶剂中。
3.氯化汞为何能做为杀菌剂？细菌由蛋白质构成，氧化汞是重金属盐，与蛋白质结合能使蛋白质分子内部结构发生重大改变，发生变性而沉淀，不再溶于原来的溶剂中。
4.在等电点时，蛋白质溶液为什么容易发生沉淀？蛋白质颗粒上正负电荷的数目相等，在水溶液中的蛋白质分子由于表面生产水化层和双电层而成为稳定的亲水胶体颗粒，在一定的理化因素影响下，蛋白质颗粒可因失去电荷和脱水而沉淀。
5.将本实验中所涉及到的几种蛋白质沉淀方法各举一应用实例加以说明。
（1）盐析：硫酸铵的浓溶液能析出蛋白质。
（2）乙醇引起的变性与沉淀：低温下用乙醇或丙酮短时间作用于蛋白质，用于提纯蛋白质。
（3）重金属离子沉淀蛋白质：取一支离心管，加入2ml的蛋白质溶液，再加入3%硝酸银溶液1-2滴，振荡试管，观察现象。
（4）某些有机酸沉淀蛋白质：取一支离心管，加入2ml蛋白质溶液，再加入1ml 5%三氯乙酸溶液，振荡试管，观察现象。
（5）有机溶剂沉淀蛋白质：取一支离心管，加入2ml蛋白质溶液，再加入2ml 95%乙醇，观察现象。
教师评阅：签名（注：专业文档是经验性极强的领域，无法思考和涵盖全面，素材和资料部分来自网络，供参考。
可复制、编制，期待你的好评与关注）。
蛋白质的等电点测定与沉淀反应
❖ 加5%卵清蛋白溶液5 ml于试管中，再加等量的饱和硫酸 铵溶液，混匀后静置数分钟则析出球蛋白的沉淀。倒出少 量混浊沉淀，加少量水，观察是否溶解，为什么？将管中 内容物过滤，向滤液中添加硫酸铵粉末到不再溶解为止， 此时析出的沉淀为清蛋白。
－
－
1
2 8.7 －0.3 －1来自3 8.0 －1.0 －
1
4 7.4 －
－ 1.6 1
最浑浊的一管的p可H编辑为ppt 酪蛋白的等电点。 7
六.等电点测定实验结果
几号管最混浊,溶液pH为?由于等电点 时蛋白质溶解度最小,所以酪蛋白的等电点 为?
可编辑ppt
8
Ⅱ．蛋白质的沉淀反应
一、目的： 1．加深对蛋白质胶体溶液稳定因素的认识。 2．了解沉淀蛋白质的几种方法及其实用意义。 3．了解蛋白质变性与沉淀的关系。
❖ 3．某些有机酸沉淀蛋白质 取1支试管，加入蛋 白质溶液2 ml，再加1 ml 5%三氯乙酸溶液，振荡
试管，观察沉淀的生成。放置片刻，倾出上清液， 向沉淀中加入少量水，观察沉淀是否溶解。
❖ 4．有机溶剂沉淀蛋白质 取1支试管，加入2 ml蛋
白质溶液，再加入2 ml 95%乙醇。混匀，观察沉
淀的生成。
❖ 取出部分清蛋白，加少量可蒸编馏辑p水pt ，观察沉淀的再溶解。 12
❖ 2．重金属离子沉淀蛋白质 重金属离子与蛋白质 结合成不溶于水的复合物。
❖ 取1支试管，加入蛋白质溶液2 ml，再加3%硝酸 银溶液1~2滴，振荡试管，有沉淀产生。放置片
刻，倾去上清液，向沉淀中加入少量的水，沉淀 是否溶解？为什么？
+ OH+ H+
实验一、蛋白质的等电点测定和沉淀反应
➢ 可逆的沉淀反应
蛋白质分子的结构尚未发生显著变化，除去引起沉 淀的因素后，蛋白质的沉淀仍能溶解于原来的溶剂 中，并保持其天然性质而不变性。
如：盐析作用、低温下用乙醇（丙酮）短时间作用 于蛋白质。
提纯蛋白质时，常利用此类反应。
问题：提纯蛋白质时常用的沉淀方法有哪些?
第六页，共27页。
➢ 不可逆沉淀反应
Байду номын сангаас
mL 清蛋白 氢氧化 盐酸 缓冲液 醇
管号
钠
11
1
1
21
1
1
31
1
1
第十九页，共27页。
振摇混匀后，观察各管有何变化。
放置片刻，向各管内加水8 mL。在2、3号管
中各加一滴甲基红，分别用0.1 M醋酸溶液及
0.05 M碳酸钠溶液中和。观察颜色的变化和 沉淀的生成。
每管再加0.1 M盐酸溶液数滴，观察沉淀的再 溶解。
离心倾去上清液，向沉淀中加入少量水，观察沉
淀是否溶解。
第十七页，共27页。
4．有机溶剂沉淀蛋白质
取1支试管，加入2 mL蛋白质溶液，再加 入2 mL 95%乙醇。混匀，观察沉淀的生成。
第十八页，共27页。
5．乙醇引起的变性与沉淀 取3支试管，编号，依下表顺序加入试剂：
试剂 5%卵 0.1 M 0.1 M pH4.7 95%乙
大组总结交流（PPT）：
➢ 内容：实验结果与分析，课后研讨题，实验体会等。
第二十一页，共27页。
实验结果
（一）酪蛋白等电点的测定
管号 pH值 混浊度 1 2 3 4
解释现象
第二十二页，共27页。
（二）蛋白质沉淀实验
1．蛋白质的盐析
蛋白质等电点和沉淀反应实验的自我评价
蛋白质等电点和沉淀反应实验的自我评价下载提示：该文档是本店铺精心编制而成的，希望大家下载后，能够帮助大家解决实际问题。
文档下载后可定制修改，请根据实际需要进行调整和使用，谢谢！本店铺为大家提供各种类型的实用资料，如教育随笔、日记赏析、句子摘抄、古诗大全、经典美文、话题作文、工作总结、词语解析、文案摘录、其他资料等等，想了解不同资料格式和写法，敬请关注！Download tips: This document is carefully compiled by this editor. I hope that after you download it, it can help you solve practical problems. The document can be customized and modified after downloading, please adjust and use it according to actual needs, thank you! In addition, this shop provides you with various types of practical materials, such as educational essays, diary appreciation, sentence excerpts, ancient poems, classic articles, topic composition, work summary, word parsing, copy excerpts, other materials and so on, want to know different data formats and writing methods, please pay attention!蛋白质等电点和沉淀反应实验的自我评价1. 引言在本次实验中，我们通过测定蛋白质的等电点和观察其与金属离子的沉淀反应，探索了蛋白质在不同条件下的电荷特性及其与金属离子的相互作用。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
实验3蛋白质的等电点测定和沉淀反应实验3 蛋白质的等电点测定和沉淀反应
华南师范大学杨兴举
一、目的
1、了解蛋白质的两性解离性质。
2、学习测定蛋白质等电点的一种方法。
3、加深对蛋白质胶体溶液稳定因素的认识。
1、了解沉淀蛋白质的几种方法及其实用意义。
二、原理
蛋白质是两性电解质。
在蛋白质溶液中存在下列平衡：
蛋白质分子的解离状态和解离程度受溶液的酸碱度影响。
当溶液的PH达到一定数值
时，蛋白质颗粒上正负电荷的数目相等，在电场中，蛋白质既不向阴极移动，也不向阳极移
动，此时溶液的pH值称为此种蛋白质的等电点。
不同蛋白质各有特异的等电点。
在等电点
时，蛋白质的理化性质都有变化，可利用此种性质的变化测定各种蛋白质的等电点。
最常用
的方法是测其溶解度最低时的溶液pH值。
本实验通过观察不同pH溶液中的溶解度以测定酪蛋白的等电点。
用醋酸与醋酸钠（醋
酸钠混合在酪蛋白溶液中）配制各种不同pH值的缓冲液。
向诸缓冲溶液中加入酪蛋白后，沉淀出现最多的缓冲液的pH值即为酪蛋白的等电点。
在水溶液中的蛋白质分子由于表面生成水化层和双电层而成为稳定的亲水胶体颗粒，
在一定的理化因素影响下，蛋白质颗粒可因失去电荷和脱水而沉淀。
蛋白质的沉淀反应可分为两类。
（1）可逆的沉淀反应此时蛋白质分子的结构尚未发生显著变化，除去引起沉淀的
因素后，蛋白质的沉淀仍能溶解于原来溶剂中，并保持其天然性质而不变性。
如大多数蛋白
质的盐析作用或在低温下用乙醇（或丙酮）短时间作用于蛋白质。
提纯蛋白质时，常利用此
类反应。
（2）不可逆沉淀反应此时蛋白质分子内部结构发生重大改变，蛋白质常变性而沉淀，
不再溶于原来溶剂中。
加热引起的蛋白质沉淀与凝固。
蛋白质与重金属离子或某些有机酸的
反应都属于此类。
蛋白质变性后，有时由于维持溶液稳定的条件仍然存在（如电荷），并不析出。
因此
变性蛋白质并不一定都表现为沉淀，而沉淀的蛋白质也未必都已变性。
三、材料、试剂与器具
（一）材料
新鲜鸡蛋
（二）试剂
1、0.4%酪蛋白醋酸钠溶液 200ml
取0.4g酪蛋白，加少量水在乳钵中仔细地研磨，将所得的蛋白质悬胶液移入200mL
锥形瓶内，用少量40—50?的温水洗涤乳钵，将洗涤液也移入锥形瓶内。
加入10mL 1mol/L
醋酸钠溶液。
把锥形瓶放到50?水浴中，并小心地旋转锥形瓶，直到酪蛋白完全溶解为止。
将锥形瓶内的溶液全部移到100mL容量瓶内，加水至刻度，塞紧玻塞，混匀。
2、1.00mol/L 醋酸溶液 100mL
3、0.10 mol/L醋酸溶液 300mL
4、0.01 mol/L醋酸溶液 50mL
5、蛋白质溶液 500mL
5%卵清蛋白溶液或鸡蛋清的水溶液（新鲜鸡蛋清：水=1:9） 6、pH4.7醋酸—醋酸钠的缓冲溶液 100mL
7、3%硝酸银溶液 10mL
8、5%三氯乙酸溶液 50mL
9、95%乙醇 250mL
10、饱和硫酸铵溶液 250mL
11、硫酸铵结晶粉末 10000mL
12、0.1mol/L盐酸溶液 300mL
13、0.1mol/L氢氧化钠溶液 300mL
14、0.05mol/L碳酸钠溶液 300mL
15、甲基红溶液 20mL
（三）器具
1、水浴锅
2、温度计
3、200mL锥形瓶
4、100mL容量瓶
5、吸管
6、试管及试管架
7、乳钵
四、操作步骤
（一）酪蛋白等电点的测定
（1）取同样规格的试管4支，按下表顺序分别精确地加入各试剂，然后混匀。
蒸馏0.01 mol/L蜡0. 1 mol/L蜡1. 0mol/L试管号水（mL) 酸（mL）酸(mL) 蜡酸(mL)
1 8.4 0.6 - —
2 8.7 - 0.
3 —
3 8.0 - 1.0 —
4 7.4 - - 1.6
（2）向以上试管中各加酪蛋白的醋酸钠溶液1mL，加一管，摇匀一管。
此时1、2、3、4管的pH依次为5.9、5.5、4.7、3.5。
观察其混浊度。
静置10分钟后，再观察其混浊度。
最混浊的一管pH即为酪蛋白的等电点。
（二）蛋白质的沉淀及变性
1、蛋白质的盐析无机盐（硫酸铵、硫酸钠、氯化钠等）的浓溶液能析出蛋白质。
盐
的浓度不同，析出的蛋白质也不同。
如球蛋白可在半饱和硫酸铵溶液中析出，而清蛋白则在饱和硫酸铵溶液中才能析出。
由盐析获得的蛋白质沉淀，当降低其盐类浓度时，又能再溶解，故蛋白质的盐析作用
是可逆过程。
加蛋白质溶液5mL于试管中，再加等量的饱和硫酸铵溶液，混匀后静置数分钟则析出
球蛋白的沉淀。
倒出少量混浊沉淀，加少量水，观察是否溶解，为什么？将管内容物过滤，
向滤液中添加硫酸铵粉末到不再溶解为止。
此时析出沉淀为清蛋白。
取出部分清蛋白，加少量蒸馏水，观察沉淀的再溶解。
2、重金属离子沉淀蛋白质重金属离子与蛋白质结合成不溶于水的复合物。
取1支试管，加入蛋白质溶液2mL，再加3%硝酸银溶液1—2滴，振荡试管，有沉淀产生。
放置片刻，倾去上清液，向沉淀中加入少量的水，沉淀是否溶解？为什么？
3、某些有机酸沉淀蛋白质取1支试管，加入蛋白质溶液2mL，再加入1ml5%三氯乙酸溶液，振荡试管，观察沉淀的生成。
放置片刻倾出清液，向沉淀中加入少量水，观察沉
淀是否溶解。
4、有机溶剂沉淀蛋白质取1支试管，加入2mL蛋白质溶液，再加入2mL95%乙醇。
观察沉淀的生成（如果沉淀不明显，加点NaCl，混匀。
5、乙醇引起的变性与沉淀取3支试管，编号。
依下表顺序加入试剂：
试剂
蛋白（mL） 0.1mol/L0.1mol/95%乙PH4.7质
氢氧化钠溶液 L盐酸溶液醇缓冲溶液
溶液
管号
1 1 —— 1 1
2 1 1 — 1 —
3 1 — 1 1 —
振摇混匀后，观察各管有何变化。
放置片刻向各管内加入水8毫升，然后在第2，3号管中各加一滴甲基红，再分别用0.1mol/L 醋酸溶液及0.05mol/L碳酸钠溶液中和之。
观察各管颜色的变化和沉淀的生成。
每管再加0.1mol/L盐酸溶液数滴，观察沉淀的再溶解。
解
释各管发生的全部现象。
五、注意事项
等电点测定的实验要求各种试剂的浓度和加入量必须相当准确。
六、实验报告
以表格形式总结实验结果，包括观察到的现象，分析评价实验结果。
七、思考题
1、什么是蛋白质的等电点？
2、在等电点时，蛋白质溶液为什么容易发生沉淀？
实验结果记录
(一)酪蛋白的等电点的测定
1、实验观察
加入甲基红后的颜色（从左到右编号为4，3，2，1）
沉淀结果（从左到右编号为4，3，2，1）
2、结果记录
0.01 0. 1 1. 沉淀加入蒸馏mol/L蜡酸mol/L蜡酸0mol/L蜡酸试管号量甲基红水（mL) （mL） (mL) (mL)
1 8.4 0.6 - —最少红色
橙红2 8.7 - 0.3 —多
色
橙黄3 8.0 - 1.0 —最多
色
4 7.4 - - 1.6 少黄色
（二）蛋白质的沉淀及变性
1、蛋白质的盐析。
结果：沉淀后加入少许蒸馏水，沉淀又溶解。
结论：蛋白没有变性。
2、重金属离子沉淀蛋白质。
结果：沉淀后加入少许蒸馏水，沉淀不溶解。
结论：重金属离子使蛋白质变性。
3、某些有机酸沉淀蛋白质
结果：沉淀后加入少许蒸馏水，沉淀不溶解。
结论：某些有机酸使蛋白质变性。
4、有机溶剂沉淀蛋白质
结果：加入95%的乙醇后少许沉淀，当加入氯化钠后有大量的沉淀产生。
结论：氯化钠电
离，改变了溶液中的离子的浓度，促使蛋白质沉淀
5、乙醇引起的变性与沉淀。
1、结果观察
加入甲基红后的结果（从左起的2、3、4）
2、结果记录
试中加
蛋和沉淀剂（mL）入盐酸加白质量 0.1mol/L0.1mol/L95%PH4.7入
氢氧化钠溶液盐酸溶液乙醇缓冲溶液溶甲管号基液
红
有溶白
沉淀解色
沉溶橙1 1 —— 1 1
黄淀增多解 2 1 1 — 1 —色沉 3 1 — 1 1 —橙淀增多溶红解色解释现象：
从实验中说明不同颜色，不同的PH产生的沉淀不同。