实验三盐析沉淀

实验三

（一）盐析沉淀

【实验原理】

在蛋白质溶液中加入适量的无机盐（硫酸铵、硫酸钠、氯化钠）浓溶液会使蛋白质析出，这种作用称为蛋白质的盐析作用。当盐浓度不同，析出的蛋白质也不同。如球蛋白可在半饱和硫酸铵溶液中析出，而清蛋白则在饱和硫酸铵溶液中才能析出。降低盐溶液浓度后，由盐析作用获得的蛋白质沉淀能再溶解，因此蛋白质的盐析作用是可逆过程。

盐析法分离蛋白质广泛应用于蛋白质制品的制备和个别蛋白质的分离、纯化。

【实验材料】

1.蛋白质溶液：5%卵清蛋白溶液或鸡蛋清水溶液（新鲜鸡蛋清：水=1：9）；

2.饱和硫酸铵溶液；

3.固体硫酸铵

【实验方法】

1.取锥形瓶一个，加入蛋白质溶液5.0ml，再加等量的饱和硫酸铵（半饱和硫酸铵)溶液，混匀后静置数分钟，则析出球蛋白。将混合液转移至两离心管（等量）中，2000rpm离心5min，小心将上清夜转移至小烧杯；向沉淀中加少蒸馏水，观察是否溶解，为什么？

2.向小烧杯中上清液添加硫酸铵粉末，边加边摇，直至不再溶解为止，此时析出的沉淀为清蛋白。转移至两离心管（等量）中，2000rpm离心5min，弃上清，向清蛋白沉淀中加少量蒸馏水，观察沉淀的再溶解。

蛋白质溶液 5.0ml

饱和硫酸铵 5.0ml

放锥形瓶中，混匀，

静置数分钟

至两离心管中（等量）

2000rpm离心5min

取上清液至小烧杯球蛋白沉淀

添加硫酸铵粉末，加少量H2O

边加边摇？再溶解

至两离心管中（等量）

2000rpm离心5min

弃上清清蛋白沉淀

加少量H2O

？再溶解

思考：1.盐析后球蛋白沉淀加水再溶解后，加热，再加水，是否溶解？

2.清蛋白沉淀加水后再溶解，用何方法可再沉淀而不变性？

（二）茚三酮反应

【实验原理】

除了脯氨酸、羟脯氨酸和茚三酮反应生成黄色物质外，所有α-氨基酸和蛋白质都合茚三酮反应生成蓝紫色物质。具有氨基或能释放氨的化合物都有此反应，但尿素、马尿二酮吡嗪和肽键上的亚氨基不呈现此反应。因此，蛋白质和氨基酸的茚三酮反应不是特异性反应，在定性定量测定中，应严防干扰物存在。该反应十分灵敏，1：150 000浓度的氨基酸水溶液即能出现反应，是一种常用的氨基酸定量测定方法。

【实验材料】

1.蛋白质溶液：5%卵清蛋白溶液或鸡蛋清水溶液（新鲜鸡蛋清：水=1：9）；

2.0.5%甘氨酸溶液；

3.0.1%茚三酮水溶液：

4.0.1%茚三酮乙醇溶液

【实验方法】

1. 取2支试管分别加入蛋白质溶液和甘氨酸溶液1ml，再加入0.5ml0.1%茚三酮水溶液，充分混匀后，在沸水浴中加热1~2min。观察颜色由粉红色变为紫红色再变为蓝色。

2.取小块滤纸，加一滴0.5%甘氨酸溶液，用电吹风吹干后在原处加一滴0.1%茚三酮乙醇溶液，再用电吹风烘干显色，观察紫红色斑点的出现。

试剂 1号试管 2号试管蛋白质溶液 1ml -

0.5%甘氨酸溶液； - 1ml

0.1%茚三酮水溶液 0.5ml 0.5ml

混匀后，沸水浴中加入1~2min。

观察结果：粉红色→紫红色→蓝色