细胞培养污染及排除共40页文档
细胞培养污染拯救及预防方法
细胞培养污染拯救及预防方法概论污染是细胞培养的大敌。
预防和避免污染是细胞培养成功的关键之一。
一开始就要十分重视，防止污染，否则会前功尽弃，不仅浪费时间，而且浪费人力、物力，甚至造成无法弥补的损失。
(一)污染的类型细胞培养过程中的污染不仅仅指微生物，而且还包括所有混入培养环境中的、对细胞生存有害或造成细胞不纯的物质，包括生物和化学物质。
1、细菌污染细菌污染是实验室细胞培养中常见的污染，即使在细胞培养液中加入了抗菌素，也可能因为操作不慎而引起污染。
最常见的有革兰氏阳性菌，如枯草杆菌以及大肠杆菌、假单胞菌等革兰氏阴性菌，其中又以白色葡萄球菌较常见。
培养细胞受细菌污染后，会出现培养液变混浊，pH改变。
污染后细胞发生病理改变，胞内颗粒增多、增粗，最后变圆脱落死亡。
2、真菌污染真菌污染是细胞培养过程中最常见的一种，最常见的真菌有烟曲霉、黑曲菌、孔子霉、毛霉菌、白色念珠菌和酵母菌。
培养细胞受真菌污染后，可见培养液中漂浮着白色或浅黄色的小点，有的散在生长，培养液一般不发生混浊;倒置显微镜下可见丝状、管状或树枝状的菌丝纵横交错在细胞之间或培养基中，有的呈链状排列。
真菌污染后，细胞生长变慢，但最后由于营养耗尽及毒性作用而使细胞脱落死亡。
丝状菌污染3、支原体污染支原体是介于细菌与病毒之间能独立生活的最小微生物，最小直径0.2μm，一般过滤除菌无法去除它，光镜下难以看清它的形态结构。
开始不易发现，能在偏碱条件下生存，对青霉素有抗药性。
多吸附于细胞表面或散在于细胞之间。
培养细胞受支原体污染后，部分敏感细胞可见细胞生长增殖变慢，部分细胞变圆，从瓶壁脱落。
但多数细胞污染后无明显变化，或略有变化，若不及时处理，还会产生交叉污染。
阳性阴性支原体污染4、病毒污染组织细胞培养过程中，如果没有除去潜在的病毒，就会产生病毒污染。
目前，从原代猴肾细胞的培养中已发现不少于20种血清性病毒。
尽管病毒污染的细胞不影响原代培养，但生产疫苗是不安全的。
细胞污染原因和处理
细胞污染原因和处理养成良好的无菌操作的习惯拿70％酒精擦手，擦超净台，擦培养瓶，擦培养基瓶，各种瓶子的口多拿火焰烧灼。
就不再会发生细菌污染。
决定要进行细胞培养，首先一定要有强烈的无菌意识！操作中要求自己遵守严格的操作规程，不要怕麻烦，越细心越好，越“罗嗦”越好！我辨认出在抽取须要非政府时，往往头会距离非政府很将近，所以拎口罩很关键！还要换无菌衣（紫外Ramanathapuram的白大褂）另外，每次开始实验前，先用紫外照无菌台和实验室20分，用酒精擦手，台面，不消毒的器械（如移液枪，冰块等）；实验中，如允许，尽量多过火，开起或盖盖都靠近火焰或在无菌台深处进行；使用无菌台后，再用酒精擦全台面，紫外照20分！除了，努力做到绝对无菌，那不可能将！但我们可以努力做到最大限度的增加含菌量！采用回去的东西尽快抽走无菌台！另外无菌台上的器械，试剂放置，也尽量遵从一定的顺序！依污染可能将程度依次向外挂。
1.滴管不要接触瓶口，吸取废液及加入新鲜培养基时都要注意不要滴在瓶口上等等。
2.凡是碰触瓶口后都必须用酒精灯烧烧。
3.初学者一般可以用培养瓶养细胞，个人认为瓶污染的机率要比皿小。
4.特别注意酿制全然培养基时不要出现污染，在采用前一定必须搞无菌培育，因为通常应用领域污染后的培养基培育细胞后，很快就可以出现特别轻微的污染。
2.1.注意喷酒精装置的应用：制作很简单，用过的化妆品，理发店理发前往头发上喷水的瓶子及其他一些有喷水功能的瓶子，经过处理装上百分之75的酒精就可以了（我不知道有没有实验专用喷洒酒精的瓶子，如果有那就更好了）。
我用的是师姐留下来的一种护肤品的瓶子。
常常往超净台台面，手上喷洒酒精，效果很好。
2。
我步入细胞培养室就穿上pe手套（一次性塑料薄膜手套），当在无尘室台操作方式时穿上一次性橡胶手套。
3。
培养箱内水盘里的水，用灭菌的超净水，每周更换一次（至少也要两周换一次）。
换水前要用百分之75酒精消毒。
水浴箱也要定期消毒（用百分之75酒精）换双蒸水。
细胞培养的污染及控制
细胞的冻存
概述：超低温保存（-196°C） 低温保存（-80°C或-105°C） 保护剂 慢速
目前，细胞冻存最常用的技术是液氮冷冻保存法，
主要采用加适量保护剂的缓慢冷冻法冻存细胞。细 胞在不加任何保护剂的情况下直接冷冻，细胞内外 的水分会很快形成冰晶，从而引起一系列不良反应。 如果细胞内冰晶形成较多，随冷冻温度的降低，冰 晶体积膨胀造成细胞核DNA空间构型发生不可逆的 损伤，而致细胞死亡。因此，细胞冷冻技术的关键 是尽可能地减少细胞内水分，减少细胞内冰晶的形 成。采用甘油或二甲基亚砜作保护剂，这两种物质 分子量小，溶解度大，易穿透细胞，可以使冰点下 降，提高细胞膜对水的通透性，且对细胞无明显毒 性。慢速冷冻方法又可使细胞内的水分渗出细胞外， 减少胞内形成冰结晶的机会，从而减少冰晶对细胞 的损伤。
预防：最有效，严密消毒、谨慎操 作。
第八章 细胞的冷冻保存复苏技 术
细胞的传代是有限制的，长期连续 传代的细胞，不仅消耗大量的人力和物 力，而且细胞的生长与形态等会有一定 退变或转化，因而细胞失去原有的遗传 特性，有时还会由于细胞污染而造成传 代中断，种子丢失。因此，在实际工作 中常需冻存一定数量的细胞，以备替换 使用。细胞冷冻与复苏是细胞培养室的 常规工作和通用技术。
冻存方法 观察细胞，洗涤细胞，计数并调整数 量。 滴加冻存保护剂，慢速。 逐步降温，慢速。
细胞的复苏 快速、无菌。 稀释冻存液，洗涤细胞。 观察细胞，及时换液。
细胞的运输 冷冻储存运输 充液法运输
第九章 培 养 细 胞 的 观 察 与检测方法
常规检查和观察方法
肉眼观察：颜色、透明度。 显微镜观察：细胞形态、折光度、 排列。 细胞生长状态：数量、形态。 无菌状态：培养基清晰度、细胞状 态。
细胞培养中常见的污染情况、可能原因、解决方法
细胞培养中常见的污染情况、可能原因、解决方法匡］细胞培养中常见的污染情况总结如下：常见的污染如下：1、细菌：细菌在普通倒置显微镜下为黑色细沙状，根据感染细菌的不同,可有不同的外形，培养液一般会浑浊变黄，对细胞生长影响明显。
仔细检查一下器皿的灭菌情况，是否在高压灭菌时放气时间足够，压力足够！尤其是和储存培养液接触的移液管等物品，连续两次污染的话有可能造成储存液污染，一定要注意！下次使用前检查一下培养液是否存在浑浊的现象！可在培养液中加相应的抗生素处理2、霉菌：培养液是清亮的，倒置显微镜下无杂质，37度孵箱培养2-3天，仍清亮，但出现絮状杂质，镜下可见呈细丝状的团状漂浮物, 可看到明显的菌丝，细胞仍可生长，但时间长之后，细胞的活力状态变差，用硫酸铜溶液擦拭CO2孵箱内，再把水盘里也加上饱和量的硫酸铜。
或者在培养箱的托盘加入饱和的消毒磷酸氢二钠高盐液体，可以防止霉菌污染。
C02孵箱被霉菌污染后，可把所有细胞暂时转移，采用过氧乙酸擦洗孵箱（包括隔板，箱壁）。
并把过氧乙酸放置在孵箱内一个小时，使其蒸汽弥漫。
待过氧乙酸的气味消散后，再移入细胞。
孵箱应定期清洁（2月左右），尤其在多雨的季节。
其它培养箱清洗方法是：用84液擦洗-清水擦洗-75%酉精擦洗-紫外灯照。
预防霉菌污染，可在培养基里加3u/ml的两性霉素或制霉菌素或放线菌素D或双抗；但细胞一旦污染，很难挽救，制霉菌素或放线菌素D或双抗都于事无补，建议舍弃该污染细胞。
，将环境彻底消毒，如果所有细胞都污染，可能是系统污染，检查一下培养基和器材，如果只是个别污染，可能是操作问题，就要注意操作3、支原体：黑色的，好象多为多形，培养液一般培养液一般会浑浊，原体感染，国内血清很多都没有做支原体阴性检测，而支原体是牛血清中最常见的微生物之一。
而且它不能用过用泰乐菌素，兽用支原体病的药，但可用于细胞培养，无任何不良反应。
Sigma公司的使用如果作为常用的滤的办法除去。
支原体感染细胞以后，细胞病变不很明显，只是慢慢死去。
CELL-污染与排除
3.操作过程中的预防 3.操作过程中的预防
不宜过早开瓶；开瓶后瓶口不能与风向相逆，保持斜立， ① 不宜过早开瓶；开瓶后瓶口不能与风向相逆，保持斜立， 不再使用的培养液应立即封闭瓶口, 不再使用的培养液应立即封闭瓶口,不允许触及器皿的 无菌部分（瓶口及瓶塞内侧）； 无菌部分（瓶口及瓶塞内侧）； ② 开启及关闭瓶口时注意火焰烧灼及火焰附近工作； 开启及关闭瓶口时注意火焰烧灼及火焰附近工作； 应专管专用； ③ 应专管专用； 培养的细胞勿过早暴露于空气中； ④ 培养的细胞勿过早暴露于空气中； 操作时不准交谈、咳嗽； ⑤ 操作时不准交谈、咳嗽； 操作完毕应整理好工作台面，并消毒擦拭工作面， ⑥ 操作完毕应整理好工作台面，并消毒擦拭工作面，关闭超 净工作台。 净工作台。
三.操作 器材和溶液使用前未仔细检查是否污染过 ； 吸管、刀、剪沾染微生物； 瓶口封不严； 培养两种以上细胞，使用同一吸管或营养液。 四.血清 被支原体和病毒污染。
五. 组织
手术中污染； 组织本身带菌； 用碘酒后擦拭不净造成碘污染。
第二节 污染对细胞的影缓慢、分裂相减少、粗糙、轮廓增强。 停止增殖，分裂相消失， 停止增殖，分裂相消失，胞质中出现大量堆 积物，变圆或崩溃从瓶壁脱落。 积物，变圆或崩溃从瓶壁脱落。 污染物不同，对细胞的影响不同。 污染物不同，对细胞的影响不同。
真菌污染
（二）细菌污染
培养液变黄，混浊； 以内很明显; 培养液变黄，混浊；48h以内很明显 细胞很快 以内很明显 崩解死亡。 崩解死亡。 镜下可见菌体。 镜下可见菌体。 污染后细胞发生病理改变， 胞内颗粒增多、 污染后细胞发生病理改变 ， 胞内颗粒增多 、 增 最后变圆脱落死亡， 粗 ， 最后变圆脱落死亡 ， 造成试验失败和细胞 株(系)丢失。 系 丢失。 丢失
常用的细胞培养方法、污染及污染处理
常用的细胞培养方法、污染及污染处理一、本文概述细胞培养是生物学和医学领域中一种重要的实验技术，广泛应用于基础研究和实际应用。
通过模拟细胞在体内生长的环境，细胞在体外得以繁殖、分化并维持其特定功能。
本文旨在概述常用的细胞培养方法，包括培养基的选择、细胞传代、细胞冻存与复苏等，同时探讨细胞培养过程中可能出现的污染问题，包括细菌、真菌和支原体等微生物污染，以及污染的检测和处理方法。
通过本文的阐述，读者可以对细胞培养的基本流程和污染防控有更为全面的了解，为实验操作提供指导和参考。
二、常用的细胞培养方法细胞培养是生物学和医学研究中的核心技术，用于模拟体内环境，研究细胞生长、分化和功能。
以下是几种常用的细胞培养方法：贴壁培养法：这是最常见的细胞培养方法。
细胞在培养瓶或培养板的表面上贴壁生长，形成单层细胞。
这种方法适用于大多数哺乳动物细胞系。
悬浮培养法：某些细胞，如血液细胞、肿瘤细胞和某些干细胞，可以在液体培养基中悬浮生长。
这种方法不需要细胞贴壁，可以方便地扩大细胞数量。
微载体培养法：微载体是一种微小的、可以悬浮在培养基中的颗粒，通常用于大规模细胞培养。
细胞可以在微载体的表面上贴壁生长，从而增加细胞与培养基的接触面积，提高细胞生长效率。
三维培养法：这种方法模拟体内组织的三维结构，使用支架或凝胶等基质支持细胞生长。
它有助于研究细胞间的相互作用和组织的形成。
共培养法：将不同类型的细胞放在同一个培养环境中进行培养，以模拟体内细胞间的相互作用。
例如，将内皮细胞和肿瘤细胞共培养，可以研究肿瘤血管生成的过程。
在进行细胞培养时，需要选择适合细胞类型和实验目的的培养方法，同时严格控制培养条件，包括温度、湿度、pH值、营养成分等，以确保细胞的正常生长和繁殖。
三、细胞培养污染及其影响在细胞培养过程中，污染是一个常见且严重的问题，可能对细胞生长、实验结果和细胞治疗产生负面影响。
污染主要来源于微生物，包括细菌、真菌、支原体和病毒等。
细胞培养中的支原体污染的预防及处理.doc
细胞培养中的支原体污染的预防及处理Mycoplasma国内主要有三种译名，医学文献译为“支原体”（分枝原体，枝原体，类菌质体），动物医学文献译为“霉形体”或“支原体”，台湾、香港则译为微浆菌。
支原体是目前已知一类能在无生命培养基上生长繁殖的最小的原核细胞型微生物。
自然界分布广泛，种类多，有80余种，分为两个属：一为支原体属（Mycoplasma），有几十个种；另一为脲原体属（Ureaplasma），仅有一种。
与人类感染有关的主要是肺炎支原体和解脲脲原体。
支原体无细胞壁，多呈不规则球状、长丝状，可分枝，营寄生共生或腐生。
一般侵害对象为动植物，可造成多种疾病。
细胞培养（特别是传代细胞）被支原体污染是个世界性问题。
国内外研究表明，95%以上是以下四种支原体：口腔支原体（M.orale）、精氨酸支原体（M.arginini）、猪鼻支原体（M.hyorhinis）和菜氏无胆甾原体（idlawii），为牛源性。
国外调查证明，大约有二十多种支原体能污染细胞，有的细胞株可以同时污染两种以上的支原体。
支原体污染的来源包括工作环境的污染、操作者本身的污染（某些支原体在人体是正常菌群）、培养基的污染、被污染细胞造成的交叉污染、实验器材的污染、制备细胞的原始组织或器官的污染，等等。
体外生长的细胞对微生物及一些有害有毒物质没有抵抗能力，因此培养基应达到无化学物质污染、无微生物污染（如细菌、真菌、支原体、病毒等）、无其他对细胞产生损伤作用的生物活性物质污染（如抗体、补体）。
对于天然培养基，污染主要来源于取材过程及生物材料本身，应当严格选材，严格操作。
对于合成培养基，污染主要来源于配制过程，配制所用的水，器皿应十分洁净，配制后应严格过滤除菌。
由于体外培养细胞自身没有抵抗污染的能力，而且培养基中的抗生素抗污染能力有限，因而培养细胞一旦发生污染多数将无法挽回。
支原体污染后，因为它们不会使细胞死亡可以与细胞长期共存，培养基一般不发生浑浊，细胞无明显变化，外观上给人以正常感觉，实则细胞手到多方面潜在影响，如引起细胞变形，影响DNA合成，抑制细胞生长等。
体外细胞培养的污染和控制
生物性污染的控制
1、建立规范的无菌操作程序及各种规章制 度，并严格执行；
2、控制环境污染，同时注意实验人员的防 护及无菌服的洁净和无菌；
3、保证细胞培养基和器材无菌； 4、在细胞培养基中加入适量的抗生素。
支原体污染
• 支原体（mycoplasma）是介于细菌与病毒之间能 独立生活的最小微生物，直径0.22μm左 右，无细 胞壁，对理化因素比较敏感。
• 受污染的细胞在显微镜下无特殊的外观表现，培 养液也不浑浊；部分敏感细胞生长增殖变慢，细 胞变圆，脱落。在细胞培养过 程中，如在显微镜 下发现破碎的细胞有许多，培养物需要频繁改善 营养环。
污染的定义
细胞培养污染是指培养环境中侵入 了对细胞生存有害的成分和造成细 胞变异的异物。体外细胞培养污染 可分为3 类：物理性、化学性及生 物性污染。
物理性污染
物理性污染通过影响细胞培养体系中的生 化成分，从而影响细胞的代谢。 培养环境中的物理因素，如温度、放射线、 振动、辐射（紫外线或荧光）会对细胞产 生影响。细胞、培养液或其他培养试剂暴 露在放射线、辐射或过冷过热的温度中， 可以引起细胞代谢发生改变，如细胞同步 化、细胞生长受抑制，甚至细胞死亡。
化学性污染
1、使用的所有物质都应是高纯度的, 同时 正确配制和储存培养液及试剂； 2、在配制液体和清洗容器时必须使用不含 杂质的超纯水。 3、选用同一批次的血清。 4、在选用器皿时，根据被培养细胞的生长 特性、培养方式和所用培养液的性质来选 用适合的器皿来达到实验的准确性和可靠 性。
生物性污染
常见的生物性污染： 一、细菌：G+菌较多。 二、真菌：霉菌较多。 三、支原体：不易检测。 四、病毒：由于病毒有种属特异性，所以病 毒污染的概率比较小。
消除细胞培养污染的实验步骤
推荐的确定毒性水平和消除培养污染的实验步骤
1)在无抗生素的培养基中消化、计数和稀释细胞，稀释到常规细胞传代的浓度。
2)分散细胞悬液到多孔培养板中，或几个小培养瓶中。
在一个浓度梯度范围内，把选择抗生素加入到每一个孔中。
例如，两性霉素B推荐下列浓度，0.25，0.50，1.0，2.0，4.0,8.0 mg/ml。
3)每天观测细胞毒性指标，如脱落，出现空泡，汇合度下降和变圆。
4)确定抗生素毒性水平后，使用低于毒性浓度2－3倍浓度的抗生素的培养液培养细胞2－3代。
5)在无抗生素的培养基中培养细胞一代。
6)重复步骤4。
7)在无抗生素的培养基中培养4－6代，确定污染。
细胞培养的污染及控制
污染控制污染的类型细胞培养过程中的污染不仅仅指微生物，而且还包括所有混入培养环境中的、对细胞生存有害或造成细胞不纯的物质，包括生物和化学物质。
一、细菌污染细菌污染是实验室细胞培养中常见的污染，即使在细胞培养液中加入了抗菌素(一般为预防剂量)，也可能因为操作不慎而引起污染。
最常见的有革兰氏阳性菌，如枯草杆菌以及大肠杆菌、假单胞菌等革兰氏阴性菌，其中又以白色葡萄球菌较常见。
培养细胞受细菌污染后，会出现培养液变混浊，pH改变。
也有的培养液肉眼观察无多少改变，只能在镜下发现菌体才知污染。
所以，每天应仔细观察。
污染后细胞发生病理改变，胞内颗粒增多、增粗，最后变圆脱落死亡，造成试验失败和细胞株(系)丢失。
二、真菌污染真菌污染是细胞培养过程中最常见的一种，尤其在霉雨季节进行细胞培养更易污染。
最常见的真菌有烟曲霉、黑曲菌、孔子霉、毛霉菌、白色念珠菌和酵母菌。
培养细胞受真菌污染后，可见培养液中漂浮着白色或浅黄色的小点，有的散在生长，培养液一般不发生混浊；倒置显微镜下可见丝状、管状或树枝状的菌丝纵横交错在细胞之间或培养基中，有的呈链状排列。
念珠菌和酵母菌呈卵圆形散在细胞周边和细胞之间。
个体细小，有增多趋势。
镜下看时，要将培养瓶用酒精棉球擦干净，以防止与瓶外尤其瓶底外面生长的菌丝相混淆。
真菌污染后，细胞生长变慢，但最后由于营养耗尽及毒性作用而使细胞脱落死亡。
三、支原体污染支原体是介于细菌与病毒之间能独立生活的最小微生物，最小直径0.2μm，一般过滤除菌无法去除它，光镜下难以看清它的形态结构。
开始不易发现，能在偏碱条件(pH7.6～8.0)下生存，对青霉素有抗药性。
多吸附于细胞表面或散在于细胞之间。
电镜下可见其有三层结构，无细胞壁，中央有电子密度大的密集颗粒或丝状的中心囊。
细胞培养（特别是传代细胞）被支原体污染是个世界性问题。
国内外研究表明，95％以上是以下四种支原体：口腔支原体（M.orale）、精氨酸支原体（M.arginini）、猪鼻支原体（M.hyorhinis）和莱氏无胆甾原体（idlawii）。
细胞培养污染的检测与预防
５、无菌室的彻底消毒
§1) 0.1%新洁尔灭全面彻底擦洗无菌室；
§2）甲醛熏蒸法：甲醛是一种广谱灭菌剂 菌，其水溶液和气休对各种细菌、芽孢及 真菌等微生物均有杀灭作用。
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读书破万卷，下笔如有神--杜甫
小鼠胃癌细胞的球菌感染
白色念珠菌污染：（
2、真菌污染
真菌污染后，细胞生长变慢，但最后由于 营养耗尽及毒性作用而使细胞脱落死亡。
3、支原体污染的检测
（1）相差显微镜观察 直接取少许培养液滴在载物片上，再盖上
盖片观察，支原体在镜下呈暗色微小颗粒， 多位于细胞与细胞之间，有时可见类似于 布朗运动的表现。
（2）荧光染色法观察
用荧光染料Hoechst33258，此染料能与DNA特异地结合， 可使支原体内的DNA着色，荧光显微镜下支原体呈绿色小 点，散在于细胞周围或附于细胞表面。
（3）电镜检测
若条件许可，可用扫描电镜或透射电镜观察。一 般在细胞培养48～72小时，细胞接近汇合前，用 胰酶消化细胞制成细胞悬液后进行固定、包埋、
二、支原体的清除
§１、用MRA处理
用支原体 清除剂（Mycoplasma Removal Agent）处理细胞，每4
天换一次液,连续处理15天以确保细胞纯洁健康． 2、用清洗纯化法清除支原体污染的方法
细胞营养驯化→优质细胞群的筛选→细胞清洗→反复离心洗涤 其原理是利用离心力、细胞、微生物质量和悬液的浮力差达到清除支 原体的目的。由于支原体个体小且除发酵支原体外多为细胞外寄生, 所以通过反复洗涤细胞和低速离心换液使其中潜在的支原体数量降低 至极限. 如结合敏感抗生素的抑杀作用，可达到更好的效果。 3、药物辅助加温处理 先用药物处理后，再将污染的组织培养物放在41℃培养18小时，可 杀死支原体，但对细胞有不良影响。 ４、使用支原体特异性血清 §用5%的兔支原体免疫血清可去除支原体污染，因特异抗体可抑制 支原体生长，故经抗血清处理后11天即转为阴性，并且5个月后仍为 阴性。
关于细胞培养中的污染
细胞培养中常见的污染情况总结如下:常见的污染如下：1、细菌：细菌在普通倒置显微镜下为黑色细沙状，根据感染细菌的不同，可有不同的外形，培养液一般会浑浊变黄，对细胞生长影响明显。
仔细检查一下器皿的灭菌情况，是否在高压灭菌时放气时间足够，压力足够！尤其是和储存培养液接触的移液管等物品，连续两次污染的话有可能造成储存液污染，一定要注意！下次使用前检查一下培养液是否存在浑浊的现象！可在培养液中加相应的抗生素处理2、霉菌：培养液是清亮的，倒置显微镜下无杂质，37度孵箱培养2-3天，仍清亮，但出现絮状杂质，镜下可见呈细丝状的团状漂浮物，可看到明显的菌丝，细胞仍可生长，但时间长之后，细胞的活力状态变差，用硫酸铜溶液擦拭CO2孵箱内，再把水盘里也加上饱和量的硫酸铜。
或者在培养箱的托盘加入饱和的消毒磷酸氢二钠高盐液体,可以防止霉菌污染。
CO2孵箱被霉菌污染后，可把所有细胞暂时转移，采用过氧乙酸擦洗孵箱（包括隔板，箱壁）。
并把过氧乙酸放置在孵箱内一个小时，使其蒸汽弥漫。
待过氧乙酸的气味消散后，再移入细胞。
孵箱应定期清洁（2月左右），尤其在多雨的季节。
其它培养箱清洗方法是：用84液擦洗－清水擦洗－75%酒精擦洗－紫外灯照。
预防霉菌污染，可在培养基里加3u/ml的两性霉素或制霉菌素或放线菌素D或双抗；但细胞一旦污染，很难挽救，制霉菌素或放线菌素D 或双抗都于事无补，建议舍弃该污染细胞。
，将环境彻底消毒，如果所有细胞都污染，可能是系统污染，检查一下培养基和器材，如果只是个别污染，可能是操作问题，就要注意操作3、支原体：黑色的，好象多为多形，培养液一般培养液一般会浑浊，原体感染，国内血清很多都没有做支原体阴性检测，而支原体是牛血清中最常见的微生物之一。
而且它不能用过滤的办法除去。
支原体感染细胞以后，细胞病变不很明显，只是慢慢死去。
用泰乐菌素，兽用支原体病的药，但可用于细胞培养，无任何不良反应。
Sigma公司的使用时用50ug/ml Tylosin培养液培养6天或连续传两代即可清除支原体污染。
细胞培养的污染
– 只有相关人员才可进入细胞培养区 – 细胞培养区必须和其他区域分开 – 每个细胞培养区应布局合理，保证所需物品就近放置，在处 理细胞时避免不必要的走动 – 细胞培养区应避免使用水池，从而避免微生物污染
三、污染的预防
预防是防止细胞培养过程中发生污染的最好办法。只有预防工作做在 前，才能将发生污染的可能性降到最小程度。 一般预防： 1、添加抗生素
控 制 污 染
• 良好的无菌操作
– 所有玻璃器皿和培养液与试剂的配制应严格无菌 – 避免溢出、溅出和气溶胶； – 吸入或吸出液体时避免倾倒； – 吸入或吸出液体时，不要触碰细胞培养瓶的瓶口； – 液体应分装并置4-8oC保存； – 每种细胞应使用单独的液体； – 清洁区和污染区的材料应单独处理；
控 制 污 染
细胞培养的外源 污染和 预防控制
一、概念
凡混入培养环境中对细胞生存有害的成分和造成细胞不 纯的异物都视为污染，细胞污染不能完全被消除，但 能减少其发生的频率和后果的严重性。细胞污染根据 污染源主要可以分为物理性，化学性和生物性污染。 。
二、细胞污染的分类
• 物理污染 • 化学污染 • 生物污染（支原体污染）
化学性污染的来源、危害及预防
培养环境中许多化学物质都可以引起细胞的污染。化学物质并不总是抑 制细胞的生长，某些化学物质如激素就可促进细胞的生长。不同细胞对化学
物质污染的反应是不一样的。未纯化的物质、试剂、水、血清、生长辅助因 子及储存试剂的容器都可能成为化学性污染的来源。细胞培养的必需养分， 如氨基酸，若浓度超过了合适的范围，也会对细胞产生毒性。玻璃制品清洗 过程中残留的变性剂或肥皂是最常见的化学性污染。水是唯一一种在凝固时 膨胀的化合物。因此在选择冻存细胞的容器时应考虑到这个因素。容器因水 的膨胀而发生破裂是引起试剂污染的重要原因。为了避免金属离子、有机分 子、细胞内毒素等物质对水的污染，在配制液体，清洗容器时必须使用不含 杂质的超纯水。需要注意的是，超纯水放置过久其纯度会下降。在高压蒸气 灭菌及蒸馏水时水经常被污染，因为高压蒸气锅及纯水机的常规维护后可能 有少量的化学物质残留。为了保证水的纯度，我们应采取措不易被察觉和干扰实验结果的一种污染。是 细胞培养研究中重点预防对象。 （1）支原体生物学性状：一种介于细菌和病毒之间的目前所知能独立生活的最小 微生物。可通过除菌滤器。 多形态性，光镜下难以看清其结构。 多吸附于细胞表面或散在细胞之间。 对青霉素普遍有抗药性。