炮制因素对甘草中有效成分甘草苷和甘草酸的影响

中药炮制实验研究设计炮制因素对甘草中有效成分甘草苷和甘草酸的影响院系药学院班级2012级中药学(专升本)一班姓名周雪学号2012129048河南中医学院二零一三年六月炮制因素对甘草中有效成分甘草苷和甘草酸的影响(河南中医学院，郑州，450046)摘要目的：探讨炮制因素对甘草中甘草苷和甘草酸含量的影响。

方法：筛选适当提取方法，采用HPLC-DAD技术，ZorbaxSB-C18 ODS反向色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，以0.1%(体积分数)甲酸溶液和甲醇为流动相，梯度洗脱，流速1.0 ml·min-1，柱温30℃，检测波长250 nm和276 nm。

测定了同一产地、同一批次的甘草和炙甘草中甘草苷和甘草酸的含量。

结果：甘草经蜜炙后甘草苷和甘草酸的含量增加(P<0.01)。

结论：炮制因素可显著增加甘草中甘草苷和甘草酸的含量。

关键词甘草甘草苷甘草酸炮制高效液相色谱甘草系豆科植物甘草(GlycyrrhizauraienxisFisch)的根及根状茎，俗称灵草、蜜甘、蜜草、国老、甜草等，性味甘平，能调和诸药，始载于《神农本草经》，被列为上品，是临床上最常用的中药之一。

甘草在中医临床应用中有甘草和炙甘草之分，其中甘草指生甘草,为原药材除去杂质，洗净、润透切片、生用入药者。

炙甘草又名炙草、蜜炙甘草，为生甘草片用蜂蜜拌匀，再炒至不粘手取出摊晾，然后入药者[1]。

炮制是根据中医药理论，依照辨证施治用药和药物自身性质以及调制、制剂的不同要求所采取的一项制药技术，是中医药学的一大特色[2]。

在古代方剂中甘草与炙甘草应用区别明显：甘草性甘偏凉，长于泻火解毒、化痰止咳；而甘草经蜜炙后味转甘温，以补脾和胃、益气复脉力胜。

现代药理学研究表明，炙甘草能抗多种心律失常；甘草和炙甘草的调节免疫作用存在明显的差异，蜜炙甘草的调节免疫作用显著强于甘草。

炙甘草应为临床补气用甘草的最佳炮制品，可调节机体的免疫功能[3]。

由此可见，甘草经炮制后理化性质发生变化，其性味功能也有所改变。

我们以甘草中最主要的2种有效成分甘草苷(liquiritin)和甘草酸(glycyrrhizic acid)为检测指标，采用HPLC-DAD法比较甘草炮制前后这2种成分含量的变化，从化学成分角度来探讨中药炮制的合理性、科学性。

1 仪器与试药1.1仪器Shimadzu LC-10A高效液相色谱仪(日本岛津)，包括SCL-10Avp System Controller、SPD-M20A DAD二极管阵列检测器、LC-10 ADvp泵、FCV-10ALvp四元低压梯度洗脱系统、LC-Solution色谱数据工作站;梅特勒托利多AE240电子天平(瑞士Mettler Toledo公司)；Millipore超纯水机；超声波清洗器(型号SK250LH,上海科导超声仪器有限公司)。

甲醇(色谱纯，美国J.T.Baker 公司)；水为超纯水；其余试剂皆为分析纯。

1.2 试药对照品甘草苷(批号：06121824)及甘草酸(批号：06110101)由上海同田生物科技有限公司提供。

甘草(批号：20071229；产地：甘肃)及炙甘草(批号：20071229；产地：甘肃)药材购自徐州医药股份有限公司中药饮片厂，经徐州医学院附属医院杜长俊副主任中药师鉴定为真品。

甘草和炙甘草为豆科植物甘草的干燥根及根茎的炮制加工品。

2实验方法与结果2.1 色谱条件色谱柱：Zorbax SB-C18反向色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流速1.0 ml·min-1，柱温30℃，检测波长分别为250 nm和276 nm。

进样量：20 μl，流动相：A为0.1%(体积分数)甲酸水溶液，B为甲醇，用前超声脱气30 min，洗脱程序见表1。

记录65 min色谱图。

理论塔板数按甘草苷和甘草酸峰计应不低于4000。

表1 梯度洗脱程序时间(min) 流速(m·lmin-1) A(%) B(%)0 1.030 1.050 1.065 1.02.2 对照品溶液的制备精密称取甘草苷对照品3.68 mg、甘草酸对照品2.46 mg，用70%甲醇水溶液溶解并定容于5 ml棕色容量瓶中，得甘草苷0.736 g·L-1及甘草酸0.492 g·L-1的0号混合对照品标准贮备溶液。

从中精密量取适量，用流动相配成甘草苷浓度为0.368、0.184、0.092、0.046、0.0184、0.0092 g·L-1及甘草酸浓度为0.246、0.123、0.0615、0.03075、0.0123、0.00615 g·L-1的1～6号混合对照品贮备液。

2.3 供试品溶液的制备精密称取甘草粉末及炙甘草粉末(过60目筛，烘干至恒重)各0.2 g，置具塞锥形瓶中，精密加入20 ml 70%甲醇，称定重量，室温放置1 h后超声处理(功率250 W，频率40 kHz)40 min，取出锥形瓶擦干后放冷到室温，再称重，用70%甲醇补足减失的重量，摇匀，上清液经0.45 μm 滤膜滤过，取续滤液供HPLC分析。

2.4 方法学考察2.4.1 线性关系考察精密吸取“2.2”项下已制备的各不同浓度的混合标准贮备液(0～6号)20 μl注入色谱仪，测定峰面积，以甘草苷或甘草酸浓度(g·L-1)为横坐标(X) ，峰面积为纵坐标(Y)，进行线性回归，得直线回归方程。

2.4.2 检测限和定量限取0号混合对照品标准贮备液，用0.1%甲酸水溶液-甲醇(70:30)依次稀释制成一系列由高到低的梯度浓度溶液并进样分析，测定峰面积约为噪声10倍(S/N=10)时的进样浓度为定量限(QOD)，测定峰面积约为噪声3倍(S/N=3)时的进样浓度为检测限(LOD)。

结果甘草苷和甘草酸的QOD分别为0.0069 mg·L-1和0.0077 mg·L-1，LOD分别为0.0023 mg·L-1和0.0031 mg·L-1。

2.4.3 精密度试验精密移取1号混合标准贮备液20μl，重复进样6次(2次进样之间间隔约30min)，测定峰面积，结果甘草苷平均峰面积相对标准偏差(RSD)=0.498%，甘草酸平均峰面积RSD=0.742%;精密移取1号混合标准贮备液20 μl，连续分析6天，每天进样1次，测定峰面积，结果甘草苷平均峰面积RSD=1.67%，甘草酸平均峰面积RSD=2.71%。

结果表明仪器精密度良好。

2.4.4 重现性试验取炙甘草样品6份，按“2.3”项下供试品溶液的制备方法处理，制成6份供试品溶液，按“2.1”项下方法测定，结果甘草苷平均含量为0.09683 g·L-1，RSD=1.83%；甘草酸平均含量为0.1358 g·L-1，RSD=2.36%。

结果表明此方法重现性良好。

2.4.5 稳定性试验取同一份炙甘草样品溶液。

在配制后0、2、4、6、8、12、24 h进样，测定峰面积，结果甘草苷平均峰面积RSD=0.827%，甘草酸平均峰面积RSD=0.964%。

结果表明24 h内样品溶液稳定。

2.4.6 回收率试验精密移取0.2 ml已知甘草苷及甘草酸含量的炙甘草样品溶液9份，每3份分别精密加入甘草苷浓度为0.1 g·L-1及甘草酸浓度为0.14 g·L-1的混合对照品溶液0.16、0.20、0.24 ml，按“2.1”项下方法同时测定甘草苷和甘草酸的含量。

2.5 不同样品中甘草苷和甘草酸含量测定取甘草和炙甘草样品各6份，按照“2.3”项下方法制备，按“2.1”项下方法测定。

统计分析：计量资料以±s表示，以t检验比较组间差异。

结果表明，甘草经蜜炙后甘草苷和甘草酸的含量均增加(P<0.01)。

3 讨论3.1 提取溶剂的选择我们比较了80%氨性甲醇提取后酸化定容、80%甲醇、70%乙醇(中国药典2005版测定甘草苷的提取溶剂)、70%甲醇对甘草苷和甘草酸的提取效率及色谱峰峰型的影响，其中70%甲醇效果相对略好，又考虑到流动相采用甲醇-0.1%甲酸水溶液，因此，采用70%甲醇冷浸超声提取。

3.2 检测波长的选择采用DAD检测器，在完成色谱数据采集后，可在不同的提取波长下进行定量分析。

参考中国药典2005版规定的甘草苷和甘草酸的检测波长，再结合甘草苷和甘草酸的DAD全波长扫描图谱，最终选择276 nm为甘草苷的检测波长，250 nm为甘草酸的检测波长。

3.3 流动相系统的选择甘草的成分复杂，为尽可能地使甘草成分达到较好的分离效果，我们对实验条件进行了一系列优化。

流动相方面，试验了乙腈-水[4]、甲醇-水、乙腈-甲醇-水等，发现当流动相中有乙腈时，出峰较晚的组分分离效果不佳，且乙腈试剂昂贵，毒性大，选用甲醇-水二元系统进行分离测定，可使待测组分和干扰组分较有效分离。

由于甘草酸为有机弱酸，且易解离，峰形拖尾，因此，考虑在流动相中加入一定量的酸作为抑制剂，之所以用甲酸而不用冰醋酸[1]、磷酸[4-5]、磷酸缓冲盐等，是考虑到后续可直接采用已建立的流动相条件进行液质联用分析及对色谱柱的保护。

总之，选择0.1%甲酸水溶液-甲醇作为流动相，简单、经济、有效。

3.4 固定相的选择预实验考察了大连依利特Hypersil ODS2、大连依利特Kromasil C18(250 mm)、大连依利特Kromasil C18(150 mm)、大连依利特Hypersil BDS C18、岛津Shim-Pack CLC-ODS、安捷伦Zorbax SB-C18 ODS等色谱柱，结果发现，Zorbax SB-C18 ODS色谱柱给出的甘草苷和甘草酸的峰形及分离度均较好。

3.5 柱温的选择在确定固定相和流动相的情况下，分别考察了25、30、35℃柱温，预实验结果表明30℃柱温下峰形及分离度较好。

3.6 炮制因素对甘草苷和甘草酸影响的分析为使测定结果更准确地反映炮制因素引起的化学成分变化，我们选用了正在上市销售的同一产地、同一批次的甘草和炙甘草药材。

检测结果表明，炮制因素可显著增加甘草中甘草苷和甘草酸的含量。

其原因可能是甘草苷和甘草酸热稳定性好，甘草经蜜炙后蜂蜜充分渗入甘草组织内部置换出部分水分，且蜂蜜覆盖于甘草表面能防止空气中氧及二氧化碳与甘草中有效成分发生化学反应，有效延长了甘草的贮藏时间。

由此可推断中医用药讲究炮制，目的是利用多种辅料的助溶作用或成分结构发生变化，提高有效成分的检出率，从而提高疗效，改变适应证。

参考文献[1] 崔淑芬，张信青，Frank SCL等. HPLC指纹图谱应用于炙甘草的炮制研究[J]. 中成药,2007, 29(11):1636～1639.[2] 王国喜, 门闯.浅谈中药炮制[J]. 河南中医, 2008, 28(12):89～89.[3] 王明喜, 石志强. 生甘草炙甘草临证应用考辨[J]. 实用中医内科杂志, 2005, 19(4):383.[4] 闫永红, 段天璇, 王文全, 等. 野生及栽培甘草HPLC指纹图谱[J]. 中国天然药物, 2006, 4(2): 116～120.[5] Xie J, Wang W, Zhang Y, et al. Simultaneous analysis of glycyrrhizin, paeoniflorin, quercetin, ferulic acid, liquiritin, formononetin, benzoic acid and isoliquiritigenin in the Chinese proprietary medicine Xiao Yao Wan by HPLC [J]. J Pharm Biomed Anal, 2007, 45(3): 450～455.。