炮制因素对甘草中有效成分甘草苷和甘草酸的影响

中药炮制实验研究设计

炮制因素对甘草中有效成分甘草苷和甘草酸的影响

院系药学院

班级2012级中药学(专升本)一班

姓名周雪

学号2012129048

河南中医学院

二零一三年六月

炮制因素对甘草中有效成分甘草苷和甘草酸的影响

(河南中医学院，郑州，450046)

摘要目的：探讨炮制因素对甘草中甘草苷和甘草酸含量的影响。方法：筛选适当提取方法，采用HPLC-DAD技术，ZorbaxSB-C18 ODS反向色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，以0.1%(体积分数)甲酸溶液和甲醇为流动相，梯度洗脱，流速1.0 ml·min-1，柱温30℃，检测波长250 nm和276 nm。测定了同一产地、同一批次的甘草和炙甘草中甘草苷和甘草酸的含量。结果：甘草经蜜炙后甘草苷和甘草酸的含量增加(P<0.01)。结论：炮制因素可显著增加甘草中甘草苷和甘草酸的含量。

关键词甘草甘草苷甘草酸炮制高效液相色谱

甘草系豆科植物甘草(GlycyrrhizauraienxisFisch)的根及根状茎，俗称灵草、蜜甘、蜜草、国老、甜草等，性味甘平，能调和诸药，始载于《神农本草经》，被列为上品，是临床上最常用的中药之一。甘草在中医临床应用中有甘草和炙甘草之分，其中甘草指生甘草,为原药材除去杂质，洗净、润透切片、生用入药者。炙甘草又名炙草、蜜炙甘草，为生甘草片用蜂蜜拌匀，再炒至不粘手取出摊晾，然后入药者[1]。

炮制是根据中医药理论，依照辨证施治用药和药物自身性质以及调制、制剂的不同要求所采取的一项制药技术，是中医药学的一大特色[2]。在古代方剂中甘草与炙甘草应用区别明显：甘草性甘偏凉，长于泻火解毒、化痰止咳；而甘草经蜜炙后味转甘温，以补脾和胃、益气复脉力胜。现代药理学研究表明，炙甘草能抗多种心律失常；甘草和炙甘草的调节免疫作用存在明显的差异，蜜炙甘草的调节免疫作用显著强于甘草。炙甘草应为临床补气用甘草的最佳炮制品，可调节机体的免疫功能[3]。由此可见，甘草经炮制后理化性质发生变化，其性味功能也有所改变。我们以甘草中最主要的2种有效成分甘草苷(liquiritin)和甘草酸(glycyrrhizic acid)为检测指标，采用HPLC-DAD法比较甘草炮制前后这2种成分含量的变化，从化学成分角度来探讨中药炮制的合理性、科学性。

1 仪器与试药

1.1仪器Shimadzu LC-10A高效液相色谱仪(日本岛津)，包括SCL-10Avp System Controller、SPD-M20A DAD二极管阵列检测器、LC-10 ADvp泵、FCV-10ALvp四元低压梯度洗脱系统、LC-Solution色谱数据工作站;梅特勒托利多AE240电子天平(瑞士Mettler Toledo公司)；Millipore超纯水机；超声波清洗器(型号SK250LH,上海科导超声仪器有限公司)。甲醇(色谱纯，美国J.T.Baker 公司)；水为超纯水；其余试剂皆为分析纯。

1.2 试药对照品甘草苷(批号：06121824)及甘草酸(批号：06110101)由上海同田生物科技有限公司提供。甘草(批号：20071229；产地：甘肃)及炙甘草(批号：20071229；产地：甘肃)药材购自徐州医药股份有限公司中药饮片厂，经徐州医学院附属医院杜长俊副主任中药师鉴定为真品。甘草和炙甘草为豆科植物甘草的干燥根及根茎的炮制加工品。

2实验方法与结果

2.1 色谱条件色谱柱：Zorbax SB-C18反向色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流速1.0 ml·min-1，柱温30℃，检测波长分别为250 nm和276 nm。进样量：20 μl，流动相：A为0.1%(体积分数)甲酸水溶液，B为甲醇，用前超声脱气30 min，洗脱程序见表1。记录65 min色谱图。理论塔板数按甘草苷和甘草酸峰计应不低于4000。

表1 梯度洗脱程序

时间(min) 流速(m·lmin-1) A(%) B(%)

0 1.0

30 1.0

50 1.0

65 1.0

2.2 对照品溶液的制备精密称取甘草苷对照品

3.68 mg、甘草酸对照品2.46 mg，用70%甲醇水溶液溶解并定容于5 ml棕色容量瓶中，得甘草苷0.736 g·L-1及甘草酸0.492 g·L-1的0号混合对照品标准贮备溶液。从中精密量取适量，用流动相配成甘草苷浓度为0.368、0.184、0.092、0.046、0.0184、0.0092 g·L-1及甘

草酸浓度为0.246、0.123、0.0615、0.03075、0.0123、0.00615 g·L-1的1～6号混合对照品贮备液。

2.3 供试品溶液的制备精密称取甘草粉末及炙甘草粉末(过60目筛，烘干至恒重)各0.2 g，置具塞锥形瓶中，精密加入20 ml 70%甲醇，称定重量，室温放置1 h后超声处理(功率250 W，频率40 kHz)40 min，取出锥形瓶擦干后放冷到室温，再称重，用70%甲醇补足减失的重量，摇匀，上清液经0.45 μm 滤膜滤过，取续滤液供HPLC分析。

2.4 方法学考察

2.4.1 线性关系考察精密吸取“2.2”项下已制备的各不同浓度的混合标准贮备液(0～6号)20 μl注入色谱仪，测定峰面积，以甘草苷或甘草酸浓度(g·L-1)为横坐标(X) ，峰面积为纵坐标(Y)，进行线性回归，得直线回归方程。

2.4.2 检测限和定量限取0号混合对照品标准贮备液，用0.1%甲酸水溶液-甲醇(70:30)依次稀释制成一系列由高到低的梯度浓度溶液并进样分析，测定峰面积约为噪声10倍(S/N=10)时的进样浓度为定量限(QOD)，测定峰面积约为噪声3倍(S/N=3)时的进样浓度为检测限(LOD)。结果甘草苷和甘草酸的QOD分别为0.0069 mg·L-1和0.0077 mg·L-1，LOD分别为0.0023 mg·L-1和0.0031 mg·L-1。

2.4.3 精密度试验精密移取1号混合标准贮备液20μl，重复进样6次(2次进样之间间隔约30min)，测定峰面积，结果甘草苷平均峰面积相对标准偏差(RSD)=0.498%，甘草酸平均峰面积RSD=0.742%;精密移取1号混合标准贮备液20 μl，连续分析6天，每天进样1次，测定峰面积，结果甘草苷平均峰面积RSD=1.67%，甘草酸平均峰面积RSD=2.71%。结果表明仪器精密度良好。

2.4.4 重现性试验取炙甘草样品6份，按“2.3”项下供试品溶液的制备方法处理，制成6份供试品溶液，按“2.1”项下方法测定，结果甘草苷平均含量为0.09683 g·L-1，RSD=1.83%；甘草酸平均含量为0.1358 g·L-1，RSD=2.36%。结果表明此方法重现性良好。