免疫印迹

免疫印迹

免疫印迹又常称Western blot，是一综合性的免疫学检测技术。它利用SDS-PAGE技术将生物样品中的蛋白质分子按分子量的大小在凝胶上分离开，然后用电转移的方法将蛋白转移到固相膜上（NC、尼龙或PVDF膜），最后进行免疫学检测。由于免疫学检测敏感性高，并且通过SDS-PAGE样品中的待检蛋白得到了浓缩，因此，Western blot的灵敏度特别高，可达到放射免疫的分析水平。而使用一般的免疫学检测技术（如ELISA、放射免疫沉淀）检测时，由于要求被检测蛋白可溶、要求抗体效价高、亲和力高和特异性强，往往并不容易达到目的。而Western blot却没有这些缺点。因此，Western blot广泛应用于生物样品中是否存在某一蛋白质（抗原）的检测。也可用于粗略测定抗原蛋白的相对含量和抗原多肽链的相对分子量。

一、原理

是SDS-PAGE电泳与免疫检测相结合的一种蛋白质检测方法。强阴离子去污剂SDS与还原剂并用，通过加热使蛋白质解离，大量的SDS结合蛋白质，使其带相同密度的负电荷，在聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）时，不同蛋白质的迁移率仅取决于分子量。然后将蛋白质转移到膜上，继而用抗体进行检测。经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。

二、实验材料

诱导与未诱导的带有口蹄疫病毒保护性抗原VP1与LTB融合蛋白基因的工程菌。

三、仪器、耗材与试剂

（一）仪器、耗材

DYY－6C电泳仪、DYCZ－24D垂直板电泳槽、封口机、DYCP－40C半干式转移电泳槽、5ml、1ml、200μl、50μl、10μl移液器及相应的Tip、50ml烧杯。新华滤纸、PVDF 膜。剪刀、刀片，直尺、铅笔、一次性手套。

（二）试剂

1.30%储备胶溶液：丙烯酰胺（Acr）29.0g，亚甲双丙烯酰胺（Bis）1.0g，混匀后加ddH2O，

37O C溶解,定容至100ml, 棕色瓶存于4O C。

2. 1.5M Tris-HCl(pH 8.8)：Tris 18.17g加ddH2O溶解, 浓盐酸调pH至8.8,定容至100ml。

3.1M Tris-HCl(pH 6.8)：Tris 12.11 g加ddH2O溶解, 浓盐酸调pH至6.8,定容至100ml。

4.10% SDS：电泳级SDS 10.0 g加ddH2O 68℃助溶,浓盐酸调至pH 7.2,定容至100ml。

5.10⨯电泳缓冲液(pH 8.3)：Tris 3.02 g，甘氨酸18.8 g，10% SDS 10ml加ddH2O溶解, 定

容至100ml。

6.10%过硫酸铵（AP）：1gAP加ddH2O至10ml。

7.14.4-97.4kDa低分子量蛋白质标准（Marker）

8.2⨯SDS电泳上样缓冲液：1M Tris-HCl (pH 6.8)2.5ml，β-巯基乙醇1.0ml，SDS 0.6 g，甘

油 2.0ml，0.1%溴酚兰1.0ml，ddH2O 3.5ml。

9.考马斯亮兰染色液：考马斯亮兰0.25 g，甲醇225ml，冰醋酸46ml，ddH2O 225ml。

10.脱色液:甲醇、冰醋酸、ddH2O以3∶1∶6配制而成。

11.转膜缓冲液：48mM Tris-Cl, 39mM甘氨酸、0.037%SDS 、20%的甲醇，pH8.3。甘氨

酸 2.9g；Tris 5.8g；SDS 0.37g；甲醇200ml；加ddH2O定容至1000ml。

12.0.01M PBS(pH7.4)：NaCl 8.0g；KCl 0.2g；Na2HPO4 1.44g；KH2PO40.24g；加ddH2O

至1000ml

13.显色液：DAB 6.0mg；0.01M PBS 10.0ml；硫酸镍胺0.1ml；H202 1.0μl。或增强型HRP

－DAB底物显色剂盒

14.FMDV阳性猪血清

15.兔抗猪IgG-HRP酶酶结合物（俗称酶标抗体），购自Sigma公司，产品编号A5670

四、操作步骤

（一）SDS－PAGE

先安装好DYCZ－24D垂直板电泳槽，然后如下操作

1、聚丙烯酰胺凝胶的配制

①分离胶(15%)的配制:

ddH2O 2.3ml 10% SDS 0.1ml

30%储备胶 5.0ml 10% AP 0.1ml

1.5M Tris-HCl

2.5ml TEMED 4μl

小心将上述溶液混匀，注意摇起气泡。迅速将丙烯酰胺溶液灌注到DYCZ－24D电泳槽的两玻璃板的间隙中，留出灌注积层胶所需的空间（梳子的齿长再加1cm）。然后，再在丙烯酰胺溶液上小心要覆盖一层水（可灌满）。将电泳槽垂直放置于室温下。分离胶聚合完全（约30分钟），将分离胶上的水倒去,并将残存的水珠用滤纸条吸去。

②积层胶（5%）的配制：

ddH2O 1.4 ml 10%SDS 0.02 ml

30%储备胶0.33 ml 10%AP 0.02 ml

1M Tris-HCl 0.25 ml TEMED 2 μl

将上述混合液灌注到分离胶上面的两玻璃板的间隙中,并立即将梳子插入玻璃板间，完全聚合需30min。

2、样品处理：将样品加入等量的2×SDS上样缓冲液，100℃加热3-5min，离心12000g×1min，取上清作SDS-PAGE分析，同时将SDS低分子量蛋白标准品作平行处理。

3、上样: 取10μl诱导与未诱导的处理后的样品加入样品池中,并加入20μl低分子量蛋白标准品作对照。

4、电泳:在电泳槽中加入1 电泳缓冲液，连接电源，电泳时，积层胶电压60V,分离胶电压100V,电泳至溴酚兰行至电泳槽下端停止（约需3hr）。

5、染色:将胶从玻璃板中取出，考马斯亮兰染色液染色，室温4hr。

6、脱色:将胶从染色液中取出,放入脱色液中,多次脱色至蛋白带清晰。

7、凝胶摄像和保存：在图像处理系统下将脱色好的凝胶摄像，结果存于软盘中，凝胶可保存于双蒸水中或7%乙酸溶液中。

SDS－PAGE注意事项

1、实验样品孔与各对照孔所加总蛋白含量要相等：。

2、为达到较好的凝胶聚合效果，缓冲液的pH值要准确，10%APS在一周内使用。室温较低时，TEMED的量可加倍。

3、未聚合的丙烯酰胺和亚甲双丙烯酰胺具有神经毒性，可通过皮肤和呼吸道吸收，应注意防护。

（二）电转移

1、电泳结束后将胶条割至合适大小，用转膜缓冲液平衡，5min×3次。

2、膜处理：预先裁好与胶条同样大小的6张滤纸和PVDF膜，将膜在甲醇中浸泡15秒，然后再在蒸馏水中浸泡2min，最后在转膜缓冲液中最少平衡5min。

3、转膜：转膜装置从下至上依次按阴极碳板、3层滤纸、凝胶、PVDF膜、3层滤纸、阳极碳板的顺序放好，滤纸、凝胶、PVDF膜精确对齐，每一步去除气泡，上压500g重物，将碳板上多余的液体吸干。接通电源,恒流1mA/cm2，转移1.0hr 或3mA/cm2，转移30min。

（三）免疫反应：

1、用0.01M PBST洗膜(pH7.4, 0.02%吐温20)，5min ×3次。

2、封闭：将纤维素膜置于一塑料袋中，加封闭液(1%BSA于PBS(pH7.4)中, 0.02%吐温20)，室温下轻轻振荡2-3小时或4℃过夜。

3、封闭液，用0.01M PBS洗膜，5min×3次。

4．加FMDV阳性猪血清，用PBS稀释50倍，37℃作用2hr。

4、加入抗猪酶标抗体（按合适稀释比例用0.01M PBS稀释，液体必须覆盖膜的全部），4℃