免疫印迹
免疫印迹 酶联免疫
免疫印迹酶联免疫
免疫印迹和酶联免疫都是生物化学和免疫学领域常用的实验技术，用于检测特定蛋白质的存在和浓度。
免疫印迹（Western blot）是一种用于检测特定蛋白质的技术，它通过将待测样品中的蛋白质
分离并转移到膜上，然后使用特异性抗体与目标蛋白结合，最终通
过显色或发光方法来检测蛋白质的存在和相对丰度。
免疫印迹技术
常用于研究蛋白质的表达和定量分析。
而酶联免疫（ELISA）是一种广泛应用于生物医学和生物化学领
域的实验技术，用于检测样品中特定蛋白质的存在和浓度。
酶联免
疫的原理是利用酶标记的抗体或配体与待测物质结合，然后通过底
物的反应产生可定量的信号，从而检测样品中目标物质的存在和浓度。
ELISA技术具有高灵敏度和高特异性，常用于临床诊断、药物
筛选、生物学研究等领域。
从技术原理上来看，免疫印迹和酶联免疫都是利用抗体与特定
抗原结合的原理，但在实验步骤、操作流程和应用领域上有所不同。
免疫印迹主要用于研究蛋白质的表达和定量分析，而酶联免疫则更
广泛地应用于临床诊断和生物学研究中。
两种技术在科研和临床实
验室中都具有重要意义，能够帮助科学家和医生更准确地检测和分析样品中的蛋白质，为疾病诊断和药物研发提供重要信息。
免疫印迹(immunoblotting)
免疫印迹（immunoblotting）免疫印迹（immunoblotting）又称蛋白质印迹（Western blotting），是根据抗原抗体的特异性结合检测复杂样品中的某种蛋白的方法。
该法是在凝胶电泳和固相免疫测定技术基础上发展起来的一种新的免疫生化技术。
由于免疫印迹具有SDS-PAGE 的高分辨力和固相免疫测定的高特异性和敏感性，现已成为蛋白分析的一种常规技术。
免疫印迹常用于鉴定某种蛋白，并能对蛋白进行定性和半定量分析。
主要实验步骤如下：1.蛋白质抽提a．实验对象为组织样品，取适量（250～500mg）新鲜组织样品或正确保存的组织样品，加1ml含蛋白酶抑制剂的总蛋白抽提试剂（或核蛋白抽提试剂），匀浆后抽提总蛋白（或核蛋白）。
b.实验对象为细胞样品，每份样品取1×106～1×107细胞，PBS清洗细胞，去PBS加0.1ml～1ml含蛋白酶抑制剂的总蛋白抽提试剂（或核蛋白抽提试剂）抽提总蛋白（或核蛋白）。
2.蛋白质定量：按KCTMBCA蛋白质定量试剂盒操作说明操作，测定样品浓度。
3.变性聚丙烯酰胺不连续凝胶电泳(SDS-PAGE)将准备好的样品液和生物素标记的蛋白质分子量标准分别上样，标准加进第一个孔中，电泳分离蛋白。
4.蛋白质转移到硝酸纤维膜或PVDF膜按Bio-Rad蛋白转移装置说明组装滤纸凝胶纤维素夹层，30mA恒流条件下，4°C转移过夜。
5.膜的封闭和抗体孵育a．膜在5％BSA溶液中室温孵育1小时以封闭膜上的非特异结合。
b.封闭过的膜加入一级抗体室温孵育1.5小时，抗原抗体结合。
c.加入HRP标记的二级抗体以结合一级抗体及HRP标记的抗生物素抗体以结合分子量标准，室温孵育膜1小时。
加入HRP标记的GAPDH抗体可同时检测GAPDH含量。
6.结果检测：化学发光法检测，膜与化学发光底物孵育，经X胶片曝光显影。
图片扫描保存为电脑文件，并用ImageJ分析软件将图片上每个特异条带灰度值的数字化。
免疫印迹的原理和应用
免疫印迹的原理和应用1. 原理免疫印迹（Western Blotting），也称为蛋白质印迹或蛋白免疫印迹，是一种用于检测特定蛋白质的方法。
它基于免疫学技术，通过将样品中的蛋白质分离并转移到固相载体上，然后使用特异性抗体与目标蛋白质结合，最后使用化学发光或染色方法进行可视化。
免疫印迹的原理主要包括以下几个步骤：1.1 蛋白质分离首先，样品中的蛋白质需要被分离开来，常用的方法有聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）和聚丙烯酰胺凝胶二维电泳等。
这些方法能够根据蛋白质的大小、电荷等物理性质将蛋白质分离成不同的带状图案。
1.2 转膜将分离后的蛋白质从凝胶转移到固相载体上，一般使用聚乙烯二烯基氟乙烯膜（PVDF）或硝酸纤维素膜（NC）等。
转膜的方法有湿式转膜和半干式转膜等，其中湿式转膜常用于蛋白质较大的情况，半干式转膜则适用于蛋白质较小的情况。
1.3 结合抗体将转膜后的蛋白质与特异性的抗体结合。
抗体可以是单克隆抗体或多克隆抗体，通过特异性结合目标蛋白质来实现分析和检测。
1.4 可视化最后，通过化学发光或染色等方法将目标蛋白质可视化。
其中，化学发光方法常用于检测蛋白质的表达水平，而染色方法则常用于定性分析。
2. 应用免疫印迹技术在科研和临床诊断中有着广泛的应用。
下面是一些免疫印迹技术常见的应用领域：2.1 研究蛋白质表达和功能免疫印迹技术可用于研究蛋白质的表达和功能。
通过对不同组织或细胞中特定蛋白质的印迹分析，可以了解蛋白质的表达模式以及在细胞功能中的作用。
2.2 肿瘤标志物检测在临床诊断中，免疫印迹技术常用于肿瘤标志物的检测。
例如，可以利用免疫印迹技术检测血清中的癌胚抗原（CEA）和前列腺特异性抗原（PSA）等肿瘤标志物，以辅助肿瘤的早期诊断和疾病监测。
2.3 蛋白质-蛋白质相互作用研究免疫印迹技术还可用于研究蛋白质-蛋白质相互作用。
通过对蛋白质的印迹分析，可以了解不同蛋白质之间的相互作用关系，有助于揭示蛋白质通路和信号转导网络的机制。
蛋白质免疫印迹技术
2
特异性
该技术能够高度特异性地识别并检测目标蛋白,即使在复杂的生物样品中也不会产生交叉反应。
3
检测限
得益于优化的实验步骤和灵敏的检测方法,免疫印迹技术的检测限可达到皮克摩尔级别,能够灵敏检测极微量的目标蛋白。
4
重复性
该技术具有良好的实验重复性,可以准确定量并复制实验结果,为蛋白质研究提供可靠的数据支持。
蛋白质定量分析
可以利用Western blot结果对特定蛋白的相对含量进行定量分析,为进一步的生物学研究提供数据支持。
结果可视化展示
Western blot采用化学发光检测,可以清晰地显示蛋白条带,结合分子量标准进行数据分析和解读。
实验数据处理
数据分析
实验结果的数据处理通常包括绘制图表、统计分析和计算参数。数据分析可以揭示实验结果的趋势和特点,为后续的实验设计和结果解释提供依据。
技术改进方向
提高灵敏度
通过优化实验条件和试剂配方,不断提高免疫印迹技术的检测敏感度,以更准确地识别低丰度蛋白。
增强特异性
开发高特异性的抗体,减少非特异性结合,提升识别目标蛋白的准确性。
自动化集成
将实验流程进行自动化处理,实现样品预处理、电泳、转膜、免疫反应等步骤的高度整合,提高操作效率。
数据分析优化
2
结果解释和分析
对实验结果进行深入分析,阐述结果的意义和影响,讨论可能的影响因素。提出合理的解释和推论。
3
图表展示质量
使用恰当的图表、图像等辅助手段,直观、生动地展示实验结果。确保图表制作规范,便于理解和分析。
4
结论和建议
根据实验结果提出明确的结论,并提出后续研究或应用的建议,为后续工作提供参考。
实验设备
免疫印迹实验报告
免疫印迹实验报告一、实验目的免疫印迹（Western blotting）是一种广泛应用于分子生物学、生物化学和免疫学等领域的技术，用于检测和定量特定蛋白质在样品中的表达水平。
本次实验的目的是通过免疫印迹技术检测目标蛋白在不同样品中的表达情况，以验证实验假设并为进一步的研究提供数据支持。
二、实验原理免疫印迹实验基于抗原抗体特异性结合的原理。
首先，通过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDSPAGE）将蛋白质样品按照分子量大小分离。
然后，将分离后的蛋白质从凝胶转移到固相支持物（如硝酸纤维素膜或聚偏二氟乙烯膜）上。
接着，膜与特异性抗体进行孵育，使抗体与目标蛋白结合。
最后，通过检测抗体的存在来确定目标蛋白的表达水平。
检测抗体的方法通常包括使用酶标记的二抗结合底物产生显色或发光信号，或者使用荧光标记的二抗通过荧光检测系统进行检测。
三、实验材料和设备1、材料细胞裂解液蛋白酶抑制剂蛋白标准品一抗（特异性针对目标蛋白）二抗（酶标记或荧光标记）化学发光底物（或荧光检测试剂）预染蛋白分子量标准硝酸纤维素膜或聚偏二氟乙烯膜电泳缓冲液转膜缓冲液封闭液（如脱脂奶粉或牛血清白蛋白溶液）洗涤液（含吐温 20 的磷酸盐缓冲液）2、设备电泳仪和电泳槽转膜装置摇床冰箱酶标仪（或荧光检测仪器）四、实验步骤1、蛋白样品制备收集细胞或组织样本，加入适量的细胞裂解液和蛋白酶抑制剂，在冰上裂解一定时间。
离心收集上清液，即为蛋白样品。
2、 SDSPAGE 电泳制备 SDSPAGE 凝胶，根据目标蛋白的分子量选择合适的分离胶浓度。
将蛋白样品与上样缓冲液混合，煮沸变性。
上样，进行电泳，直至溴酚蓝指示剂到达凝胶底部。
3、转膜电泳结束后，将凝胶浸泡在转膜缓冲液中平衡。
按照“三明治”结构组装转膜装置，依次为阴极、滤纸、凝胶、膜、滤纸、阳极。
在冰浴或冷室中进行转膜，根据蛋白分子量和转膜条件确定转膜时间。
4、封闭转膜结束后，将膜放入封闭液中，在摇床上孵育一定时间，以封闭非特异性结合位点。
免疫印迹技术原理
免疫印迹技术原理免疫印迹技术（Immunoassay）是一种广泛应用于生物医学领域的检测方法，其原理是利用抗体与抗原之间的特异性结合来检测目标物质的存在。
该技术基于生物学分子间的相互作用，具有高灵敏度、高特异性和高准确性的特点，广泛应用于临床诊断、生物学研究和环境监测等领域。
免疫印迹技术的原理主要包括制备免疫印迹材料、样品处理、免疫反应和检测四个步骤。
制备免疫印迹材料是免疫印迹技术的关键步骤。
通过将目标分子与功能单体（如丙烯酰胺、甲基丙烯酸等）在适当条件下共聚合，形成具有空腔结构的免疫印迹材料。
在共聚合过程中，目标分子充当模板，功能单体围绕目标分子形成空腔，模板去除后形成与目标分子形状结构相匹配的免疫印迹材料。
样品处理是为了提取目标分子并与免疫印迹材料发生特异性结合。
样品处理包括样品的提取、纯化和预处理等步骤，确保样品中目标分子的完整性和稳定性。
接着，免疫反应是将经过处理的样品与免疫印迹材料接触，使目标分子与免疫印迹材料中的空腔发生特异性结合。
在免疫反应过程中，目标分子与免疫印迹材料之间形成稳定的配对，非特异性结合物被洗脱，提高检测的特异性和灵敏度。
检测是通过测定免疫反应后的样品中目标分子的含量来实现。
常见的检测方法包括光谱法、电化学法、质谱法等，根据不同的检测方法选择合适的检测参数和仪器设备，实现目标分子的定量和定性检测。
免疫印迹技术在临床诊断中被广泛应用，可用于检测血清中的蛋白质、激素、药物等，帮助医生进行疾病的诊断和治疗。
同时，免疫印迹技术也在食品安全、环境监测、药物研发等领域发挥重要作用，为人类健康和生活质量提供有力支持。
总的来说，免疫印迹技术以其独特的原理和优势在生物医学领域得到广泛应用，为疾病的早期诊断、药物研发和环境监测提供了重要技术支持。
随着科学技术的不断进步和发展，免疫印迹技术将更加完善和普及，为人类健康和生活带来更多福祉。
免疫印迹技术的原理
免疫印迹技术的原理免疫印迹技术，又称Western blotting技术，是一种常用的蛋白质分析方法。
它能够检测特定抗原在复杂混合物中的存在与数量，并对蛋白质分子进行定性和定量研究。
免疫印迹技术的原理基于抗原与抗体的特异性结合，通过将样品中的蛋白质分离并转移到固相载体上，再用特异性抗体与抗原结合，最后通过检测系统检测抗原与抗体结合的信号。
免疫印迹技术主要分为以下几个步骤：样品制备、蛋白质分离、电泳转移、膜上固定、抗体结合和信号检测。
样品制备是免疫印迹技术的重要步骤之一。
样品可以是细胞提取物、组织提取物或纯化的蛋白质。
在样品制备过程中，需要加入蛋白质提取缓冲液使细胞或组织破碎，并加入蛋白酶抑制剂以防止蛋白质降解。
然后，通过离心将细胞碎片沉淀，收集上清液中的蛋白质。
接下来，蛋白质分离是为了将复杂的样品中的蛋白质按照大小分开，常用的方法是聚丙烯酰胺凝胶电泳。
在凝胶中加入样品，通过电场作用使蛋白质向电泳方向运动，根据其大小被分离在凝胶中不同的位置。
分离完毕后，将蛋白质转移到固相载体上。
电泳转移是将蛋白质从凝胶转移到固相载体（如聚氟乙烯膜）上的过程。
凝胶和膜之间放置一个缓冲液，通过电场作用使蛋白质从凝胶中迁移到膜上。
这样可以将蛋白质固定在膜上，便于后续的抗体结合步骤。
转移完毕后，膜上的蛋白质需要被固定，以防止其在后续处理过程中的溶解或移动。
通常使用甲醛或乙醛等物质进行固定。
固定后，膜上的蛋白质就可以与特异性抗体结合了。
抗体结合是免疫印迹技术的核心步骤。
在抗体结合步骤中，膜上的蛋白质首先需要与一个特异性抗体结合，形成抗原-抗体复合物。
这个抗体可以是单克隆抗体或多克隆抗体。
抗体结合后，通过洗涤去除非特异性结合的抗体，只留下与目标抗原结合的特异性抗体。
通过信号检测系统检测抗原与抗体结合的信号。
常用的信号检测方法有化学发光、荧光或显色反应。
这些方法可以将抗原与抗体结合的信号转化为可见的光信号或色信号，以便观察和记录。
免疫印迹法原理
免疫印迹法原理免疫印迹法（immunoblotting）是一种用于检测特定蛋白质的方法，它是通过将待检测蛋白质与特异性抗体结合，然后通过电泳分离蛋白质，并将其转移到固体支持物上进行检测的技术。
这项技术在生物化学和分子生物学研究中得到了广泛的应用，尤其在检测蛋白质表达和定量方面具有重要意义。
免疫印迹法的原理基于免疫学和生物化学的知识，其步骤主要包括制备蛋白质样品、SDS-PAGE电泳分离、转膜、孵育抗体、显色和定量分析等。
首先，待检测的蛋白质样品需要经过裂解和处理，以保持其天然的构象和功能。
然后，蛋白质样品经过SDS-PAGE电泳分离，根据蛋白质的大小和电荷进行分离。
接下来，将分离后的蛋白质转移到固体支持物上，通常是通过电泳转膜或吸附法进行。
转膜完成后，需要将固相支持物进行孵育，以结合特异性的一抗和二抗。
一抗与待检测蛋白质特异性结合，而二抗与一抗结合的部位标记有酶或荧光素，用于检测和定量。
在显色步骤中，通过酶标记或荧光素标记的二抗，可以将待检测蛋白质显示出来，并且可以通过光密度仪或成像系统进行定量分析。
免疫印迹法的结果通常以蛋白质的相对分子质量和表达水平呈现，可以用于比较不同条件下蛋白质的表达差异，或者用于验证特定蛋白质的存在和表达水平。
免疫印迹法的优点在于其高灵敏度和特异性，可以检测低表达水平的蛋白质，同时也能够识别不同大小和电荷的蛋白质。
此外，该技术还可以用于检测蛋白质的修饰状态，如磷酸化、甲基化等。
然而，免疫印迹法也存在一些局限性，如对蛋白质的结构和构象要求较高，同时也需要特异性抗体的选择和优化。
总的来说，免疫印迹法是一种重要的蛋白质检测和定量方法，其原理简单清晰，操作相对容易，同时具有高灵敏度和特异性，因此在生物医学研究和临床诊断中得到了广泛的应用。
随着生物技术的不断发展，免疫印迹法也在不断地完善和改进，为科研工作者提供了更多的选择和可能性。
免疫印迹原理
免疫印迹原理
免疫印迹（Western blot）是一种常用的蛋白质检测方法，其
原理基于蛋白质的免疫识别和特异性结合。
首先，需要通过SDS-PAGE电泳技术将待检测的蛋白质样品
进行分离。
然后，将分离后的蛋白质转移到固相膜上，常用的固相膜有聚乙烯二醇（PVDF）和亚硝酸纤维素膜（NC）。
接下来，将蛋白质固定在固相膜上，并用非特异性蛋白质进行封闭，以防止非特异性结合。
之后，将待检测的蛋白质与特异性的抗体结合，这些抗体通常是动物经免疫后制备的，可以识别并结合目标蛋白质。
接着，通过荧光素酶体（如辣根过氧化物酶）或荧光染料等进行二级抗体的标记，以便识别和检测蛋白质-抗体结合。
这样，待检测的蛋白质可以通过相应的信号表现出来。
最后，通过相应的检测系统（如X射线胶片或成像仪），可
以观察到与目标蛋白质结合的蛋白带，其强度和位置可以用来定量分析目标蛋白质的表达量和大小。
总之，免疫印迹是一种通过特异性抗体识别和结合目标蛋白质的方法，并利用荧光素酶体或荧光染料等标记物进行检测，用以分析蛋白质的表达量和大小。
这种方法广泛应用于生物医学研究领域，为疾病相关蛋白质的检测和分析提供了有力的工具。
免疫印迹wb的原理
免疫印迹wb的原理免疫印迹（Western Blotting，简称WB）是一种常用的蛋白质分析技术，广泛应用于生命科学研究领域。
它可以用来检测特定蛋白质在复杂的混合物中的存在与表达水平，具有高灵敏度和高特异性的优势。
免疫印迹的原理基于蛋白质的分子量、电荷和亲和性等特性。
首先，需要将待分析的蛋白质样品经过SDS-PAGE电泳进行分离，将蛋白质按照分子量大小分成不同的带状条带。
然后，将蛋白质从凝胶转移到聚合物膜（通常为聚偏氟乙烯膜）上，这个步骤称为电转移。
电转移过程中，蛋白质会被定向转移到膜上，形成与凝胶上相对应的蛋白质条带。
接下来，进行与待检测蛋白质特异性结合的抗体处理。
将膜浸泡在含有特异性一抗的抗体溶液中，一抗与待检测蛋白质结合形成免疫复合物。
为了增强对抗体-蛋白质复合物的检测灵敏度，通常需要进行洗涤步骤，以去除未结合的抗体和其他非特异性结合的物质。
然后，加入与第一抗体结合的二抗，这个二抗通常是与酶结合的二抗。
这种酶可以与染色底物发生反应，产生明显的信号。
这一步骤被称为二抗结合。
经过洗涤去除未结合的二抗后，加入染色底物，底物与酶发生反应后会生成可见的信号，形成蛋白质检测结果。
这种信号可以通过暗室或者专用的设备进行可视化，并进行定量分析。
免疫印迹技术的优点在于其高度特异性和高灵敏度。
通过使用特异性抗体，可以准确地检测目标蛋白质的存在与表达水平。
此外，免疫印迹还可以同时检测多个蛋白质，通过在膜上分别施加不同的抗体可以同时检测多个目标蛋白质。
然而，免疫印迹也存在一些限制。
首先，免疫印迹需要特异性抗体来检测目标蛋白质，这对于一些没有合适抗体的蛋白质来说是一个挑战。
其次，免疫印迹需要较长的实验时间，从样品制备到最终结果的获取需要几天时间。
此外，免疫印迹对于蛋白质分子量较大的蛋白质检测效果较差。
总结起来，免疫印迹是一种常用的蛋白质分析技术，通过将蛋白质从凝胶转移到膜上，并使用特异性抗体进行检测，可以准确地检测目标蛋白质的存在与表达水平。
免疫印迹
免疫印迹吴克非（21100211）刘彩奇（21100210）萧艳（21100229）陈柏合（21100230）实验原理:免疫印迹（Western blot）又称蛋白印迹，是凝胶电泳与固相免疫测定技术结合起来的一种免疫生化技术，借助特异性抗体鉴定抗原。
在电场作用下将电泳分离的蛋白质由凝胶转移至固相载体，用识别此多肽的抗体进行检测。
免疫印迹的灵敏度可达到标准的固相放射免疫分析的水平而又无需对靶蛋白进行放射性标记，此方法可检测出1~5ng中等大小的待检蛋白。
实验目的：掌握实验原理和相关技术如SDS-PAGE等；掌握各项操作中的注意事项及应用范围；了解设置内参的目的和原理及集中常用的内参蛋白。
实验器材及试剂：SDS-PAGE电泳槽，转膜电泳槽，海绵垫，滤纸，镊子，EP手套，去离子水，Tris HCL/SDS （Ph6.8），Tris HCL/SDS（Ph8.8），10%过硫酸铵（APS）,四甲基乙二胺（TEMED）,30:0.8丙烯酰胺/双丙烯酰胺，电泳缓冲液，转移缓冲液，5%脱脂奶粉，硝酸纤维素膜（NC膜），洗液，特异性抗原（一抗），DAB,经过还原剂处理的小鼠血清，未经过还原剂处理过的血清实验步骤：1、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳：（1）将玻璃板洗净擦干，装好玻璃板，加入双蒸水检查密封性；（2）按下表配置10%的分离胶，充分混匀后沿隔板条边缘缓缓加入，距短板2.5cm左右时停止，先后沿两侧隔条加入少许去离子水覆盖胶面，室温聚合30~60min（37℃水浴箱15~20min）；（3）（4）按下表制备浓缩胶，混匀后用胶头滴管加入，插入梳子；室温聚合30~60min左右（（5）（6）样品的处理：30µl小鼠血清（小鼠IgG）+30µl2×SDS样品缓冲液，混匀后100℃煮沸3~5min，小心拔出梳子后用移液器将经还原剂处理过的样品及未经处理的样品液加入到孔中，约15µl/孔。
免疫印迹名词解释
免疫印迹名词解释
免疫印迹（Immunohistochemistry）是一种通过利用生物化学的相互
作用来定位免疫反应的细胞或组织结构的技术。
它是一种微观及细胞生物
学的技术，它把放射性、化学及生化特征结合起来，预测细胞之间的变化。
免疫印迹主要是通过细胞表面及细胞内抗原，使用相关的抗体，来检
测抗原的存在，确定细胞类型或其他细胞状态。
通过使用特定的抗体、特
定的染料及多种免疫学方法，研究者可以观察到细胞表面及细胞内的抗原，从而确定有关的变化，包括蛋白质的类型、位置、分布及表达量。
免疫印迹主要利用免疫学反应原理，使用抗体来识别细胞表面及细胞
内的抗原，并通过染色的方法显示出相应结果。
其中，一种常用的染色方
法是免疫荧光，即利用特定的免疫抗体来结合细胞表面及细胞内特定位置
的抗原，再将其能够发射荧光的特定染料结合起来，从而观察出相应的细
胞表面及细胞内抗原的存在。
免疫印迹技术广泛用于肿瘤诊断和肿瘤治疗，以观察肿瘤细胞和肿瘤
组织结构的分布特征，以及肿瘤细胞内的蛋白质的表达量等，从而判断肿
瘤的性质及治疗的方法。
同时，它还可用于复杂的药物研究，如活性成分
的检测等，有助于药物研发及药物剂量的优化。
免疫印迹检测方法
免疫印迹检测方法
免疫印迹检测方法，又称蛋白质印迹或Western Blotting，是一种利用抗
原抗体的特异性结合检测复杂样品中的某种蛋白的方法。
以下是其基本步骤：
1. 取样：取上清液作为样品。
2. 电泳：制备电泳凝胶，进行SDS-PAGE。
3. 转移：通过半干式转移，将电泳后的凝胶上的蛋白质转移到膜上。
这个过程包括割胶、平衡、膜处理、转膜等步骤。
其中，转膜是关键步骤，需要将凝胶上的蛋白质精确转移到NC膜上，滤纸、凝胶、NC膜需要精确对齐，
去除气泡，并在恒流1mA/cm2下转移小时。
4. 免疫检测：在转移后的膜上，利用抗体进行检测。
这一步通常包括一抗和二抗的结合，以及通过化学发光检测或其他方法检测到结合的抗体。
5. 结果分析：通过对比染色结果和标准条带，可以分析出样品中特定蛋白质的表达情况。
此外，阴性对照是以1%BSA取代一抗，其余步骤与实验组相同。
以上信息仅供参考，具体步骤可能会根据实验需求和条件有所不同，建议咨询专业人士获取具体信息。
免疫印迹
统不相容;价格昂贵;活化后半衰期短
55
★
转移液
转移液的导电性要尽可能低
甲醇可以提高转移速率
甲醇影响糖蛋白和高分子量蛋白的转移
56
常见问题
带上手套，尽量避免污染滤纸和膜
尽量使所有物品保持湿润 夹凝胶时注意，千万不要太用力，凝胶较脆，易碎
57
裁减好的滤纸和膜浸泡与电泳转移缓冲液中，
可以注射器内筒驱除留于膜上的气泡。
引发剂 10％过硫酸铵 (APS) 增速剂 四甲基乙二胺 (TEMED)
12ul
12ul
12ul
12ul
加胶至距短板上沿2.5cm,加水至短板上沿
11
积层胶
3) 倒去顶层水，用滤纸吸去表面水分，插入梳子。 4) 按下表配制积层胶，混匀后用1ml移液器加入，室温聚合 30min左右。
积层胶（3.9％丙稀酰胺） 30：0.8丙稀酰胺/双丙稀酰胺 Tris.HCl/SDS pH6.8（4×） 去离子水 10％过硫酸铵 TEMED 0.65ml 1.25ml 3.05ml 50ul 10ul
19
没有滑动加样或未加水
20
常见问题
两块玻璃板之间灌胶,胶为什么总是不平?
1) 玻璃没有洗干净，应该要洗得非常干净！ 2) 过硫酸铵和TEMED的加量不合适，加量相对较多， 凝胶凝固过快也会胶不平，最多按照分子克隆加倍。
3) 加完试剂以后没有很好的摇匀，导致有些部位的聚合
剂浓度过高，聚合相对较快造成胶不平。
纹理（streak）
原因：样品中存在不溶颗粒 处理方法：增加溶解度或离心除去不溶颗粒
39
上样过多
40
电流过大
41
多次加胶
42
免疫印迹法原理
免疫印迹法原理免疫印迹法（Western Blot）是一种常用的蛋白质检测技术，广泛应用于生物医学研究领域。
它通过检测特定蛋白质在样本中的存在与否，以及其相对表达水平，帮助科研人员了解蛋白质的功能、结构和代谢途径。
本文将介绍免疫印迹法的原理及其在科研中的应用。
免疫印迹法的原理主要包括蛋白质分离、转膜、免疫印迹和检测四个步骤。
首先是蛋白质分离。
通常采用聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）将待检测样本中的蛋白质按照大小分离开来。
这一步骤是为了使得待检测的蛋白质能够被免疫印迹所检测到。
接着是转膜。
将SDS-PAGE分离出的蛋白质转移到聚丙烯酸膜或硝酸纤维膜上，形成蛋白质斑点。
这一步骤是为了将蛋白质从凝胶中转移到膜上，以便后续的免疫印迹检测。
然后是免疫印迹。
将转膜中的蛋白质用特异性的抗体进行识别和结合。
首先是将转膜进行孵育，使得抗体与特定蛋白质结合。
然后通过洗涤去除未结合的抗体，最后通过化学发光或染色等方法来检测蛋白质的存在与否。
最后是检测。
通过化学发光、荧光或染色等方法来检测蛋白质的存在与相对表达水平。
这一步骤是为了定量分析待检测蛋白质的表达水平，从而了解其在生物学过程中的功能和作用。
免疫印迹法在生物医学研究中有着广泛的应用。
首先，它可以用于检测特定蛋白质的存在与否，从而帮助科研人员了解蛋白质在细胞中的表达情况。
其次，免疫印迹法也可以用于检测蛋白质的修饰状态，比如磷酸化、甲基化等修饰形式，从而揭示蛋白质的功能和调控机制。
此外，免疫印迹法还可以用于筛选药物靶点、诊断疾病和评估治疗效果等方面。
总之，免疫印迹法是一种重要的蛋白质检测技术，其原理简单清晰，应用广泛灵活。
通过对特定蛋白质的检测和定量分析，可以帮助科研人员深入了解蛋白质的功能和调控机制，为生物医学研究提供重要的实验手段和数据支持。
免疫印迹
9. 上样
10. 电泳（浓缩胶20mA，分离胶35mA）
11. 电转膜仪转膜（100mA 40分钟）
12. 膜用丽春红染色，胶用考马斯亮蓝染色
13. Westernblot 试剂盒显色
14. 分析比较记录
一.试剂选择
1. 膜的选择:主要采用 NC膜和PVDF膜,其比较如下:
2.膜的孔径: 0.45um适用一般蛋白质. 0.2um适用小分子蛋白质.
3.蛋白质染色
Ponceau-S Red丽春红 5ug 无
快绿Fc 5ug 无
Sypro Rose 1-2ng 无
氨基黑10B 1ug 有
考马斯亮兰R-250 500ng 有
印度墨 100ng 有
胶体金 4ng 有
试剂：
1、蛋白提取试剂（RIPA缓冲液（每克组织3 ml RIPA）， PMSF（每克组织30ml，10 mg/ml PMSF））
2、NC膜或PVDF膜
3、丽春红，考马斯亮蓝
4、Western Blot试剂盒
实验步骤
1. 取细胞。
2. 加入RIPA缓冲液（每克组织3 ml RIPA）， PMSF（每克组织30ml，10 mg/ml PMSF），利用Polytron进一步匀浆（15,000转/分*1分钟）维持4℃
免疫印迹(immunoblotting)又称蛋白质印迹(Western blotting)，是一种借助特异性抗体鉴定抗原的有效方法。该法是在凝胶电泳和固相免疫测定技术基础上发展起来的一种新的免疫生化技术。将含有目标蛋白(抗原)的样品首先用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)或非变性电泳(Native-PAGE)等分离后，通过转移电泳原位转印至硝酸纤维素膜或其它膜的表面，然后将膜表面的蛋白质再用抗原抗体反应进行特异性检测。例如，将经SDS-PAGE分离的蛋白质带转移到膜上后，膜用封闭液处理，然后与第一抗体反应，膜经漂洗后再与偶有辣根过氧化物酶(HRP)或碱性磷酸(酯)酶(AP)的第二抗体反应，加人生色底物反应之后，即可显示出目标蛋白的位置。由于免疫印迹具有SDS-PAGE的高分辨力和固相免疫测定的高特异性和敏感性，其优点是方法简便、标本可长期保存、结果便于比较，故广泛应用于分子生物学等领域，成为免疫学、微生物学及其他生命科学常用的一种研究方法。
免疫印迹
经过聚丙酰胺凝胶分离的蛋白质样品，转移 到固相载体上作为抗原，与对应的抗体起免 疫反应，再与酶标记的第二抗体起反应，经 过底物显色以检测电泳分离的特异性目的蛋 白成分
80-100 μg/cm2
干的膜很脆 差 缓冲液润湿 较低
用惰性蛋白质或非离子去污剂对杂交膜上非 特异性的蛋白质结合位点进行处理，达到降 低抗体的非特异性结合的过程 常见的封闭剂： BSA 脱脂奶粉 酪蛋白 明胶 Tween-20
酶促反应是Western Blot的主流检测方法 酶促反应可以搭配不同的底物从而实现不同的 显色方法：
化学发光：灵敏度很高 底物显色：直接显色操作简便且成本低
自身抗体检测：抗核抗体谱 抗中性粒细胞胞浆抗体谱 过敏原检测
将电泳后分离的蛋白质从凝胶中转移到固相载体上 毛细管印迹法和电泳印迹法 常用膜：硝酸纤维素（nitrocellulose, NC）膜 聚偏二氟乙烯(Polyvinylidene fluoride, PVDF)膜
PVDF膜 背景 低 蛋白结合能 100-200 μg/cm2 力 机械强度 强 溶剂抗性 使用前处理 价格 强 甲醛润湿 高 NC膜 低
孵育 二抗
孵育 一抗
封闭
总蛋白制备
水溶液提取法：针对水、稀盐、稀酸或碱 溶液中的蛋白质 有机溶剂提取法：对于分子中非极性侧链 较多的蛋白质 目的蛋白制备：层析或电洗脱法
比色法
常用方法有：Bradford法（考马斯亮蓝法） Lowry法（福林-酚试剂法） BCA法（二喹啉甲酸法）
巯基乙醇(强还原剂）：断开二硫键破坏蛋白 质的四级结构 SDS（阴离子表面活性剂）：断开分子内和分 子间的氢键，破坏蛋白质分子的二级和三级 结构 蛋白质分子结合SDS，消除不同种蛋白质之间 所带净电荷的差异 蛋白质的电泳迁移率主要决定于亚基的相对 分子质量，而与其所带电荷的性质无关
免疫印迹法的实验技术PPT课件
根据实验结果和反馈，不断优化和改 进实验条件和方法，提高实验质量。
改进实验方法
积极探索和尝试新的实验方法和技术， 提高实验效率案例一：病毒抗原的检测
总结词
高效、准确
详细描述
免疫印迹法在病毒抗原检测中具有高效、准确的优点，能够快速识别病毒抗原， 为临床诊断和治疗提供有力支持。
疾病诊断
药物研发
通过检测患者血清或其他体液中的蛋白质 表达水平，辅助医生对疾病进行早期诊断 、分型和监测病情进展。
在药物筛选和药效评估过程中，利用免疫 印迹法检测药物对特定蛋白质表达的影响 ，从而评估药物的疗效和安全性。
生物标志物研究
蛋白质相互作用研究
通过免疫印迹法检测生物样本中特定蛋白 质的表达水平，有助于揭示生物标志物与 疾病发生、发展之间的关系。
存。
03
实验操作流程
样品处理与分离
样品选择
选择适当的组织或细胞样品，确保其具有代 表性。
蛋白提取
使用适当的缓冲液和蛋白提取试剂，确保蛋 白质的完整性和活性。
细胞分离
根据细胞类型和实验需求，采用不同的分离 方法，如组织匀浆、离心等。
蛋白定量
采用BCA法、Bradford法等方法对提取的蛋 白进行定量，以便后续操作。
转印与封闭
01
02
03
转印膜选择
根据实验需求选择适当的 转印膜，如NC膜、PVDF 膜等。
转印条件
设置适当的电流、电压和 转印时间，确保蛋白质成 功转移至膜上。
封闭操作
采用合适的封闭液对转印 膜进行封闭，以减少非特 异性结合。
免疫反应与显色
一抗选择
根据实验目的选择特异性的一抗，确 保与目标蛋白的结合。
案例二：肿瘤标志物的检测
免疫印迹试验名词解释
免疫印迹试验名词解释
免疫印迹试验（immunoblotting）是一种常用的实验技术，用于检测和分离蛋白质样本中特定抗原的存在。
该技术结合了蛋白质电泳分离和免疫反应原理。
免疫印迹试验的步骤如下：
1.样本处理：将待测蛋白质样本经过电泳分离，通常使用聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）。
2.转印：将分离的蛋白质从凝胶转移到固定在膜上的靶蛋白（通常是聚偏二氟乙烯膜）。
3.阻断：用一种阻止非特异性结合的蛋白质（例如乳清蛋白或牛血清白蛋白）封闭膜上的未被转移的位点，以减少非特异性结合。
4.抗体结合：将特异性抗体添加到膜上，使其与目标抗原特异性结合。
5.洗涤：洗去未结合的抗体，以减少非特异性结合。
6.检测：添加适当的检测试剂，例如酶标记的二抗或荧光标记的二抗，以与特异性抗体结合的抗原发生化学或光学反应。
7.显色：通过添加染色剂，例如酶底物或荧光染料，可使目标抗原在膜上可视化。
通过免疫印迹试验，可以确定样本中特定蛋白质的存在与否，确定蛋白质的分子量，并研究蛋白质的表达水平和亚细胞定位等信息。
这项技术在生物医学研究、临床诊断和药物开发等领域广泛应用。
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免疫印迹
免疫印迹又常称Western blot，是一综合性的免疫学检测技术。
它利用SDS-PAGE技术将生物样品中的蛋白质分子按分子量的大小在凝胶上分离开，然后用电转移的方法将蛋白转移到固相膜上（NC、尼龙或PVDF膜），最后进行免疫学检测。
由于免疫学检测敏感性高，并且通过SDS-PAGE样品中的待检蛋白得到了浓缩，因此，Western blot的灵敏度特别高，可达到放射免疫的分析水平。
而使用一般的免疫学检测技术（如ELISA、放射免疫沉淀）检测时，由于要求被检测蛋白可溶、要求抗体效价高、亲和力高和特异性强，往往并不容易达到目的。
而Western blot却没有这些缺点。
因此，Western blot广泛应用于生物样品中是否存在某一蛋白质（抗原）的检测。
也可用于粗略测定抗原蛋白的相对含量和抗原多肽链的相对分子量。
一、原理
是SDS-PAGE电泳与免疫检测相结合的一种蛋白质检测方法。
强阴离子去污剂SDS与还原剂并用，通过加热使蛋白质解离，大量的SDS结合蛋白质，使其带相同密度的负电荷，在聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）时，不同蛋白质的迁移率仅取决于分子量。
然后将蛋白质转移到膜上，继而用抗体进行检测。
经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。
以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。
二、实验材料
诱导与未诱导的带有口蹄疫病毒保护性抗原VP1与LTB融合蛋白基因的工程菌。
三、仪器、耗材与试剂
（一）仪器、耗材
DYY－6C电泳仪、DYCZ－24D垂直板电泳槽、封口机、DYCP－40C半干式转移电泳槽、5ml、1ml、200μl、50μl、10μl移液器及相应的Tip、50ml烧杯。
新华滤纸、PVDF 膜。
剪刀、刀片，直尺、铅笔、一次性手套。
（二）试剂
1.30%储备胶溶液：丙烯酰胺（Acr）29.0g，亚甲双丙烯酰胺（Bis）1.0g，混匀后加ddH2O，
37O C溶解,定容至100ml, 棕色瓶存于4O C。
2. 1.5M Tris-HCl(pH 8.8)：Tris 18.17g加ddH2O溶解, 浓盐酸调pH至8.8,定容至100ml。
3.1M Tris-HCl(pH 6.8)：Tris 12.11 g加ddH2O溶解, 浓盐酸调pH至6.8,定容至100ml。
4.10% SDS：电泳级SDS 10.0 g加ddH2O 68℃助溶,浓盐酸调至pH 7.2,定容至100ml。
5.10⨯电泳缓冲液(pH 8.3)：Tris 3.02 g，甘氨酸18.8 g，10% SDS 10ml加ddH2O溶解, 定
容至100ml。
6.10%过硫酸铵（AP）：1gAP加ddH2O至10ml。
7.14.4-97.4kDa低分子量蛋白质标准（Marker）
8.2⨯SDS电泳上样缓冲液：1M Tris-HCl (pH 6.8)2.5ml，β-巯基乙醇1.0ml，SDS 0.6 g，甘
油 2.0ml，0.1%溴酚兰1.0ml，ddH2O 3.5ml。
9.考马斯亮兰染色液：考马斯亮兰0.25 g，甲醇225ml，冰醋酸46ml，ddH2O 225ml。
10.脱色液:甲醇、冰醋酸、ddH2O以3∶1∶6配制而成。
11.转膜缓冲液：48mM Tris-Cl, 39mM甘氨酸、0.037%SDS 、20%的甲醇，pH8.3。
甘氨
酸 2.9g；Tris 5.8g；SDS 0.37g；甲醇200ml；加ddH2O定容至1000ml。
12.0.01M PBS(pH7.4)：NaCl 8.0g；KCl 0.2g；Na2HPO4 1.44g；KH2PO40.24g；加ddH2O
至1000ml
13.显色液：DAB 6.0mg；0.01M PBS 10.0ml；硫酸镍胺0.1ml；H202 1.0μl。
或增强型HRP
－DAB底物显色剂盒
14.FMDV阳性猪血清
15.兔抗猪IgG-HRP酶酶结合物（俗称酶标抗体），购自Sigma公司，产品编号A5670
四、操作步骤
（一）SDS－PAGE
先安装好DYCZ－24D垂直板电泳槽，然后如下操作
1、聚丙烯酰胺凝胶的配制
①分离胶(15%)的配制:
ddH2O 2.3ml 10% SDS 0.1ml
30%储备胶 5.0ml 10% AP 0.1ml
1.5M Tris-HCl
2.5ml TEMED 4μl
小心将上述溶液混匀，注意摇起气泡。
迅速将丙烯酰胺溶液灌注到DYCZ－24D电泳槽的两玻璃板的间隙中，留出灌注积层胶所需的空间（梳子的齿长再加1cm）。
然后，再在丙烯酰胺溶液上小心要覆盖一层水（可灌满）。
将电泳槽垂直放置于室温下。
分离胶聚合完全（约30分钟），将分离胶上的水倒去,并将残存的水珠用滤纸条吸去。
②积层胶（5%）的配制：
ddH2O 1.4 ml 10%SDS 0.02 ml
30%储备胶0.33 ml 10%AP 0.02 ml
1M Tris-HCl 0.25 ml TEMED 2 μl
将上述混合液灌注到分离胶上面的两玻璃板的间隙中,并立即将梳子插入玻璃板间，完全聚合需30min。
2、样品处理：将样品加入等量的2×SDS上样缓冲液，100℃加热3-5min，离心12000g×1min，取上清作SDS-PAGE分析，同时将SDS低分子量蛋白标准品作平行处理。
3、上样: 取10μl诱导与未诱导的处理后的样品加入样品池中,并加入20μl低分子量蛋白标准品作对照。
4、电泳:在电泳槽中加入1 电泳缓冲液，连接电源，电泳时，积层胶电压60V,分离胶电压100V,电泳至溴酚兰行至电泳槽下端停止（约需3hr）。
5、染色:将胶从玻璃板中取出，考马斯亮兰染色液染色，室温4hr。
6、脱色:将胶从染色液中取出,放入脱色液中,多次脱色至蛋白带清晰。
7、凝胶摄像和保存：在图像处理系统下将脱色好的凝胶摄像，结果存于软盘中，凝胶可保存于双蒸水中或7%乙酸溶液中。
SDS－PAGE注意事项
1、实验样品孔与各对照孔所加总蛋白含量要相等：。
2、为达到较好的凝胶聚合效果，缓冲液的pH值要准确，10%APS在一周内使用。
室温较低时，TEMED的量可加倍。
3、未聚合的丙烯酰胺和亚甲双丙烯酰胺具有神经毒性，可通过皮肤和呼吸道吸收，应注意防护。
（二）电转移
1、电泳结束后将胶条割至合适大小，用转膜缓冲液平衡，5min×3次。
2、膜处理：预先裁好与胶条同样大小的6张滤纸和PVDF膜，将膜在甲醇中浸泡15秒，然后再在蒸馏水中浸泡2min，最后在转膜缓冲液中最少平衡5min。
3、转膜：转膜装置从下至上依次按阴极碳板、3层滤纸、凝胶、PVDF膜、3层滤纸、阳极碳板的顺序放好，滤纸、凝胶、PVDF膜精确对齐，每一步去除气泡，上压500g重物，将碳板上多余的液体吸干。
接通电源,恒流1mA/cm2，转移1.0hr 或3mA/cm2，转移30min。
（三）免疫反应：
1、用0.01M PBST洗膜(pH7.4, 0.02%吐温20)，5min ×3次。
2、封闭：将纤维素膜置于一塑料袋中，加封闭液(1%BSA于PBS(pH7.4)中, 0.02%吐温20)，室温下轻轻振荡2-3小时或4℃过夜。
3、封闭液，用0.01M PBS洗膜，5min×3次。
4．加FMDV阳性猪血清，用PBS稀释50倍，37℃作用2hr。
4、加入抗猪酶标抗体（按合适稀释比例用0.01M PBS稀释，液体必须覆盖膜的全部），4℃
放置12hr 或37℃,1hr 。
5、将膜从酶标抗体液中取出，用0.01M PBST 洗膜，5min ×3次。
6、加入显色液，避光显色至出现条带时放入双蒸水中终止反应。
或按试剂盒说明书进行 注意事项
1、一抗、二抗的稀释度、作用时间和温度对不同的蛋白要经过预实验确定最佳条件。
2、显色液必须新鲜配置使用，最后加入H 2O 2。
3、DAB 有致癌的潜在可能，操作时要小心仔细。
五、结果观察
上图左侧A 、B 、C 为SDS －PAGE 结果，右侧E 、F 为印迹， B 、C 与A 相比较，在约40kDa 处有明显的蛋白条带，而E 在相应的相位有阳性染色，而F 却没有， 说明该分子量大约40kDa 的蛋白质分子是FMDV 特异性。
A ：未诱导的工程菌(对照)
B ：诱导的工程菌
C ：诱导工程菌的包涵体
D ：Marker,从上至下分子量分别是94.4、
66.2、43、31、20.1、14.4 kDa E: 诱导工程菌的免疫印迹
F ：未诱导工程菌的免疫印迹(对照)。