Western Blot蛋白免疫印迹法

3 Western blot

3.1 试剂配制

1）30%聚丙烯酰胺储备液（Acr/Bis）：

丙烯酰胺（Acr），29g；N,N-亚甲基双丙烯酰胺（Bis），1g，去离子水溶解，37℃水浴助溶，定容至100mL。0.45μm滤器过滤，棕色瓶4℃避光保存。

2）10%十二烷基硫酸钠（SDS）：

SDS，10g；H2O，80mL。68℃加热溶解，浓HCl调pH至7.2，定容至100mL，室温保存。

3）10%过硫酸铵（AP）：

AP，1g；H2O，10mL。避光，4℃保存。（4℃2周）

4）分离胶缓冲液（1.5MTris-HCl pH8.8）：

Tris，18.17g；H2O 80mL。用浓HCl调pH至8.8，定容至100mL，4℃保存。5）浓缩胶缓冲液（1.0MTris-HCl pH6.8）：

Tris，12.11g；H2O 80mL。用浓HCl调pH至6.8，定容至100mL，4℃保存。6）电泳缓冲液（10×）：

甘氨酸（Glycine），188g；Tris 30.2g；SDS，10g；H2O，800mL。调节pH至8.3，定容至1L，4℃保存（用时稀释为1×）。

7）5×SDS-PAGEloadingBuffer（5mL）：

1MTris-HCl（pH6.8），1.25mL；SDS，0.5g；溴酚蓝（BPB），25mg；甘油，2.5mL；加去离子水定容至5mL。充分混匀，分装成500μL/份，室温保存。使用前每份加入25μLβ-巯基乙醇（2-ME），加入2-ME的loading buffer可在室温下保存一个月左右。

8）考马斯亮蓝染色固定液：

40%双蒸水, 10% 醋酸, 50%甲醇，室温保存

9）考马斯亮蓝染色液：

考马斯亮蓝R-250，250mg；甲醇，45ml；冰醋酸，10ml；H2O，定容至100ml。室温保存。

10）考马斯亮蓝染色脱色液：

醋酸，100ml；乙醇，50ml；dH2O 850ml，充分混合，室温保存

11）膜转移缓冲液：

甘氨酸，2.9g；Tris，5.8g；SDS，0.37g；加H2O 600mL充分溶解，加200mL

甲醇，混匀，定容至1L，室温保存。

12）TBS缓冲液：

NaCl，8.8g；1M Tis-HCL(pH 8.0)，20ml，加入约800 H2O搅拌溶解，定容至1L，

4℃保存。

13）TBST缓冲液：

NaCl，8.8g；1M Tis-HCL(pH 8.0)，20ml，加入约800 H2O搅拌溶解，加入0.5 ml Tween 20后充分混匀，去离子水定容至1L，4℃保存。

14）1M Tis-HCL(pH 8.0)：

Tris 121.1g 置于1L烧杯，加入约800ml去离子水，充分搅拌，加入浓HCL约42ml ，定容至1L，高压灭菌，室温保存。

3.2 Western blot电泳、转膜及显色过程

3.2.1 清洗

将玻璃板洗净，用ddH2O冲洗，然后晾干。封板时保证支架与底座胶条契合，固定时两边同时均匀用力旋动齿轮把手，固定即可，不要用力过大以免压碎玻璃。封好后可装ddH2O试试，确定不漏后再灌胶。

2、制胶

①SDS-PAGE分离胶配方表（12% Gel）

各种组分名称各种凝胶体积对应的各种组分的取样量(ml)

10 ml 15 ml 20 ml

H2O 3.3 4.9 6.6

30%Acrylamid

e

4.0 6.0 8.0

1.5MTris-Hcl

(pH8.8)

2.5

3.8 5.0

10% SDS 0.1 0.15 0.2

10%过硫酸铵

（AP）

0.1 0.15 0.2

TEMED 0.004 0.006 0.008

②SDS-PAGE浓缩胶（5% Acrylamide）配方表

各种组分名

称

各种凝胶体积对应的各种组分的取样量(ml) 4 ml 5 ml 6 ml

H2O 2.7 3.4 4.1 30%Acrylami

de

0.67 0.83 1.0

1.0MTris-Hcl

(pH6.8)

0.5 0.63 0.75

10% SDS 0.04 0.05 0.06

10%过硫酸铵

0.04 0.05 0.06

（AP）

TEMED 0.004 0.005 0.006

3、封胶

①按前面方法配分离胶，加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。灌入2/3的分离胶后应立即封胶，胶上加一层水，液封后的胶凝的更快。（灌胶时开始可快一些，胶面快到所需高度时要放慢速度。操作时胶一定要沿玻璃板流下，这样胶中才不会有气泡。加水液封时要很慢，否则胶会被冲变型。

②当水和胶之间有一条折射线时，说明胶已凝了（至少等30-40min）。再等3min 使胶充分凝固就可倒去胶上层水并用吸水纸将水吸干。

③按前面方法配5%的浓缩胶,加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。将剩余空间灌满浓缩胶然后将梳子插入浓缩胶中。灌胶时也要使胶沿玻璃板流下以免胶中有气泡产生。插梳子时要使梳子保持水平。由于胶凝固时体积会收缩减小，从而使加样孔的上样体积减小，所以在浓缩胶凝固的过程中要经常在两边补胶。

4、拔梳子

灌好浓缩胶，约40-60min凝胶后均匀用力拔除梳子，若上样孔有变形，可用适当粗细的针头拨正。

5、上样

①测完蛋白浓度后，计算含20-40μg蛋白的溶液体积即为上样量。取出上样样品至0.5ml离心管中，加入5×SDS上样缓冲液至终浓度为1×。将加入loading buffer的蛋白样品放沸水中煮5-10分钟，高速离心30s即可上样。上样总体积一般不超过15μl，加样孔的最大限度可加30μl体积。

②加足够的电泳液后开始准备上样，电泳液至少要漫过内测的小玻璃板，外侧漠过底部。所有蛋白样品调至等浓度后上样，样品两侧的泳道用等体积的1×loading buffer上样。

非预染蛋白Maker准备：

1M DTT 2μl与5×loading buffer 20μl混合成稀释液22μl,然后再加入protein MW maker（LOW）5μl、灭菌蒸馏水73μl,混合成蛋白Maker,混合均匀后，煮沸处理5min，分装-20℃保存，取5μl进行10%-15%凝胶电泳。

6、电泳

先稳流30mA电泳至上下胶分界时改稳流45mA[直接调总时间1.5h，到时候直接调电流]。当loading buffer泳动到胶下缘时结束。电泳时间较长时，应用冰块放电泳槽两边防止溶胶。