Western Blot蛋白免疫印迹法

3 Western blot
3.1 试剂配制
1）30%聚丙烯酰胺储备液（Acr/Bis）：
丙烯酰胺（Acr），29g；N,N-亚甲基双丙烯酰胺（Bis），1g，去离子水溶解，37℃水浴助溶，定容至100mL。

0.45μm滤器过滤，棕色瓶4℃避光保存。

2）10%十二烷基硫酸钠（SDS）：
SDS，10g；H2O，80mL。

68℃加热溶解，浓HCl调pH至7.2，定容至100mL，室温保存。

3）10%过硫酸铵（AP）：
AP，1g；H2O，10mL。

避光，4℃保存。

（4℃2周）
4）分离胶缓冲液（1.5MTris-HCl pH8.8）：
Tris，18.17g；H2O 80mL。

用浓HCl调pH至8.8，定容至100mL，4℃保存。

5）浓缩胶缓冲液（1.0MTris-HCl pH6.8）：
Tris，12.11g；H2O 80mL。

用浓HCl调pH至6.8，定容至100mL，4℃保存。

6）电泳缓冲液（10×）：
甘氨酸（Glycine），188g；Tris 30.2g；SDS，10g；H2O，800mL。

调节pH至8.3，定容至1L，4℃保存（用时稀释为1×）。

7）5×SDS-PAGEloadingBuffer（5mL）：
1MTris-HCl（pH6.8），1.25mL；SDS，0.5g；溴酚蓝（BPB），25mg；甘油，2.5mL；加去离子水定容至5mL。

充分混匀，分装成500μL/份，室温保存。

使用前每份加入25μLβ-巯基乙醇（2-ME），加入2-ME的loading buffer可在室温下保存一个月左右。

8）考马斯亮蓝染色固定液：
40%双蒸水, 10% 醋酸, 50%甲醇，室温保存
9）考马斯亮蓝染色液：
考马斯亮蓝R-250，250mg；甲醇，45ml；冰醋酸，10ml；H2O，定容至100ml。

室温保存。

10）考马斯亮蓝染色脱色液：
醋酸，100ml；乙醇，50ml；dH2O 850ml，充分混合，室温保存
11）膜转移缓冲液：
甘氨酸，2.9g；Tris，5.8g；SDS，0.37g；加H2O 600mL充分溶解，加200mL
甲醇，混匀，定容至1L，室温保存。

12）TBS缓冲液：
NaCl，8.8g；1M Tis-HCL(pH 8.0)，20ml，加入约800 H2O搅拌溶解，定容至1L，
4℃保存。

13）TBST缓冲液：
NaCl，8.8g；1M Tis-HCL(pH 8.0)，20ml，加入约800 H2O搅拌溶解，加入0.5 ml Tween 20后充分混匀，去离子水定容至1L，4℃保存。

14）1M Tis-HCL(pH 8.0)：
Tris 121.1g 置于1L烧杯，加入约800ml去离子水，充分搅拌，加入浓HCL约42ml ，定容至1L，高压灭菌，室温保存。

3.2 Western blot电泳、转膜及显色过程
3.2.1 清洗
将玻璃板洗净，用ddH2O冲洗，然后晾干。

封板时保证支架与底座胶条契合，固定时两边同时均匀用力旋动齿轮把手，固定即可，不要用力过大以免压碎玻璃。

封好后可装ddH2O试试，确定不漏后再灌胶。

2、制胶
①SDS-PAGE分离胶配方表（12% Gel）
各种组分名称各种凝胶体积对应的各种组分的取样量(ml)
10 ml 15 ml 20 ml
H2O 3.3 4.9 6.6
30%Acrylamid
e
4.0 6.0 8.0
1.5MTris-Hcl
(pH8.8)
2.5
3.8 5.0
10% SDS 0.1 0.15 0.2
10%过硫酸铵
（AP）
0.1 0.15 0.2
TEMED 0.004 0.006 0.008
②SDS-PAGE浓缩胶（5% Acrylamide）配方表
各种组分名
称
各种凝胶体积对应的各种组分的取样量(ml) 4 ml 5 ml 6 ml
H2O 2.7 3.4 4.1 30%Acrylami
de
0.67 0.83 1.0
1.0MTris-Hcl
(pH6.8)
0.5 0.63 0.75
10% SDS 0.04 0.05 0.06
10%过硫酸铵
0.04 0.05 0.06
（AP）
TEMED 0.004 0.005 0.006
3、封胶
①按前面方法配分离胶，加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。

灌入2/3的分离胶后应立即封胶，胶上加一层水，液封后的胶凝的更快。

（灌胶时开始可快一些，胶面快到所需高度时要放慢速度。

操作时胶一定要沿玻璃板流下，这样胶中才不会有气泡。

加水液封时要很慢，否则胶会被冲变型。

②当水和胶之间有一条折射线时，说明胶已凝了（至少等30-40min）。

再等3min 使胶充分凝固就可倒去胶上层水并用吸水纸将水吸干。

③按前面方法配5%的浓缩胶,加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。

将剩余空间灌满浓缩胶然后将梳子插入浓缩胶中。

灌胶时也要使胶沿玻璃板流下以免胶中有气泡产生。

插梳子时要使梳子保持水平。

由于胶凝固时体积会收缩减小，从而使加样孔的上样体积减小，所以在浓缩胶凝固的过程中要经常在两边补胶。

4、拔梳子
灌好浓缩胶，约40-60min凝胶后均匀用力拔除梳子，若上样孔有变形，可用适当粗细的针头拨正。

5、上样
①测完蛋白浓度后，计算含20-40μg蛋白的溶液体积即为上样量。

取出上样样品至0.5ml离心管中，加入5×SDS上样缓冲液至终浓度为1×。

将加入loading buffer的蛋白样品放沸水中煮5-10分钟，高速离心30s即可上样。

上样总体积一般不超过15μl，加样孔的最大限度可加30μl体积。

②加足够的电泳液后开始准备上样，电泳液至少要漫过内测的小玻璃板，外侧漠过底部。

所有蛋白样品调至等浓度后上样，样品两侧的泳道用等体积的1×loading buffer上样。

非预染蛋白Maker准备：
1M DTT 2μl与5×loading buffer 20μl混合成稀释液22μl,然后再加入protein MW maker（LOW）5μl、灭菌蒸馏水73μl,混合成蛋白Maker,混合均匀后，煮沸处理5min，分装-20℃保存，取5μl进行10%-15%凝胶电泳。

6、电泳
先稳流30mA电泳至上下胶分界时改稳流45mA[直接调总时间1.5h，到时候直接调电流]。

当loading buffer泳动到胶下缘时结束。

电泳时间较长时，应用冰块放电泳槽两边防止溶胶。

7、转膜
①剥胶：轻启玻璃板，将胶卸下，切除浓缩胶及无用胶，右上切角标记，在冷的电转液中平衡20-60min。

②材料准备：转一张膜需要2张滤纸（伯乐专用滤纸）和1张0.45um PVDF膜，切滤纸和膜时一定要戴手套，因为手上的蛋白会污染膜。

将切好的硝酸纤维素膜置于水上浸2h才可使用。

用镊子捏住膜的一边轻轻置于有超纯水的平皿里，要使膜浮于水上，只有下层才与水接触。

这样由于毛细管作用可使整个膜浸湿。

若膜沉入水里，膜与水之间形成一层空气膜，这样会阻止膜吸水。

③处理：将与胶同样大小的滤纸放在转移液中浸泡片刻，PVDF膜需浸泡甲醇
1-2min，再孵育于冰的电转液中5min。

④电转仪转膜：
A、打开保护罩，按照如下准备凝胶三明治：
B、从底部铂金正极开始放置：
●预湿-滤纸
●预湿-膜
●已平衡的胶
●预湿-滤纸
注意：每层之间赶走气泡
C、连接顶部不锈钢阴极，盖上保护罩
D、不同蛋白需要不同优化的条件：
参考范围：
小胶10V 30min 或者15V 15min
大胶25V 30min 或者15V 60min
注意：当前不要超过25V，且大胶不要超过3mA/cm2、小胶不要超过5.5 mA/cm2 E、关闭电源，拔掉电极，移除胶
注：为了防止溶胶，可将转移缓冲液提前放4℃冰箱预冷过夜
⑤膜上蛋白检测：丽春红
2%的丽春红储备液（10×）：0.4g丽春红、6g三氯乙酸、6g磺基水杨酸溶于20ml。

丽春红染色工作液：2%的丽春红储备液1:10稀释，即加9倍的ddH2O
染色方法：将膜放入TBST洗一次，再置于丽春红染色工作液中，在室温下摇动染色5分钟，大量的水洗膜直至水变清无色，marker条带处用铅笔做好标记。

[回收]
PVDF膜需用甲醇再活化后用TBST洗后进行封闭。

8、膜的封闭
膜用TBST洗完后，移至含有封闭液[加入一定量的磷酸酶抑制剂1-2ul/20ml]的平皿中，室温下脱色摇床上摇动封闭1h。

再用TBST洗5秒，进入下一步抗体的孵育。

配制5%脱脂奶粉或BSA溶液：每100ml TBST中加入5g脱脂奶粉或BSA，混匀后过滤，如不过滤会导致膜污染上细微黑颗粒。

9、一抗的孵育
一抗的准备：将一抗按适当的比例用抗体稀释液稀释。

[加入一定量的磷酸酶抑制剂1-2ul/20ml]
孵育buffer：按抗体说明书建议的稀释倍数，用TBST稀释一抗。

一般参考推荐的稀释倍数1:100-1:3000，[1:1000]一抗浓度过高会导致产生非特异性条带。

将PVDF膜浸没于含有一抗的抗体稀释液中室温（25℃左右）轻摇3小时或放4℃冰箱过夜。

若放入4℃冰箱过夜则第二天还应放室温缓慢摇荡1小时。

10、洗涤：一抗孵育结束后，用TBST漂洗膜后再浸洗三次（漂洗后应换容器浸洗），每次10min，以去除残留的一抗。

洗涤结束后进行二抗的孵育。

11、二抗的孵育
孵育buffer和稀释倍数：用TBST按说明书推荐的倍数稀释二抗。

常规稀释倍数1:1000-1:20,000[1:1000]，二抗的浓度过高也会导致非特异性条带。

根据一抗来源选择合适的二抗（HRP标记），按相应比例用抗体稀释液稀释，室温轻摇1-2小时。

12、洗涤：
二抗孵育结束后，用TBST漂洗膜后再浸洗三次（漂洗后应换容器），每次10min，最后用TBS清洗一次。

注：抗体稀释液稀释的一抗或二抗可回收重复利用数次，抗体稀释液稀释后的抗体可4℃保存约半个月时间。

13、显色-DAB辣根过氧化物酶显色试剂盒（生工）
①溶液A在使用之前，37℃温育10分钟，以免产生沉淀。

②在免疫印迹实验中，先将相应的HRP（辣根过氧化物酶）标记的二抗覆盖膜后，在37℃的情况下，于震荡器[摇床]上，震荡[轻摇]一个半小时左右，再用TBST 洗涤膜3~4次，最后一次用TBS洗涤膜，再将膜转移到阴暗处。

③显色前在干净棕色瓶子中配制显色工作液，充分混匀。

反应液10 ml [大培养皿] 5ml [小培养皿]
溶液A 200 μl 100ul
溶液B 100 μl 50ul
溶液C 20 μl 10ul
④在阴暗处，将显色液加入膜上，将膜覆盖，在37℃的情况下，摇床反应5min 左右即可，这时棕褐的条带出现
⑤倒掉反应液，双蒸水冲洗条带3~4次，[自然干燥]
⑥照相记录实验结果。