蛋白免疫印迹杂交(Western Blot)技术手册

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Western Blot实验指导教程

蛋白免疫印迹杂交（Western Blot，WB）一、蛋白提取与样本制备（一）操作步骤1.提前解冻RIPA（蛋白裂解液），一定要完全融化；2.根据样本数配制混合溶液：PMSF（丝氨酸蛋白酶抑制剂）：RIPA=1：100，现用现配）；3.裂解组织：每个样品称取50mg，加1ml混合液，在冰上用组织剪剪减为碎屑，电动匀浆后4 ℃静置2h使其充分裂解，离心12000g，4 ℃15min，取上清；4.蛋白定量：1)取少量上清稀释10倍：2ul上清，加18ul生理盐水；2)标准品按5ug/ul至0.3125ug/ul的梯度进行倍比稀释（制作平行样的标准曲线：5mg/ml标准品取80ul + 生理盐水80ul）；3)配制显色剂BCA混合液：a液：b液=50:1。

配制量=200ul*（孔数+6）；4)加入稀释完成的各样到酶标板的孔中及BCA混合液200ul/孔；5)贴上封口胶，37℃震荡混匀30min；6)562nm波长处测吸光度OD；7)根据数据制图、添加趋势线、方程及R2。

5.样品OD值带入方程，计算出各样本原液蛋白浓度；6.样本蛋白浓度均一化（一般样品蛋白浓度为3-4mg/ml）；7.100℃变性5min。

8.分装并存于-20 ℃，避免反复冻融。

二、配置相关试剂（一）10%的SDS（戴口罩称取）：试剂剂量SDS （g）10双蒸水（ml）80用磁力加热搅拌助溶，然后定容至100ml。

室温保存，如在长期保存中出现沉淀，加温溶化后，仍可使用。

（二）1.5M Tris/HCl（pH8.8）试剂剂量Tris base （g）18.17双蒸水（ml）80用浓盐酸调至pH 8.8，最后定容至100ml。

室温下保存。

（三）0.5M Tris/HCl（pH6.8）试剂剂量Tris base （g） 6.06双蒸水（ml）80用浓盐酸调至pH6.8，最后定容至100ml。

室温下保存。

（四）丙/双丙（戴口罩称取）试剂剂量丙烯酰胺（Acr）（g）75亚甲双丙烯酰胺（g） 2去离子水（ml）230加热溶解后，定容至250ml，4℃棕色瓶避光保存。

Western Blot使用技术手册

生物医药基地western blot技术手册1.western blot 主要试剂的配方1.1 5×电泳缓冲液配方(1L)注意事项：a.加水时应尽量避免气泡的产生，否则会造成过多SDS的损耗。

b.配制好的溶液放于4度冰箱保存，使用时用纯水稀释至1×使用。

1.2 1×转膜液配方（1L）注意事项：a.加入适量的纯水，用磁力转子将各组分溶解后加入甲醇溶液，最后用纯水定容至1L（甲醇气味大，通风厨内配制，并注意戴口罩）。

b.加水时应尽量避免气泡的产生，否则会造成过多SDS的损耗。

1.3 10×TBS配方（1L）注意事项：a.加入适量的纯水溶解各组分后，使用浓盐酸或浓氢氧化钠溶液调节溶液的PH至7.6（一般溶解后溶液是偏碱的，所以选用浓盐酸调节PH至7.6即可）。

b.使用PH计调节溶液的PH前，要按照说明书校准PH计。

c.PH调节至7.6后，用纯水定容至1L，使用时稀释10倍至1×使用。

d.配制TBST时，在1×TBS中按照1:1000的比例加入吐温20充分混匀即可。

1.4 30%丙烯酰胺单体储存液配方（100ml）注意事项：a. 将各组分溶于总体积为60ml的纯水中，加热至37℃完全溶解，用纯水定容至100ml。

b. 用装0.45µm膜的滤器过滤，置于棕色瓶中保存于4℃冰箱保存。

c. 丙烯酰胺有神经毒性，操作时戴手套，并注意不要造成实验台面等的污染。

1.5 上液（1M Tris-HCl PH=6.8）配方（50ml）注意事项：用浓盐酸调节PH至6.8，再用三蒸水定容至50ml，4℃冰箱保存。

1.6下液（1M Tris-HCl, pH8.8 ）（50ml）注意事项：用浓盐酸调节PH至8.8，再用三蒸水定容至50ml，4℃冰箱保存。

2. Western Blot 主要流程2.1蛋白样品的提取2.1.1常用裂解液及其特点2.1.2 医药基地常用蛋白质提取方法⑴RIPA强裂解法：a. 取适量胰酶消化细胞（针对对贴壁细胞，悬浮细胞可省略此步），收取细胞，PBS洗两遍，600g离心5min，尽量去除PBS，向细胞沉淀中加入适量的预加了蛋白酶抑制剂PMSF的RIPA强裂解液（80ul ——200ul不等，根据自己细胞量的多少定）。

蛋白免疫印迹杂交（WesternBlot）技术手册

蛋白免疫印迹杂交 Western Blot 技术手册蛋白免疫印迹杂交 Western Blot WB 是将蛋白样本通过聚丙烯酰胺电泳按分子量大小分离再转移到杂交膜blot 上然后通过一抗/二抗复合物对靶蛋白进行特异性检测的方法。

WB是进行蛋白质分析最流行和成熟的技术之一。

本指南讨论Western Blot操作方法及常见问题分析有助于成功完成WB。

A 蛋白样本提取制备1 细胞或组织裂解2 蛋白酶和磷酸酶抑制剂3 蛋白定量4 电泳上样样品的准备B 电泳 1 PAGE胶的制备2蛋白分子量Marker 3 阳性对照4 内参对照5 上样与电泳 C 转膜与显色Western Blot 1 胶中蛋白的检测2 蛋白转膜3 膜上蛋白的检测丽春红4膜的封闭 5 一抗的孵育6 二抗的孵育7 显色 D 常见问题分析与解决方案附录1 WB实验试剂配制方法附录2 SDS-PAGE胶的配制2WB概述: 检测原理: 3A 蛋白样本提取制备蛋白样品制备是Western Blotting的第一步更是决定WB成败的关键步骤总体原则和注意事项 1 尽可能提取完全或降低样本复杂度只集中于提取目的蛋白通过采用不同提取方法或选择不同的试剂盒产品 2 保持蛋白的处于溶解状态通过裂解液的PH 盐浓度表面活性剂、还原剂等的选择 3 提取过程防止蛋白降解、聚集、沉淀、修饰等低温操作加入合适的蛋白酶和磷酸酶抑制剂 4 尽量去除核酸多糖脂类等干扰分子通过加入核酸酶或采取不同提取策略 5 样品分装长期于-80℃中保存避免反复冻融。

A-1 细胞或组织裂解A-1-1 细胞裂解裂解液Lysis buffer或商品化蛋白抽提试剂盒的选择目的蛋白分布定位推荐裂解液Lysis buffe 推荐试剂盒全细胞NP-40 or RIPA 附录1 全蛋白抽提试剂盒细胞质可溶蛋白 Tris-HCl 附录1 胞浆蛋白和核蛋白抽提试剂盒线粒体蛋白提取试剂盒细胞质细胞骨架等不溶蛋白Tris-Triton 附录1 蛋白分级抽提试剂盒细胞质磷酸化蛋白磷酸化蛋白抽提试剂盒细胞膜NP-40 or RIPA 附录1 膜蛋白抽提试剂盒蛋白分级抽提试剂盒细胞核RIPA 附录1 核蛋白抽提试剂盒线粒体RIPA 附录1 线粒体蛋白抽提试剂盒亚细胞定位蛋白抽提试剂盒细胞裂解操作方法 1 培养的细胞经预冷的PBS漂洗2次裂解液中加入蛋白酶和磷酸酶抑制剂种类与量见本节2 2 吸净PBS 加入预冷的裂解液 1 ml per 107 cells/100mm dish/150cm2 flask 0.5ml per 5x106 cells/60mm dish/75cm2 flask. 3 用细胞刮子刮取贴壁细胞将细胞及裂解液温和地转移至预冷的微量离心管中 4 4℃摇动30 min 5 4℃离心12000 rpm 20 min 根椐细胞种类不同调整离心力 6 轻轻吸取上清转移至新预冷的微量离心管中置于冰上即为蛋白样本弃沉淀. A-1-2 组织裂解 1 用灭菌的预冷的工具分离目的组织尽量置于冰上以防蛋白酶水解 2 将组织块放在圆底的微量离心管或Eppendorf管中加入液氮冻结组织于冰上均质研磨长期可保存于-80°C 3 每约5 mg加入约300 μl 预冷的裂解液lysis buffer 冰浴匀浆后置于4℃摇动2小时裂解液体积与组织样本量有适当比例最终的蛋白浓度至少达到0.1 mg/ml 理想的蛋白浓度应为1-5 mg/ml. 4 4℃离心12000 rpm 20 min 轻轻吸取上清转移至新预冷的微量离心管中置于冰上即为蛋白样本弃沉淀A-2 蛋白酶和磷酸酶抑制剂 4 推荐购商品化蛋白酶和磷酸酶抑制剂复合试剂盒或COOKTAIL 或按下表配制备注其中Sodium orthovanadate 配制活化方法如下所有步聚均需在通风橱中进行 1. 用双蒸水配制100 mM 正矾酸钠溶液. 2. 用盐酸HCl 调至pH 9.0 3. 煮沸至溶液无色尽量减少水分挥发. 4. 冷却至室温 5. 再调pH 至9.0 6. 再煮沸至无色7. 重复上述过程直至溶液煮沸冷却后达pH 9.0 8. 用水定容至原体积9. 分装保存于- 20°C. 溶液变黄则弃之不用. A-3 蛋白定量Bradford 法Lowry 法或BCA 法均有商品化试剂盒可选择操作简单、需分光光度计或酶标仪小牛血清白蛋白BSA 作为标准曲线。

western blotting(蛋白免疫印迹)

7
蛋白样品的制备
① SDS是一种很强的阴离子表面活性剂，它可以断开分子内和分
子间的氢键,破坏蛋白质分子的二级和三级结构。
② 强还原剂巯基乙醇（或二硫苏糖醇，DTT）可以断开二硫键，破坏蛋白质的四级结构。使蛋白质分子被解聚成肽链形成单链分子。解聚后的侧链与SDS充分结合形成带负电荷的蛋白质-SDS 胶束。 ③ 蛋白质的电泳迁移率主要决定于亚基的相对分子质量，而与其形状及所带电荷的性质无关。
电泳缓冲液：pH8.3 Tris- 甘氨酸系统
12
PAGE：聚丙烯酰胺凝胶电泳
聚丙烯酰胺凝胶(polyacrylamide gel，简称PAG): 单体丙烯酰胺(acrylamide，简称Acr) 交联剂 N,N-甲叉双丙烯酰胺加速剂 N,N,N,N-四甲基乙二胺(TEMED) 催化剂过硫酸铵三维网状结构的凝胶，该凝胶化学惰性强，具有一定的机械强度和透明度，是良好的电泳介质，以此凝胶为支持物的电泳称为聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamide gel electrophoresis，简称 PAGE)。
对策
5. 抗体浓度过高
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Thanks！
36
压太高。转膜过程注意降温
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四、SDS-PAGE常见问题
背景太高
原因
1. 2. 3. 4. 膜没有均匀浸湿膜或者缓冲液污染封闭不充分抗体与封闭剂出现交叉反应
1. 转膜前用100%甲醇将膜完全浸湿 2. 拿取膜与吸水纸时要戴手套，更换新鲜转膜缓冲液 3. 检测一抗、二抗与封闭剂是否有交叉反应 4. 杂交前检测一抗、二抗的工作浓度
蛋白质免疫印迹技术详解
1
主要内容
一、Western Blot 简介二、Western Blot 一般流程

蛋白免疫印迹杂交技术手册

6. 根据所测样品的吸光值，在标准曲线上即可查得相应的蛋白含量（μg），除以样品稀释液总体积（100
μL），乘以样品稀释倍数即为样品实际浓度（单位：μg/μL）。
A-4 电泳上样样品的准备
5
A-4-1 变性、还原蛋白样本一般的抗体只能识别抗原蛋白中的部份序列结构（表位），因此，为使抗体能够达到结合该表位而需要将
1. 标准曲线的绘制：取一块酶标板，按照下表加入试剂
孔号
0
1
2
3
4
5
6
7
蛋白标准溶液（μL）
0
1
2
4
8
12 16 20
去离子水（μL）
20 19 18 16 12
8
4
0
对应蛋白含量（μg）
0 0.5 1.0 2.0 4.0 6.0 8.0 10.0
2. 根据样品数量，按 50 体积 BCA 试剂 A 加 1 体积 BCA 试剂 B（50:1）配制适量 BCA 工作液，充分混
A-4-2 天然和非还原样本某些抗体识别的表位是非连续氨基酸构成的蛋白三维结构，此种情况则需要进行非变性的 WB，抗体的说明
书一般会标注，这种非变性电泳不加 SDS，样本也不需煮沸。某些抗体仅识别蛋白的非还原态，如某些 cysteine 基的氧化态，因此 loading buffer 和电泳液中不加入
3 用细胞刮子刮取贴壁细胞，将细胞及裂解液温和地转移至预冷的微量离心管中，
4 4℃摇动 30 min 5 4℃离心 12,000 rpm，20 min（根椐细胞种类不同调整离心力） 6 轻轻吸取上清，转移至新预冷的微量离心管中置于冰上，即为蛋白样本，弃沉淀.
A-1-2 组织裂解 1 用灭菌的预冷的工具分离目的组织，尽量置于冰上以防蛋白酶水解， 2 将组织块放在圆底的微量离心管或 Eppendorf 管中，加入液氮冻结组织于冰上均质研磨，长期可保存于 -80°C， 3 每约5 mg加入约300 μl 预冷的裂解液lysis buffer，冰浴匀浆后置于4℃摇动2小时，裂解液体积与组织样本量有适当比例，（最终的蛋白浓度至少达到0.1 mg/ml, 理想的蛋白浓度应为1-5 mg/ml). 4 4℃离心 12,000 rpm，20 min，轻轻吸取上清，转移至新预冷的微量离心管中置于冰上，即为蛋白样本，弃沉淀,

Western Blot(免疫印迹法)

Western Blot(免疫印迹法)主要包括以下4个基本步骤：⏹样品制备⏹电泳分离⏹蛋白的膜转移⏹免疫杂交与显色――蛋白检测溶液和试剂⏹1X 磷酸盐缓冲液(PBS)⏹Modified RIPA bufferTris-HCl: 50 mM, pH 7.4 ; NP-40: 1% ;Na-deoxycholate: 0.25% ;NaCl: 150 mM ;EDTA: 1 mM ;PMSF: 1 mM ;Aprotinin, leupeptin, pepstatin: 1microgram/ml each ;Na3VO4: 1 mM ;NaF: 1 mM⏹1X SDS 样品缓冲液62.5 mMTris-HCl (pH 6.8 于25°C), 2% w/v SDS, 10%甘油,50 mM DTT,0.01% w/v溴酚蓝⏹转移缓冲液25 mM Tris base, 0.2 M 甘氨酸, 20%甲醇(pH 8.3)⏹10X Tris缓冲盐(TBS)准备1L 10X TBS: 24.2 g Tris base, 80 g NaCl;用1N HCl调pH为7.6⏹脱脂奶粉或BSA⏹甲醇⏹TBS/T缓冲液1X TBS, 0.1% Tween-20⏹封闭缓冲液（TBS/T）1X TBS, 0.1% Tween-20加5% w/v脱脂奶粉或BSA⏹一抗的稀释1X TBS, 0.1% Tween-20 加5% BSA (多抗)或5%脱脂奶粉(单抗)Note:一般来说, BSA被推荐用于多克隆抗体，脱脂奶粉用于单克隆抗体，这样可得到较高的信噪比。

抗体的稀释度参考抗体说明书或根据实验确定。

⏹预染的蛋白质Marker，可用于监测转膜的效率样品制备原始样品可为细胞、组织、培养上清、免疫沉淀或亲和纯化的蛋白，以下为定性检测目的蛋白时细胞样品的处理方法，其余的样品制备方法参阅相关文献。

1．培养细胞或药物处理。

2．弃培养基，用1X PBS漂洗细胞2次，去尽残留培养基。

蛋白质免疫印迹(Western Blot )实验步骤和原理及注意事项

蛋白质免疫印迹（Western Blot ）实验步骤和原理及注意事项1.收集蛋白样品(Protein sample preparation)可以使用适当的裂解液。

收集完蛋白样品后，为确保每个蛋白样品的上样量一致，需要测定每个蛋白样品的蛋白浓度。

根据所使用的裂解液的不同，需要采用适当的蛋白浓度测定方法。

因为不同的蛋白浓度测定方法对于一些去垢剂和还原剂等的兼容性差别很大。

BCA法。

2. 电泳(Electrophoresis)(1) SDS-PAGE凝胶配制(2) 样品处理在收集的蛋白样品中加入适量浓缩的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液。

例如2X或5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液。

使用5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液可以减小上样体积，在相同体积的上样孔内可以上样更多的蛋白样品。

100℃或沸水浴加热3-5分钟，以充分变性蛋白（根据蛋白分子的大小，煮沸时间可适当变化，一般不低于5min。

煮沸只是变性蛋白，而不是分解，一般加了抑制酶不会分解。

煮沸对于SDS-PAGE凝胶电泳是必须的，只有煮沸,才能消除蛋白质的立体二级结构,伸展为一维线性结构,所以一般来讲二聚体都会解体,才能完全按照分子量跑电泳,加的蛋白Marker才有指示分子量的意义。

蛋白样品变性后与SDS充分结合，SDS使每个氨基酸带相同的电荷,使整个蛋白呈线性结构. 抗体因为要是线性表位结合的，100度煮10min 后13000,离心5分钟,取上清电泳,因为沉淀会导致拖尾.也可以取上清到另一管,4度可以放一周备再次电泳）。

(3)电泳i.清洗玻璃板：一只手扣紧玻璃板，另一只手蘸点洗衣粉轻轻擦洗。

两面都擦洗过后用自来水冲，再用蒸馏水冲洗干净后立在筐里晾干。

ii.灌胶与上样（1）玻璃板对齐后放入夹中卡紧。

然后垂直卡在架子上准备灌胶。

（操作时要使两玻璃对齐，以免漏胶。

）（2）配10%分离胶，加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。

灌胶时，可用10 ml枪吸取5 ml胶沿玻璃放出，待胶面升到绿带中间线高度时即可。

WesternBlot蛋白免疫印迹法

3 Western blot3.1试剂配制1）30%聚丙烯酰胺储备液（Acr/Bis）：丙烯酰胺（Acr）, 29g；N,N-亚甲基双丙烯酰胺（Bis）, 1g,去离子水溶解，37℃ 水浴助溶，定容至100mL。

0.45M m滤器过滤，棕色瓶4℃避光保存。

2）10%十二烷基硫酸钠（5口5）：SDS，10g；H2O，80mL。

68℃加热溶解，浓HCl 调pH 至7.2，定容至100mL，室温保存。

3）10%过硫酸铵（AP）：AP，1g；H2O，10mL。

避光，4℃保存。

（4℃2 周）4）分离胶缓冲液（1.5MTris-HCl pH8.8）：Tris，18.17g；H2O 80mL。

用浓HCl 调pH 至8.8，定容至100mL，4℃保存。

5）浓缩胶缓冲液（1.0MTris-HCl pH6.8）：Tris，12.11g；H2O 80mL。

用浓HCl 调pH 至 6.8，定容至100mL，4℃保存。

6）电泳缓冲液（10X）：甘氨酸（Glycine），188g；Tris 30.2g；SDS，10g；H2O, 800mL。

调节pH 至8.3, 定容至1L，4℃保存（用时稀释为1义）。

7）5X SDS-PAGEloadingBuffer （5mL）：1MTris-HCl（pH6.8），1.25mL；SDS，0.5g；澳酚蓝（BPB），25mg；甘油，2.5mL；加去离子水定容至5mL。

充分混匀，分装成500M L/份，室温保存。

使用前每份加入25M L p -巯基乙醇（2-ME），加入2-ME的loading buffer可在室温下保存一个月左右。

8）考马斯亮蓝染色固定液：40%双蒸水，10%醋酸,50%甲醇，室温保存9）考马斯亮蓝染色液：考马斯亮蓝R-250，250mg；甲醇，45ml；冰醋酸，10ml；H2O，定容至100ml。

室温保存。

10）考马斯亮蓝染色脱色液：醋酸，100ml；乙醇，50ml；dH2O 850ml，充分混合，室温保存11）膜转移缓冲液：甘氨酸，2.9g；Tris，5.8g；SDS，0.37g；力口H2O 600mL 充分溶解，加200mL 甲醇，混匀，定容至1匕，室温保存。

蛋白免疫印迹（WesternBlot）

蛋白免疫印迹（WesternBlot）1.4.9 细胞裂解液50mM Tris-Cl (pH 8.0) ，1% NP-40， 150mM NaCl，0.5%去氧胆酸钠及0.1% SDS1.4.10 PMSF储存液（100mmol/L）称取PMSF17.4mg,溶于1ml异丙醇，分装后储存于－20℃。

1.4.11 5×Tris甘氨酸电泳缓冲液去离子水 500ml，Tris碱 15.1g，甘氨酸 94g，10%(w/v)电泳级SDS 50ml，补去离子水至1000ml，使用前做5×稀释。

1.4.12转膜缓冲液Tris碱3.03g，甘氨酸14.4g，甲醇200ml，补ddH2O 至1000ml , 每次配完可用2～3 次，现用现配。

4℃避光保存。

1.4.13 1.5MTris－HCl(PH8.8)Tris碱18.17g,ddH2O 80ml,浓HCL调PH8.8，定容100ml。

1.4.14 1.0MTris－HCl（PH6.8）Tris碱12.11g,ddH2O 80ml,浓HCL调PH6.8，定容100ml。

1.4.15 10%SDSSDS 10g，ddH2O定容100ml。

1.4.16 30%丙烯酰胺（29：1）丙烯酰胺29g，N，N’-Y亚甲双丙烯酰胺1g，温热去离子水分别溶解上述后,再补去离子水至100ml.滤纸过滤,储于棕色试剂瓶中,4℃保存一月。

1.4.17 10×TBST缓冲液浓度为100mmol/L Tris-HCl pH 8.0；1500 mmol/L NaCl；0.2%Tween-20，补水至1000ml. 高压灭菌，4℃保存，使用前再做10 倍稀释。

1.4.18 封闭液（5%脱脂奶粉）脱脂奶粉 5g，1×TBST 80ml,充分溶解后补1×TBST 至100ml。

1.4.19 10%过硫酸胺APS（4℃避光保存）APS 10g，ddH2O定容100ml。

westernblotting实验操作步骤讲解

westernblotting实验操作步骤讲解蛋⽩免疫印迹杂交（Western Blot, WB）WB是将蛋⽩样本通过聚丙烯酰胺电泳按分⼦量⼤⼩分离，再转移到杂交膜上，然后通过⼀抗/⼆抗复合物对靶蛋⽩进⾏特异性检测的⽅法。

WB 是进⾏微量蛋⽩质分析⽐较成熟的技术之⼀。

以下是总结Western Blot 操作⽅法及常见问题分析，有助于成功完成WB。

A第⼀部分：蛋⽩样本提取制备蛋⽩样品制备是Western Blotting的第⼀步，更是决定WB成败的关键步骤，总体原则和注意事项：1.尽可能提取完全或降低样本复杂度只集中于提取⽬的蛋⽩（通过采⽤不同提取⽅法或选择不同的试剂盒产品）；2.保持蛋⽩处于溶解状态（通过裂解液的pH 、盐浓度、表⾯活性剂、还原剂等的选择）；3.提取过程防⽌蛋⽩降解、聚集、沉淀、修饰等，（低温操作，加⼊合适的蛋⽩酶和磷酸酶抑制剂）；4.尽量去除核酸，多糖，脂类等⼲扰分⼦（通过加⼊核酸酶或采取不同提取策略）；5.样品分装，长期于-80℃中保存，避免反复冻融。

⽅法的选择◆⾃⾏配制抽提试剂，根据⽂献⽅法或经验提取；◆购买商品化试剂盒，按其说明书的⽅法提取。

Example 1：实验中提取肾脏总蛋⽩，具体实验过程如下：1.提前⼀天4℃解冻RIPA，⼀定要完全融化；配PBS（⽤于细胞试验则需⾼压）；2.配制裂解液：PMSF:RIPA=1:99,PMSF终浓度为100mM（根据样本数配制所需的量，临⽤临配）；3.裂解组织：每个样品称取100mg，加1ml裂解液，匀浆后4℃静置2h使其充分裂解，14000g，4℃离⼼10min，取上清。

4.蛋⽩定量：取少量上清稀释30倍蛋⽩定量，然后计算出各样本原液蛋⽩浓度。

注意由于裂解液⾥含有较⾼浓度的洗涤剂，蛋⽩定量不能选⽤Bradford法，可以选⽤改良的Lowry’s法或者BCA法。

5.样品蛋⽩浓度均⼀化：根据蛋⽩定量计算的结果将各样品蛋⽩浓度调整⼀致。

(完整版)蛋白免疫印迹(westernblot)实验

蛋白免疫印迹（western blot）实验实验步骤：一、试剂准备1. SDS-PAGE试剂：见聚丙烯酰胺凝胶电泳实验。

2. 匀浆缓冲液：1.0 M Tris-HCl(pH 6.8) 1.0 ml；10%SDS 6.0 ml；β-巯基乙醇 0.2 ml；ddH2O 2.8 ml。

3. 转膜缓冲液：甘氨酸 2.9 g；Tris 5.8 g；SDS 0.37 g；甲醇200 ml；加ddH2O定容至1000 ml。

4. 0.01 M PBS(pH7.4)：NaCl 8.0 g；KCl 0.2 g；Na2HPO4 1.44 g；KH2PO4 0.24 g；加ddH2O至1000 ml。

5. 膜染色液：考马斯亮兰 0.2 g；甲醇80 ml；乙酸2 ml；ddH2O118 ml。

包被液（5%脱脂奶粉，现配）：脱脂奶粉1.0 g 溶于20 ml的0.01 M PBS中。

6. 显色液：DAB 6.0 mg；0.01 M PBS 10.0 ml；硫酸镍胺 0.1 ml；H202 1.0 μl。

【晶莱生物】二、蛋白样品制备1.单层贴壁细胞总蛋白的提取（1）倒掉培养液，并将瓶倒扣在吸水纸上使吸水纸吸干培养液（或将瓶直立放置一会儿使残余培养液流到瓶底然后再用移液器将其吸走）。

（2）每瓶细胞加3 ml 4℃预冷的PBS（0.01M pH7.2～7.3）。

平放轻轻摇动1 min洗涤细胞，然后弃去洗液。

重复以上操作两次，共洗细胞三次以洗去培养液。

将PBS弃净后把培养瓶置于冰上。

（3）按1ml裂解液加10 μl PMSF（100 mM），摇匀置于冰上。

（PMSF要摇匀至无结晶时才可与裂解液混合。

）（4）每瓶细胞加400 μl含PMSF的裂解液，于冰上裂解30 min，为使细胞充分裂解培养瓶要经常来回摇动。

（5）裂解完后，用干净的刮棒将细胞刮于培养瓶的一侧（动作要快），然后用枪将细胞碎片和裂解液移至1.5 ml离心管中。

（整个操作尽量在冰上进行。

WesternBlot实验实用技术手册总结

Western Blot 实验技术手册Western Blot 是通过聚丙烯酰胺凝胶电泳将蛋白根据分子量大小分开，然后转移到固相载体（杂交膜）上，然后通过抗原抗体反应检测杂交膜上的靶蛋白是否存在，从而检测到靶蛋白在待检测样本中的表达情况。

目前 Western Blot 已经是蛋白检测的最常用和成熟的技术之一 .一、 Western Blot 基本操作流程图细胞 / 组织蛋白提取↓ 蛋白定量、蛋白变性上样、电泳↓一转膜↓封闭↓孵育一抗↓洗膜孵育二抗↓洗膜底物孵育↓曝光或显色二. Western Blot 操作步骤1.蛋白提取、处理蛋白提取的质量直接决定着WB 结果的好坏，因此，根据样本类型和检测类型选择合适的蛋白制备方法是至关重要的。

使用适当的裂解液裂解贴壁细胞、悬浮细胞或者组织样品.对于贴壁培养的细胞，经预冷的PBS 漂洗 2 次，裂解液中加入蛋白酶和磷酸酶抑制剂，然后吸净 PBS，加入预冷的裂解液，最后用细胞刮子刮取贴壁细胞，将细胞及裂解液温和地转移至预冷的微量离心管中，4℃离心 12,000 rpm ，20 min（根椐细胞种类不同调整离心力），轻轻吸取上清，转移至新预冷的微量离心管中置于冰上，即为蛋白样本，弃沉淀.对于组织样品，用灭菌的预冷的工具分离目的组织，尽量置于冰上以防蛋白酶水解，将组织块放在圆底的微量离心管或Eppendorf 管中，加入液氮冻结组织于冰上均质研磨，长期可保存于 -80 °C，每约 5 mg 加入约 300 μl预冷的裂解液lysis buffer ，冰浴匀浆后置于4℃摇动 2 小时，裂解液体积与组织样本量有适当比例，（最终的蛋白浓度至少达到0.1 mg/ml,理想的蛋白浓度应为 1-5 mg/ml). ，4℃离心 12,000 rpm ， 20 min ，轻轻吸取上清，转移至新预冷的微量离心管中置于冰上，即为蛋白样本，弃沉淀提取蛋白后进行蛋白的定量，蛋白的快速定量方法主要蛋白本身的发色基团，或者与其他显色剂反应产生的紫外吸收来进行定量.目前常用的主要有直接紫外吸收法，Bradford 法、和 Lorry 法或 BCA 法，一般推荐用 BCA 法 .BCA 测定方法如下:A ．酶标板操作1.标准曲线的绘制：取一块酶标板，按照下表加入试剂孔号 1 2 3 4 5 6 7 8蛋白标准溶液（μL）0 1 2 4 8 12 16 20去离子水（μL）20 19 18 16 12 8 4 0对应蛋白含量（μg）0 0.5 1.0 2.0 4.0 6.0 8.0 10.02、根据样品数量，按 50 体积 BCA 试剂 A 加 1 体积 BCA 试剂 B（ 50:1）配制适量 BCA 工作液，充分混匀；3、各孔加入 200 μ L BCA工作液；4、把酶标板放在振荡器上振荡30sec，37℃放置 30 分钟，然后在 562nm 下比色测定。

(完整版)WesternBlot(免疫印迹法)实验方法步骤.doc

Western Blot( 免疫印迹法 )实验方法步骤发布日期 :2008-8-25热门指数:4360Western Blot( 免疫印迹法 )主要包括以下 4 个基本步骤：n样品制备n电泳分离n蛋白的膜转移n免疫杂交与显色――蛋白检测溶液和试剂n1X 磷酸盐缓冲液 (PBS) nModified RIPA bufferTris-HCl: 50 mM, pH 7.4 ; NP-40: 1% ;Na-deoxycholate:0.25% ;NaCl: 150 mM ;EDTA: 1 mM ;P MSF: 1 mM ;Aprotinin, leupeptin, pepstatin: 1 microgram/ml each ;Na3VO4: 1 mM ;NaF: 1 mMn1X SDS样品缓冲液62.5 mM Tris-HCl (pH 6.8于25°C), 2%w/v SDS, 10% 甘油 ,50 mM DTT, 0.01% w/v 溴酚蓝n转移缓冲液25 mM Tris base, 0.2 M 甘氨酸 , 20% 甲醇(pH 8.3)n10X Tris 缓冲盐(TBS)准备 1L 10X TBS: 24.2 g Tris base, 80 g NaCl; 用 1N HCl 调 pH 为 7.6n脱脂奶粉或 BSAn 甲醇n TBS/T 缓冲液1X TBS, 0.1% Tween-20n封闭缓冲液（ TBS/T ）1X TBS, 0.1% Tween-20加5%w/v 脱脂奶粉或BSAn一抗的稀释1X TBS, 0.1% Tween-20加5% BSA(多抗 )或 5% 脱脂奶粉 (单抗 )Note: 一般来说 , BSA 被推荐用于多克隆抗体，脱脂奶粉用于单克隆抗体，这样可得到较高的信噪比。

抗体的稀释度参考抗体说明书或根据实验确定。

n预染的蛋白质 Marker ，可用于监测转膜的效率样品制备原始样品可为细胞、组织、培养上清、免疫沉淀或亲和纯化的蛋白，以下为定性检测目的蛋白时细胞样品的处理方法，其余的样品制备方法参阅相关文献。

WB实验技术手册

1、根据检测蛋白的位置选择合适的裂解 buffer：
蛋白位置
推荐 buffer
全细胞
NP-40 或 RIPA
胞浆（可溶性蛋白）
Tris-HCl
胞浆（骨架结合蛋白）
Tris-Triton
膜蛋白
NP-40 or RIPA
核蛋白
RIPA or 核蛋白提取试剂盒
线粒体蛋白
RIPA or 线粒体分离试剂盒
线粒体/细胞浆蛋白分离试剂：该试剂盒提供独特的试剂可从多种哺乳动物细胞（包括凋亡和非凋亡细胞）中分离出线粒体部分和胞浆部分，得到的蛋白保持了原有的生物学活性，可直接用于分析线粒体组份在胞浆和线粒体中分布的变化，如：WB，ELISA 等。操作过程简单、方便，不使用有毒的物质，无需超速离心。该试剂盒也可用于分离完整的线粒体架构。
积。分装然后保存在-20°C
注意：在煮沸过程中液体体积避免变化太大，可加瓶盖以免溶液过渡蒸发。需
在通风橱中操作。溶液变黄后即丢弃。
相关产品信息
目录号
产品描述
ab65621
Protease Inhibitor Cocktail (Aprotinin,Leupeptin,Pepstatin A,PMSF)
电泳时间：通常电泳时溴酚蓝到达胶的底端处附近即可停止电泳，或者可以根据预染蛋白质分子量标准的电泳情况，预计目的蛋白已经被适当分离后即可停止电泳。
二、转膜
杂交膜是 WB 进行的介质，选择合适的、高质量的杂交膜对整个 WB 的实验是非常重要和关键的。可以根据不同的检测目的和待测蛋白的特性，
选择合适的膜类型。
021-61130227/8/9
６
我要抗体 51AB
51AB 无忧抗体

蛋白免疫印迹杂交实验方法

Western Blot（蛋白质免疫印迹技术）一、实验原理：与Southern或Northern杂交方法类似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。

经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。

以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。

该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。

Western Blot（WB）是通过聚丙烯酰胺电泳根据分子量大小分离蛋白后，将蛋白转移至固相支持物—NC膜上，根据抗原和抗体之间的反应特性，通过特异性试剂（抗体）作为探针（一抗/二抗），对靶物质（抗原）进行检测。

蛋白质的Western印迹技术结合了凝胶电泳的高分辨率和固相免疫测定的特异敏感等多种特点，可检测到低至1～5ng（最低可到10－100pg）中等大小的靶蛋白。

Western Blot 流程图：样品聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）转膜封闭洗膜（3×5mins）孵育一抗（4度过夜或室温4-6小时）洗膜（3×10mins）孵育二抗（室温2小时）洗膜（3×10mins）显影SDS-PAGE分离蛋白的原理和操作:1. SDS-PAGE作用原理聚丙烯酰胺凝胶是网状结构，具有分子筛效应，它有两种形式，一种是非变性聚丙烯酰胺凝胶，蛋白质在电泳中保持完整的状态，蛋白在其中依三种因素分开：蛋白大小，形状和电荷。

另外一种是SDS-PAGE，SDS-PAGE仅根据蛋白分子量亚基的不同而分离蛋白。

这个技术首先是1967年由shapiro建立，他们发现在样品介质和丙烯酰胺凝胶中加入离子去污剂和强还原剂后，蛋白质亚基的电泳迁移率主要取决于亚基分子量的大小，电荷因素可以忽视。

蛋白免疫印迹杂交(Western Blot)图示

C-1 胶中蛋白的检测电泳后检测蛋白是否迁移正确与平均，可采用铜染或考马斯蓝染色检测，如果凝胶中的蛋白需要进行转膜则需可逆的铜染法，否则采用不可逆考马斯蓝法染色。铜染法：电泳胶用蒸馏水洗数秒钟，加入 0.3 M CuCl2 染色 5-10 分钟，再用去离子水洗一次，在暗背景下观察在兰色胶背景下蛋白出现透明条带，胶置于 0.1- 0.25 M Tris/0.25 M EDTA pH 8.0 缓冲液中漂洗脱色两次，再置于电转缓冲液中开始转膜。考马斯蓝法：用 40%双蒸水, 10% 醋酸, 50%甲醇的溶液固定胶中蛋白，考马斯蓝 R-250 染液（凯基产品）室温染色 4 小时至过夜，保持摇匀，转入 67.5%双蒸水, 7.5% 醋酸, 25%甲醇摇匀至脱去多余的染料，蛋白被染成深蓝色。 C-2 蛋白转膜
B 电泳
B-1 PAGE 胶的制备聚丙酰胺凝胶 PAGE 电泳根椐蛋白分子量进行分离蛋白，PAGE 胶是由两种化合物聚合而成的，即丙烯酰胺（acr）和 N,N-甲叉双丙烯酰胺(Bis)，聚合需加入过硫酸铵及 DMAP 或 TEMED，凝胶为中性、水溶性、三维网状结构。不同分子量的蛋白选择不同的凝胶浓度（参考下表》，原则上高分子量蛋白用低浓度胶，低分子量蛋白用高浓度胶分离。
浸泡甲醇中 1-2 分钟，再孵育于冰冷的电转缓冲液中 5 分钟，胶也需在冰冷的电转缓冲液中平衡 3-5 分钟，否则转膜时会导致条带变形。
C-3 膜上蛋白的检测：丽春红为检测转膜是否成功，可用丽春红染色，丽春红染色工作液：2%的丽春红贮备液 1：10 稀释，即加 9 倍的 ddH2O 染色方法：将膜放入 TBST 洗一次，再置于丽春红染色工作液中,在室温下摇动染色 5 分钟，大量的水洗膜直至水变
B-2 蛋白分子量 Marker 预染或非预染各种分子量的蛋白，用于标示电泳中蛋白的大小和示踪

蛋白免疫印迹技术(WesternBlot)介绍

低，2-5% 高，根据蛋白大小
• 上样
SDS-PAGE电泳
Staking gel Separating gel
转膜
• 膜的选择最常用于Western Blot的转移膜主要是硝酸纤维素
（Nitrocellulose，NC）膜和聚偏二氟乙烯（Polyvinylidene Fluoride, PVDF）膜，此外也有用尼龙膜、DEAE纤维素膜做蛋白印迹。 • 孔径
蛋白免疫印迹技术介绍
主要内容
• Western Blot原理 • Western Blot特点及应用 • Western Blot一般流程 • Western Blot常见问原理
• 混合样品经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳后分离，凝胶中的蛋
一抗、二抗孵育
• 抗体选择 • 抗体稀释液 • 孵育条件 • 漂洗
显色
显色
• 化学发光检测
• 荧光法
显色
GE AI800凝胶成像系统
Western Blot 常见问题
• 样品制备样本保存蛋白酶抑制剂
• 抗体正规厂家，有示例图抗体保存一抗二抗匹配内参和对照
Western Blot 常见问题
法（Folin-酚试剂法）、 BCA法等。但各有优缺点，大家可以根据具体情况选取。按相应蛋白质定量试剂盒操作说明操作，测定样品浓度
SDS-PAGE电泳
• SDS-PAGE 是在蛋白质样品中加入SDS和含有巯基乙醇的样品处理液， SDS是一种很强的阴离子表面活性剂，它可以断开分子内和分子间的氢键，破坏蛋白质分子的二级和三级结构。
Western Blot 应用
• 从混合蛋白样品中检测目的蛋白 • 目的蛋白的组织定位 • 目的蛋白的表达量分析 • 目的蛋白与其他大分子间相互作用

蛋白质免疫印迹实验WesternBlot

，将膜浸于其中，平放在平缓摇动的摇床平台上，室温温育 1小时后，用PBS缓冲液将硝酸纤维素薄膜漂洗 4 次，每次 5 分钟，再加入 4- 氯萘酚显色液，加入 5μ1 的30%H2O2，将硝酸纤维素薄膜置于其中缓慢
摇动，待所检测的蛋白带显色达到最深程度后，将硝酸纤维素薄膜转入 PBS 溶液中停止显色反应。取出硝酸纤维素薄膜，自然晾干后拍照保存结果。
四思考题
• 1. 为什么裁剪的滤纸必须与凝胶大小完全一致？若不是这样结果会怎样？
• 2. 电转移时为什么都必须带手套小心操作并除去气泡，否则结果会怎样？
• 在进色后应时应注意哪些问题？ • 请简述免疫印迹实验的原理，并将之与
免疫学相关概念联系起来。
2024/2/11
2024/2/11
一实验原理
• 电泳将蛋白质从凝胶转移到固体支持物上是通过电转移仪器完成的。它是将固体支持物面对阳极、凝胶面对阴极，二者结合在一起，然后将外面二侧用 Whatman 3MM滤纸结合，形成“三明治 ”结构，放入电转移仪器上，加入电泳缓冲液，通上电源后，蛋白质即可从凝胶上转移到固体支持物上。
2024/2/11
一实验原理
其定量关系符合以下公式： • Ve=Vo+KV1 • Ve：某一溶质的洗脱体积 • Vo：层析柱的外水体积 • Vi：层析柱的内水体积 • K：某一溶质的分配系数
2024/2/11
二试剂和器材
1．试剂
电转移缓冲液 pH8.3 • 39mM甘氨酸 • 4.8mM Tris碱 • 0.037% SDS • 20% 甲醇 • 混合2.9克甘氨酸，5.8克Tris,0.37克SDS,加200ml甲2源自24/2/11三操作步骤

蛋白质印迹(Western blotting)实验操作步骤

蛋白质印迹/Western blotting实验操作步骤一、总蛋白的提取单层贴壁细胞总蛋白的提取：1)吸除培养液2)每皿细胞加4℃预冷的 PBS。

平放轻轻摇动 1min 洗涤细胞，然后弃去洗液。

重复上操作两次，共洗细胞三次以洗去培养液。

将PBS弃净后把培养瓶置于冰上。

（PBS会降低细胞裂解液的效价和总蛋白的浓度）3)加裂解液于冰上裂解 30 min，为使细胞充分裂解，培养瓶要经常来回摇动（可放置在4℃摇床裂解）。

4)裂解完后，用干净的刮棒将细胞刮于培养瓶的一侧（动作要快），然后用枪将细胞碎片和裂解液移至 1.5mL 离心管中。

（整个操作尽量在冰上进行）5)在EP管中将细胞震碎（10s/次，3次）6)于4℃下 12000rpm 离心 20-30 min。

（离心机提前预冷至4℃）7)将离心后的上清分装转移倒 1.5mL 的离心管中放于－20℃保存。

二、BCA法测蛋白浓度1)将BCA protein assay每孔 A液200μL,B液4μL混合，96孔板每孔加入22.5μLdd水，2.5μL蛋白提取液，200μLA+B混合液2)在烘箱中37℃，90r，孵育30min3)使用酶标仪测出吸光度后，使用公式y=0.9154x-0.118计算出蛋白浓度（浓度需要×10）4)将蛋白配成等浓度等体积（使用配置好的裂解液配），按照4：1加入5X loading buffer然后煮5min（100℃），放入-20℃保存三、SDS-PAGE电泳板子1.5mm，梳子1.5mm1）清洗玻璃板：一只手扣紧玻璃板，另一只手蘸点洗衣粉轻轻擦洗。

两面都擦洗过后用自来水冲洗2）验漏：玻璃板对齐后放入夹中卡紧，然后垂直卡在架子上，加满水验漏3）灌胶：验漏结束后用纸吸干水分，按方法配制下层胶（4mL+4mL+80μLAP),灌胶时，可用 1mL 枪吸取胶沿玻璃放出，待胶面升到绿带中间线高度时即可。

然后胶上加1 mL水，液封后的胶凝的更快。