SDS-PAGE电泳分离蛋白质与蛋白质免疫印迹
蛋白质的SDS-PAGE检测
百泰派克生物科技
蛋白质的SDS-PAGE检测
SDS-PAGE（Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis）十
二烷基硫酸钠聚丙烯酰氨凝胶电泳是一种常用的蛋白质分离纯化技术，它利用十二烷基硫酸钠消除蛋白质结构和电泳的影响，使蛋白质仅根据分子质量差异进行分离，广泛用于蛋白质的分离、纯度鉴定、分子量鉴定以及表达分析等。
蛋白质SDS-PAGE检测包括蛋白质SDS-PAGE电泳和电泳后凝胶图像分析两个部分。
在蛋白质SDS-PAGE电泳过程中，不同分子质量的蛋白质迁移速率不同，相对分子
质量较大的蛋白质在电场的作用下迁移较慢，电泳结束后仍然靠近点样孔；而低分子质量的蛋白质迁移速率较快，电泳结束后处于离点样孔较远的位置。
经银染或考马斯亮蓝等方法染色后，便可以观察到凝胶上蛋白质条带的大小、数量和分布情况。
百泰派克生物科技采用Bio-Rad Mini-PROTEAN® Tetra凝胶系统，提供快速高效的蛋白质SDS-PAGE检测服务技术包裹，用于多种蛋白质组学分析，包括蛋白质分子
量测定、蛋白质鉴定、样品纯度分析、二硫键鉴定以及蛋白质定量等，欢迎免费咨询。
SDS-PAGE
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳
3、蛋白质-SDS复合物的特点：
形状像一个长椭圆棒。 短轴对不同的蛋白质-SDS胶束基本上是相同的。
长轴的长度则与亚基分子量的大小成正比。
所带的负电荷远远超过蛋白质分子原有电荷，消除了蛋 白质分子间原有电荷的差异。 在SDS-PAGE电泳系统中的迁移率不再受蛋白质原有电 荷的影响，主要取决于椭圆棒的长轴长度，即蛋白质或 亚基分子量的大小。
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳
四、SDS-PAGE的应用
1、蛋白质纯度分析 2、蛋白质分子量、浓度的测定
3、免疫印迹的第一步
4、蛋白质修饰的鉴定 5、分离放射性标记的蛋白质 6、分离和浓缩用于产生抗体的抗原 7、显示小分子多肽
蛋白质分子量大小而定）； ② 恒定电压电泳一定时间； ③ 电泳结束后取下凝胶，至染色液中染色，过夜； ④ 用脱色液脱色至结果可见，经扫描保存。 结果分析参照蛋白质标准对照进行，或进一步进行 western blotting，分析不同蛋白质分子的组成。
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳
Western blotting多种蛋白的检测
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳
二、SDS-PAGE样品检测
SDS-PAGE一般采用不连续缓冲系统，由Tris/甘氨 酸电极缓冲液、浓缩胶和分离胶构成，采用垂直电泳的 方式对待检测样品进行分析。
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳
二、SDS-PAGE样品检测
SDS-PAGE操作步骤如下：
① 采用一定浓度的浓缩胶和分离胶对样品进行检测（视
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳
SDS-Polyacrylamide Gel Electrophoresis
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳
sdspage分离蛋白质原理
sdspage分离蛋白质原理
SDS-PAGE是一种常用的蛋白质分离技术，其原理基于聚丙烯酰胺凝胶电泳和SDS（十二烷基硫酸钠）的作用。
首先，将待分离的蛋白质样品加入SDS溶液中，SDS可以与
蛋白质发生非共价键结合，使蛋白质的电荷变得均匀，且带有负电荷。
这样，蛋白质在电场作用下会向阳极迁移。
接下来，将试样加载到聚丙烯酰胺凝胶孔中，聚丙烯酰胺凝胶中存在着连续的网络结构，该网络由交联的聚丙烯酰胺聚合物构成。
蛋白质在电场作用下会通过孔道中的凝胶网络逐渐迁移，迁移速度取决于其分子量，分子量较大的蛋白质迁移速度较慢，分子量较小的蛋白质迁移速度较快。
最后，当电泳进行一段时间后，蛋白质样品会在凝胶中分离成多个带状区域，每个带状区域代表了一种或多种分子量相近的蛋白质。
为了可视化蛋白质，可以通过染色或免疫检测方法进行进一步分析。
总结起来，SDS-PAGE通过使用SDS使蛋白质带有负电荷，
然后在聚丙烯酰胺凝胶电泳中根据蛋白质分子量的差异来分离蛋白质。
这种技术广泛应用于蛋白质分析和分离，用于探索蛋白质结构和功能，以及研究蛋白质相互作用。
蛋白质免疫印迹(Western Blot )实验步骤和原理及注意事项
蛋白质免疫印迹（Western Blot ）实验步骤和原理及注意事项1.收集蛋白样品(Protein sample preparation)可以使用适当的裂解液。
收集完蛋白样品后，为确保每个蛋白样品的上样量一致，需要测定每个蛋白样品的蛋白浓度。
根据所使用的裂解液的不同，需要采用适当的蛋白浓度测定方法。
因为不同的蛋白浓度测定方法对于一些去垢剂和还原剂等的兼容性差别很大。
BCA法。
2. 电泳(Electrophoresis)(1) SDS-PAGE凝胶配制(2) 样品处理在收集的蛋白样品中加入适量浓缩的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液。
例如2X或5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液。
使用5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液可以减小上样体积，在相同体积的上样孔内可以上样更多的蛋白样品。
100℃或沸水浴加热3-5分钟，以充分变性蛋白（根据蛋白分子的大小，煮沸时间可适当变化，一般不低于5min。
煮沸只是变性蛋白，而不是分解，一般加了抑制酶不会分解。
煮沸对于SDS-PAGE凝胶电泳是必须的，只有煮沸,才能消除蛋白质的立体二级结构,伸展为一维线性结构,所以一般来讲二聚体都会解体,才能完全按照分子量跑电泳,加的蛋白Marker才有指示分子量的意义。
蛋白样品变性后与SDS充分结合，SDS使每个氨基酸带相同的电荷,使整个蛋白呈线性结构. 抗体因为要是线性表位结合的，100度煮10min 后13000,离心5分钟,取上清电泳,因为沉淀会导致拖尾.也可以取上清到另一管,4度可以放一周备再次电泳）。
(3)电泳i.清洗玻璃板：一只手扣紧玻璃板，另一只手蘸点洗衣粉轻轻擦洗。
两面都擦洗过后用自来水冲，再用蒸馏水冲洗干净后立在筐里晾干。
ii.灌胶与上样（1）玻璃板对齐后放入夹中卡紧。
然后垂直卡在架子上准备灌胶。
（操作时要使两玻璃对齐，以免漏胶。
）（2）配10%分离胶，加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。
灌胶时，可用10 ml枪吸取5 ml胶沿玻璃放出，待胶面升到绿带中间线高度时即可。
生物蛋白质的检测实验报告
生物蛋白质的检测实验报告生物蛋白质的检测实验报告引言：蛋白质是生物体中最基本的分子之一，其在细胞结构、代谢调控、信号传导等方面扮演着重要角色。
因此，准确地检测生物蛋白质的存在和量级对于研究生物学过程具有重要意义。
本实验旨在通过一系列方法，对蛋白质进行检测并分析。
材料与方法：1. 样本制备：选取不同类型的生物组织，如肌肉、肝脏和心脏，分别进行细胞裂解并制备蛋白质提取液。
2. 蛋白质定量：利用BCA法对蛋白质提取液进行定量，根据标准曲线计算样本中的蛋白质浓度。
3. SDS-PAGE电泳：将蛋白质样品与Laemmli缓冲液混合后，经过电泳分离，然后进行染色和成像。
4. 免疫印迹：将电泳分离的蛋白质转移到聚丙烯酰胺膜上，然后进行抗体探针的孵育和检测。
5. 质谱分析：将蛋白质样品经过酶解后，利用质谱仪进行分析，得到蛋白质的质量和序列信息。
结果与讨论：1. 蛋白质定量结果显示，不同组织中蛋白质的浓度存在差异。
肌肉组织中蛋白质浓度最高，而心脏组织中蛋白质浓度最低。
这可能与组织功能和代谢需求有关。
2. SDS-PAGE电泳结果显示，不同组织中蛋白质的分子量也存在差异。
肌肉组织中蛋白质的分子量较大，而心脏组织中蛋白质的分子量较小。
这与组织的功能和结构有关。
3. 免疫印迹结果显示，不同组织中蛋白质的表达模式也存在差异。
肌肉组织中特定蛋白质的表达量较高，而心脏组织中特定蛋白质的表达量较低。
这可能与组织的功能和代谢调控有关。
4. 质谱分析结果显示，蛋白质样品中存在多个肽段，通过对质谱峰的分析，可以推测蛋白质的氨基酸序列和质量。
结论：通过本实验的一系列方法，我们成功地检测了生物蛋白质的存在和量级，并对其进行了分析。
结果显示，不同组织中蛋白质的浓度、分子量和表达模式存在差异，这与组织的功能和代谢调控密切相关。
质谱分析进一步揭示了蛋白质的氨基酸序列和质量信息。
这些结果对于深入理解生物学过程以及研究相关疾病具有重要意义。
展望：虽然本实验对生物蛋白质的检测和分析取得了一定的成果，但仍存在一些局限性。
实验十 聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离蛋白质
实验十聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离蛋白质【实验目的】1. 了解和掌握聚丙烯酰胺凝胶电泳的技术和原理；2. 掌握用此法分离蛋白质组分的操作方法。
【实验原理】在生物化学、分子生物学和基因（遗传）工程实验中，常常要进行蛋白质和核酸的分离工作。
聚丙烯酰胺凝胶电泳（Polyacrylamide Gel Electrophoresis, PAGE）是以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质进行蛋白质或核酸分离的一种电泳方法。
聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺单体（acrylamide，简称ACR）和交联剂N，N-甲叉双丙烯酰胺（N,N-methylene bisacrylsmide 简称BIS）在催化剂的作用下聚合交联而成的三维网状结构的凝胶。
通过改变单体浓度与交联剂的比例，可以得到不同孔径的凝胶，用于分离分子量大小不同的物质。
聚丙烯酰胺凝胶聚合的催化体系有两种：（1）化学聚合：催化剂采用过硫酸铵，加速剂为N,N,N,N－四甲基乙二胺（简称TEMED）。
通常控制这二种溶液的用量，使聚合在1小时内完成。
（2）光聚合：通常用核黄素为催化剂，通过控制光照时间、强度控制聚合时间，也可加入TEMED 加速反应。
聚丙烯酰胺凝电泳常分为二大类：第一类为连续的凝胶（仅有分离胶）电泳；第二类为不连续的凝胶（浓缩胶和分离胶）电泳。
一般地，不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳有三种效应：①电荷效应（电泳物所带电荷的差异性）；②凝胶的分子筛效应（凝胶的网状结构及电泳物的大小形状不同所致）。
③浓缩效应（浓缩胶与分离胶中聚丙烯酰胺的浓度及pH的不同，即不连续性所致）。
因此，样品分离效果好，分辨率高。
SDS即十二烷基硫酸钠（Sodium Dodecyl Sulfate，简称SDS）是阴离子表面活性剂，它能以一定比例和蛋白质结合，形成一种SDS-蛋白质复合物。
这时，蛋白质即带有大量的负电荷，并远远超过了其原来的电荷，从而使天然蛋白质分子间的电荷差别降低仍至消除。
蛋白质免疫印迹实验
蛋白质免疫印迹实验（Western Blot）蛋白质免疫印迹（Western Blot）实验原理蛋白质免疫印迹（Western Blot）是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测的一种蛋白质检测方法。
对已知的表达蛋白，可以用相应的抗体作为一抗进行检测，对新基因的表达产物，可以融合部分的已知片段进行检测，如HA-tag，Flag-tag，c-myc-tag等。
Western Blot采用的是聚丙烯酰胺（PAGE）凝胶电泳，被检测的是蛋白质，其中检测探针是相应的抗体，显色是使用的标记后的二抗。
经过PAGE凝胶分离的蛋白质样品，转移到固相载体上，如醋酸纤维素膜，固相载体以非共价键的形式吸附蛋白质。
然后以固相载体上的蛋白质作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，然后再与标记后的二抗起反应，经过底物显色以检测目的蛋白。
蛋白质免疫印迹（Western Blot）原理蛋白免疫印迹法主要分为三个阶段进行第一阶段是SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)在这个阶段，经过变性处理的蛋白质样品经SDS处理后会带上阴性电荷,在聚丙烯酰胺凝胶中在电场的作用下从阴极向阳极泳动,且分子量越小,泳动速度就越快。
所以在此阶段，根据蛋白的泳动速度可以将样品中的蛋白质根据其分子量的大小进行分离，此阶段分离效果肉眼不可见。
如果想观察蛋白的电泳情况，可以在电泳完成后进行考马斯亮蓝染色进行观察；第二阶段为电转移，又称为转膜。
即将在凝胶中已经分离的蛋白质条带通过电场的作用转移至硝酸纤维素膜上, 一般选用恒流300 mA，通电90 min即可将凝胶中的蛋白条带转移到醋酸纤维素膜载体上。
转移到载体上的蛋白条带也是肉眼不可见的，如果想观察转移的效果，可以在转移后对载体进行丽春红染液染色。
第三阶段为酶联免疫显色检测将印有蛋白质条带的硝酸纤维素膜(相当于包被了抗原的固相载体)依次与特异性抗体和酶标第二抗体作用后,加入能形成不溶性显色物的酶反应底物,使目的条带蛋白显色。
westernblot电泳原理
westernblot电泳原理Western blot电泳是一种分离和鉴定蛋白质的方法，它基于电泳原理，可以将蛋白质按照分子量大小分离并定位到膜上，然后通过染色、显影等方式检测目标蛋白质的存在和数量。
Western blot电泳主要分为4个步骤：样品制备、SDS-PAGE电泳、蛋白印迹，以及染色、显影。
下面将对每个步骤进行详细介绍。
第一步：样品制备在进行Western blot电泳之前，需要对样品进行制备。
一般来说需要采用还原剂和蛋白酶抑制剂等化学试剂处理样品，以避免蛋白质被氧化或降解，保证电泳结果的准确性。
常见的还原剂有DTT和β-mercaptoethanol等。
另外，还需选用相应的溶解液处理样品，使蛋白质完全溶解并不附着于膜上。
第二步：SDS-PAGE电泳在样品制备完成后，需要将蛋白质进行分离。
SDS-PAGE电泳就是最常用的蛋白质分离方法之一。
它利用SDS与蛋白质的作用，使得蛋白质的形态发生改变，变为线性构象。
同时SDS还赋予蛋白质等电性，可以使得蛋白质按照分子量大小进行迁移。
在SDS-PAGE电泳，要将样品加入凝胶槽中，施加电场，使蛋白质向电极迁移。
随着时间的推移，蛋白质会按照分子量大小被分离到不同位置。
经过电泳，蛋白质带会形成。
第三步：蛋白印迹蛋白印迹是Western blot电泳的核心步骤，它将已经分离好的蛋白质转移到膜上，并固定在膜上以方便后续的染色和检测。
常用的膜包括尼龙膜、nitrocellulose膜和PVDF膜等。
在印迹过程中，需要将SDS-PAGE凝胶与膜叠在一起，并由电流进行迁移，使蛋白质分子也迁移至膜上，形成同样的蛋白质带。
通过此步骤，可以在膜上确定蛋白质的位置和分子量。
第四步：染色、显影蛋白印迹完成后，即可进行染色、显影。
通常的做法是利用特殊的染料如蛋白质染料Ponceau S染色检测蛋白质是否在膜上，并调整印迹的质量。
对于染色后的膜，可以通过荧光素着色、成像的方式直接观察目标蛋白的含量。
蛋白质免疫印迹（WesternBlot，WB）实验方法原理步骤及注意事项
蛋⽩质免疫印迹（WesternBlot，WB）实验⽅法原理步骤及注意事项实验⽅法原理Western免疫印迹（Western Blot）是将蛋⽩质转移到膜上，然后利⽤抗体进⾏检测的⽅法。
对已知表达蛋⽩，可⽤相应抗体作为⼀抗进⾏检测，对新基因的表达产物，可通过融合部分的抗体检测。
与Southern或Northern杂交⽅法类似，但Western Blot采⽤的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋⽩质，“探针”是抗体，“显⾊”⽤标记的⼆抗。
经过PAGE分离的蛋⽩质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以⾮共价键形式吸附蛋⽩质，且能保持电泳分离的多肽类型及其⽣物学活性不变。
以固相载体上的蛋⽩质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第⼆抗体起反应，经过底物显⾊或放射⾃显影以检测电泳分离的特异性⽬的基因表达的蛋⽩成分。
该技术也⼴泛应⽤于检测蛋⽩⽔平的表达。
实验材料蛋⽩质样品试剂、试剂盒丙烯酰胺SDS Tris-HClβ-巯基⼄醇ddH2O⽢氨酸Tris甲醇PBSNaClKClNa2HPO4KH2PO4ddH2O考马斯亮兰⼄酸脱脂奶粉硫酸镍胺H2O2DAB试剂盒仪器、耗材电泳仪电泳槽离⼼机离⼼管硝酸纤维素膜匀浆器剪⼑移液枪刮棒实验步骤⼀、试剂准备1. SDS-PAGE试剂：见聚丙烯酰胺凝胶电泳实验。
2. 匀浆缓冲液：1.0 M Tris-HCl(pH 6.8) 1.0 ml；10%SDS 6.0 ml；β-巯基⼄醇 0.2 ml；ddH2O 2.8 ml。
3. 转膜缓冲液：⽢氨酸 2.9 g；Tris 5.8 g；SDS 0.37 g；甲醇200 ml；加ddH2O定容⾄1000 ml。
4. 0.01 M PBS(pH7.4)：NaCl 8.0 g；KCl 0.2 g；Na2HPO4 1.44 g；KH2PO4 0.24 g；加ddH2O⾄1000 ml。
5. 膜染⾊液：考马斯亮兰 0.2 g；甲醇80 ml；⼄酸2 ml；ddH2O118 ml。
SDS-PAGE(蛋白印迹)
2. RT，1-2hours 或 4℃过夜
一抗
1
2 3 4 5
把膜从冰箱中取出，RT ，30min。 注： 封闭 液可回收 四个角蘸点水铺好保鲜膜后，加1：100的一抗 500ul（抗体稀释液495ul+5ul mouse p65抗体） 于保鲜膜上 蛋白面朝下，使尼龙膜和一抗充分接触。注避免 产生气泡，如有气泡，可用镊子将膜的四角轻轻 提起，排出气泡 盖上玻璃平皿，RT下孵育2hours TBST 10min×2 ； TBS 10min×1
当蛋白质的分子量在15,000－200,000之间时，样 品的迁移率与其分子量的对数呈线性关系。 符合如下方程式：Lg MW =－b m
R
+
K
其中，MW 为蛋白质的分子量，m R 为相对迁移 率，b为斜率，K为截距。当条件一定时，b与K均 为常数
因此通过已知分子量的蛋白与未知蛋白的比较， 就可以得出未知蛋白的分子量
4.05ml
3.3ml
1.5mol/L pH=8.8 Tris-HCl 2.5ml
100µ l 50µ l 10µ l
100µ l 100µ l 10µ l
3.按比例配好分离胶,用移液管快速加入 （或直接用小烧杯倒入）,大约5厘米左右, 之后加少许蒸馏水（或异丙醇除泡）,静臵
至胶凝
* 凝胶配制过程要迅速, 催化剂TEMED要
2 放好胶后，放尼龙膜。注：尼龙膜一旦放到胶上就 不可再作移动，因为这时已有蛋白结合到膜上。然后， 在膜上加一点缓冲液，用玻璃棒尽量使之铺平 3 在膜上依次放好三张滤纸和海绵后，即可夹好转膜模 具。注：每层间都要注意赶气泡 4 黑对黑，白对红在电泳槽中放好模具。并加一块冰在 电泳槽中，以防转膜过程中温度过高，影响转膜效率。 5 在用转移缓冲液注满电泳槽后。红对红，黑对黑接好 转 膜 装 臵 （ 及 电 泳 装 臵 ） 。 设 臵 电 泳 参 数 ： 60v ， 2.5hours
SDS-PAGE电泳分离蛋白质与蛋白质免疫印迹
室温一小时
1.75ml 0.413ml 0.338ml 12.5ul 2.5ul
过程图
http://202.114.128.248/newkj/my/moban2/index.htm
（二）方法 1、制胶：制备凝胶板，将混合后的分离胶溶液，用1ml枪加
至距梳齿下缘约1 cm。用1 mL枪在凝胶表面沿短玻璃板边缘轻 轻加一层异丙醇(约高3–4 mm)，用于隔绝空气，使胶面平整。 约30-60 min凝胶完全聚合，则可看到水与凝固的胶面有折射率 不同的界线。
SDS－PAGE电泳分离蛋白质与 蛋白质免疫印迹
▪ 蛋白免疫印迹杂交（Western Blot ）是将 蛋白样本通过聚丙烯酰胺电泳按分子量大 小分离，再转移到杂交膜（blot）上，然后 通过一抗/二抗复合物对靶蛋白进行特异性 检测的方法。WB是进行蛋白质分析最流行 和成熟的技术之一。
原理
聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺(Acr)和交联 剂N,N-甲叉双丙烯酰胺(Bis)在加速剂N，N， N，N—四甲基乙二胺(简称TEMED)和催化 剂过硫酸铵(简称AP)作用下聚合交联成三维网 状结构的凝胶，以此凝胶为支持物的电泳称为 聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)。
3. 未聚合的丙烯酰胺具有神经毒性，操作时应该戴手套 口罩防护。梳子插入浓缩胶时，应确保没有气泡，可将 梳子稍微倾斜插入以减少气泡的产生，梳子拔出来时应 该小心，不要破坏加样孔，如有加样孔上的凝胶歪斜可 用针头插入加样孔中纠正，但要避免针头刺入胶内。 4. 电泳槽内加入电泳缓冲液冲洗清除黏附在凝胶底部的 气和未聚合的丙烯酰胺，同时建议低电压短时间的预电 泳，清除凝胶内的杂质，疏通凝胶孔径以保证电泳过程 中电泳的畅通(恒压10-20V，20-30min) 5. 加样前样品应先离心，尤其是长时间放置的样品，以 减少蛋白质沉淀堵塞胶孔。 6. 为避免边缘效应，可在未加样的孔中加入等量的样品 缓冲液。
sds-page的原理,说明其在物质分离与检测的步骤
序一：认识SDS-PAGESDS-PAGE（Sodium Dodecyl Sulfate-Polyacrylamide Gel Electrophoresis，十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳）是一种常用的蛋白质电泳技术，可以对蛋白质进行分离和检测。
它通过凝胶的孔隙大小和电泳的受力使蛋白质在凝胶中进行分离，是生物化学实验中的重要手段。
今天我们就来深入探讨SDS-PAGE的原理及在物质分离与检测中的步骤。
序二：SDS-PAGE的原理在SDS-PAGE技术中，其原理主要包括两个方面：SDS和聚丙烯酰胺凝胶电泳。
1. SDS的作用SDS是一种阴离子表面活性剂，它的主要功能是将蛋白质变性并赋予负电荷。
蛋白质经过SDS处理后，其构象被完全展开，获得了相同的质量比电荷的分布，使得蛋白质在电泳过程中只受到电场的作用而不再因其本身的结构而迁移速度有差异。
2. 聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶是一种网状结构的凝胶，其孔隙大小可以根据需要调整，能够使蛋白质根据其分子大小在凝胶中被有效地分离。
序三：SDS-PAGE在物质分离与检测中的步骤1. 样品处理需要将待测样品进行SDS处理，在加热的条件下，SDS可以使蛋白质获得带负电的线性结构，这样可以消除蛋白质的构象差异，从而在电泳过程中只受到电场的作用而进行迁移。
2. 样品加载处理好的样品需要被加在SDS-PAGE的凝胶孔中，然后进行电泳操作。
3. 电泳电泳的原理是利用电场的作用，使具有电荷的离子或分子在电场中移动。
在SDS-PAGE中，蛋白质通过受到电场的作用，根据其分子大小在凝胶中被有效地分离。
4. 凝胶染色蛋白质在凝胶中分离后需要进行染色，通常使用银染或共染技术，使蛋白条带清晰可见，便于进一步的分析。
序四：SDS-PAGE的个人观点和理解通过对SDS-PAGE的原理及在物质分离与检测中的步骤的了解，我深刻认识到这一技术在蛋白质研究领域中的重要性。
SDS-PAGE能够对蛋白质进行高效分离和定量，为蛋白质的性质和功能研究提供了有力的手段。
免疫印迹介绍及实验过程
免疫印迹介绍及实验过程免疫印迹免疫印迹免疫印迹（immunoblotting）⼜称蛋⽩质印迹（Western blotting），是根据抗原抗体的特异性结合检测复杂样品中的某种蛋⽩的⽅法。
该法是在凝胶电泳和固相免疫测定技术基础上发展起来的⼀种新的免疫⽣化技术。
由于免疫印迹具有SDS-PAGE 的⾼分辨⼒和固相免疫测定的⾼特异性和敏感性，现已成为蛋⽩分析的⼀种常规技术。
免疫印迹常⽤于鉴定某种蛋⽩，并能对蛋⽩进⾏定性和半定量分析。
结合化学发光检测，可以同时⽐较多个样品同种蛋⽩的表达量差异。
免疫印迹法的基本原理将混合抗原样品在凝胶板上进⾏单向或双向电泳分离, 然后取固定化基质膜与凝胶相贴。
在印迹纸的⾃然吸附⼒、电场⼒或其它外⼒作⽤下, 使凝胶中的单⼀抗原组份转移到印迹纸上, 并且固相化。
最后应⽤免疫覆盖液技术如免疫同位素探针或免疫酶探针等, 对抗原固定化基质膜进⾏检测和分析。
免疫印迹法的基本步骤免疫印迹法（以抗原分析为例）基本上可分为抗原分离、抗原印迹和抗原检定三个步骤。
在每⼀步中因采⽤的具体实验⽅法不同, 可构成多种免疫印迹分析系统。
免疫印迹法的优点免疫印迹法是⼀项分析抗原、抗体的技术。
它具有下列优点：1、湿的固定化基质膜柔韧, 易于操作；2 、固定化的⽣物⼤分⼦可均⼀的与各种免疫探针接近, 不会象凝胶那样受孔径阻隔；3、免疫印迹分析只需少量试剂；4、孵育、洗涤的时间明显减短；5、可同时制作多个拷贝, ⽤于多种分析和鉴定；6、结果以图谱形式可长期保存；7、免疫探针可通过降低PH值等⽅法, 象抹去录⾳磁带⼀样将探针抹掉, 再换⽤第⼆探针进⾏分析检测。
免疫印迹法的应⽤范围及优点不仅局限于此, 它必将随着这⼀⽅法的深⼊研究⽽不断发展和完善。
免疫印迹免疫印迹⼜常称Western blot，是⼀综合性的免疫学检测技术。
它利⽤SDS-PAGE技术将⽣物样品中的蛋⽩质分⼦按分⼦量的⼤⼩在凝胶上分离开，然后⽤电转移的⽅法将蛋⽩转移到固相膜上（NC、尼龙或PVDF膜），最后进⾏免疫学检测。
Western－blotting：SDS-PAGE和免疫印迹
Western－blotting：SDS-PAGE和免疫印迹一：蛋白质的提取1、取出细胞，倒去培养液，用PBS洗涤细胞一次，充分除去PBS液体，把细胞置于冰上。
配置细胞裂解液，细胞裂解液用灭菌水配置，然后按照1：100比例加入PMSF混匀，然后按照细胞的多少加入裂解液于培养瓶中，在冰上放置20min。
在此期间每隔3-5min摇晃培养瓶，让其充分裂解细胞。
2、裂解结束后，吸取裂解液于另一只1.5ml离心管中，于4℃13000r/min 离心15min。
3、离心结束后，吸取离心管内上清于另一只干净离心管中。
于-20℃保存。
4、根据上样量的多少，计算需要处理的样品，在处理样品时按照1：1比例加入2×buffer。
于100℃煮5-10min。
结束后短暂离心，于4℃备用。
二、主要试剂的配制：1、30%丙烯酰胺溶液：取29.2g丙烯酰胺，0.8g甲叉双丙烯酰胺，加水至100ml，过滤，棕色瓶内避光4℃保存；2、1.5M Tris-HCl分离胶缓冲液，pH8.8 (4x)：取18.15g Tris，用1M HCl调pH至8.8，加水至100ml，4℃保存；3、1.0M Tris-HCl在浓缩胶缓冲液，pH 6.8(8x)：取12g Tris，用1M HCl调pH至6.8，加水至100ml，4℃保存；4、电极缓冲液：pH8.3( 1x)：取28.8g甘氨酸，6.04g Tris碱，加10ml 10% SDS，加水至1L，室温保存；5、10% SDS溶液：取10g SDS，加水至100ml，完全溶解后室温保存。
6、10%过硫酸铵溶液(APS):取0.1g过硫酸铵,加水至1ml,每次用前新鲜配制7、2X样品缓冲液 0.1M TrisCL，PH6.8；0.2M DTT；4%SDS；2%溴酚兰；20%甘油8、电转印液 pH 8.2-8.3：甘氨酸 14.42g，Tris base 3.02g，dH2O 800ml，甲醇 200ml， 1N HCL调定pH值至8.2-8.3，室温放置。
实验二聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离血清蛋白质
区带电泳的分类
1．按支持物物理性状不同，可分为： (1)滤纸及其他纤维素膜如乙酸纤维膜、玻 璃纤维膜、聚胺纤维膜电泳。 (2)粉末电泳，如纤维素粉、淀粉、玻璃粉 电泳。 (3)凝胶电泳，如琼脂糖、琼脂、硅胶、淀 粉胶、聚丙烯酰胺凝胶电泳。 (4)丝线电泳，如尼龙丝、人造丝电泳。
2．按支持物的装置形式不同，可分为： (1)平板式电泳，支持物水平放置，是最常 用的电泳方式。 (2)垂直板式电泳。 (3)连续流动电泳，首先应用于纸电泳，将 滤纸垂直竖立，两边各放一电级，缓冲 液和样品自顶端下流，与电泳方向垂直。 可分离较大量的蛋白质。以后有用淀粉、 纤维素粉、玻璃粉等代替滤纸，分离效 果更好。
下sdspage电泳的基本原理sds聚丙烯酰胺凝胶电泳是在聚丙烯酰胺凝胶系统中引进sdssds能断裂分子内和分子间氢键破坏蛋白质的二级和三级结构强还原剂能使半胱氨酸之间的二硫键断裂蛋白质在一定浓度的含有强还原剂的sds溶液中与sds分子按比例结合形成带负电荷的sds蛋白质复合物
实验二 聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS-PAGE)分离血清蛋白质
实验结果分析
胶槽1
94 000 62 000 43 000
2
3
31 000 20 100 14 400
图1 标准蛋白质与待测样品电泳图谱
注：胶槽1 标准蛋白；胶槽2、3 样品蛋白
思考题
该实验中如何去除蛋白质间电荷效应的？ 在不连续体系 SDS-PAGE 中 , 分离胶与浓缩胶中 均含有TEMED和AP,试述其作用?
胶槽1
94 000 62 000 43 000
2
3
31 000 20 100 14 400
图1 标准蛋白质与待测样品电泳图谱 注：胶槽1 标准蛋白；胶槽2、3 样品蛋白
鉴定膜蛋白的实验方法及步骤
鉴定膜蛋白的实验方法及步骤全文共四篇示例，供读者参考第一篇示例：膜蛋白是位于生物膜上的一种蛋白质，它在细胞内外沟通信息，调节物质的运输和细胞的形态结构等功能。
鉴定膜蛋白的方法和步骤对于研究细胞生物学和生物化学具有重要意义。
下面将介绍一种常用的鉴定膜蛋白的实验方法及步骤。
实验方法：1. 细胞培养和膜蛋白提取：需要将感兴趣的细胞株培养至对数生长期，然后采用适当的方法将细胞破碎并获得含有膜蛋白的细胞膜。
2. SDS-PAGE分析：将膜蛋白样品进行SDS-PAGE电泳，将蛋白分离出来。
3. 免疫印迹分析：将膜蛋白从SDS-PAGE凝胶上转移到聚丙烯酰胺膜上，然后用特异性的抗体探测膜蛋白。
4. Western blot分析：用二抗结合辅助探测靶蛋白。
5. 膜蛋白鉴定：根据Western blot结果，确定膜蛋白的存在与否，并分析其表达水平。
实验步骤：1. 提取膜蛋白：将细胞经过适当处理（如超声波破碎、离心等）后，得到含有膜蛋白的细胞膜，采用适当的方法（如亚硝酸铝沉淀法）沉淀膜蛋白。
2. 蛋白定量：用BCA或Bradford方法测定蛋白浓度。
3. SDS-PAGE电泳：将膜蛋白样品加入含有SDS的样品缓冲液中，加热变性，然后在聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳。
4. Western blot：将凝胶电泳后的蛋白转移到PVDF或nitrocellulose膜上，用特异性抗体探测膜蛋白的存在。
5. 二抗结合：将与特异性抗体结合的二抗与酶标记共同作用于蛋白，然后用化学发光或显色底物观察膜蛋白。
通过上述实验方法及步骤，可以较为准确地鉴定膜蛋白的存在与表达水平，为深入研究膜蛋白的生物学功能和调控机制提供重要的实验数据。
希望以上内容对您有所帮助。
第二篇示例：膜蛋白是生物体中存在的一种具有重要功能的蛋白质，它主要存在于细胞膜中，起着传递信号、运输物质等重要作用。
鉴定膜蛋白的实验方法和步骤对于研究膜蛋白的功能和结构具有重要意义。
下面将介绍一种常用的鉴定膜蛋白的实验方法及步骤。
westernblot原理
westernblot原理Western blot原理。
Western blot，又称免疫印迹，是一种用于检测特定蛋白质的技术。
它是通过将待检样品中的蛋白质分离、转移至膜上，然后使用特异性抗体结合目标蛋白质，最终通过化学发光或染色的方法来检测目标蛋白质的存在与否。
Western blot技术在生物医学研究中得到广泛应用，尤其在分子生物学、免疫学和生物化学领域。
首先，进行Western blot实验需要进行蛋白质的分离。
通常采用SDS-PAGE凝胶电泳技术，将待检样品中的蛋白质按照大小分离开来。
SDS-PAGE凝胶电泳是一种将蛋白质按照大小进行分离的技术，其原理是利用SDS对蛋白质进行线性化处理，使得蛋白质获得了相同的电荷密度，然后根据其大小在凝胶中进行分离。
分离后的蛋白质将会转移到膜上，以便后续的抗体结合。
其次，蛋白质的转移是Western blot技术中的关键步骤。
通过将SDS-PAGE凝胶中分离的蛋白质转移到膜上，可以使得蛋白质更易于与抗体结合。
通常使用半湿法或全湿法进行蛋白质的转移，这些方法能够确保蛋白质均匀地转移到膜上，并且保持其在凝胶中的空间结构。
蛋白质转移后，膜上的蛋白质将会与特异性抗体结合。
最后，Western blot的结果可以通过化学发光或染色的方法来检测。
在化学发光法中，膜上的蛋白质与特异性抗体结合后，可以加入辅助试剂使得蛋白质发出化学发光信号，通过光学设备来检测信号的强度从而确定蛋白质的表达水平。
而在染色法中，膜上的蛋白质与特异性抗体结合后，可以使用染色剂将蛋白质标记出来，然后通过凝胶成像系统来观察蛋白质的表达情况。
总之，Western blot技术是一种重要的蛋白质检测方法，其原理简单清晰，操作相对容易。
通过将待检样品中的蛋白质分离、转移至膜上，然后使用特异性抗体结合目标蛋白质，最终通过化学发光或染色的方法来检测目标蛋白质的存在与否。
在生物医学研究中，Western blot技术的应用将会继续发挥重要作用，为科学研究和临床诊断提供帮助。
免疫印迹法
免疫印迹法免疫印迹法（immunobiotting test，IBT）亦称酶联免疫电转移印斑法（enzyme linked immunoelectrotransfer blot，EITB），因与Southern早先建立的检测核酸的印迹方法 Southern blot 相类似，亦被称为Western-blot。
免疫印迹法分三个阶段进行。
第一阶段为SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）：抗原等蛋白样品经SDS处理后带阴电荷，在聚丙烯酰胺凝胶中从阴极向阳极泳动，分子量越小，泳动速度就越快。
此阶段分离效果肉眼不可见（只有在染色后才显出电泳区带）。
第二阶段为电转移：将在凝胶中已经分离的条带转移至硝酸纤维素膜上，选用低电压（100V）和大电流（1～2A），通电45min 转移即可完成。
此阶段分离的蛋白质条带肉眼仍不可见。
第三阶段为酶免疫定位：将印有蛋白质条带的硝酸纤维素膜（相当于包被了抗原的固相载体）依次与特异性抗体和酶标第二抗体作用后，加入能形成不溶性显色物的酶反应底物，使区带染色。
常用的HRP底物为3，3’-二氨基联苯胺（呈棕色）和4-氯-1-萘酚（呈蓝紫色）。
阳性反应的条带清晰可辨，并可根据SDS-PAGE时加入的分子量标准，确定各组分的分子量。
本法综合了SDS-PAGE的高分辨力和ELISA法的高特异性和敏感性，是一个有效的分析手段，不仅广泛应用于分析抗原组分及其免疫活性，并可用于疾病的诊断。
在艾滋病病毒感染中此法作为确诊试验。
抗原经电泳转移在硝酸纤维素膜上后，将膜切成小条，配合酶标抗体及显色底物制成的试剂盒，可方便地在实验室中供检测用。
根据出现显色线条的位置可判断有无针对病毒的特异性抗体。
一． SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）基本原理是聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺单体acr聚合成长链并通过双功能化合物甲叉双丙烯酰胺Bis交联而成的三维网状结构凝胶。
聚丙烯酰胺凝胶的机械性、弹性、透明度、粘着度取决于凝胶的总浓度，总浓度越大，平均孔径越小，机械强度越强。
蛋白质免疫印迹实验WesternBlot
摇动，待所检测的蛋白带显色达到最深程度后，将硝 酸纤维素薄膜转入 PBS 溶液中停止显色反应。取出 硝酸纤维素薄膜，自然晾干后拍照保存结果。
四 思考题
• 1. 为什么裁剪的滤纸必须与凝胶大小 完全一致？若不是这样结果会怎样？
• 2. 电转移时为什么都必须带手套小心 操作并除去气泡， 否则结果会怎样？
• 在进色后应时应注意哪些问题？ • 请简述免疫印迹实验的原理，并将之与
免疫学相关概念联系起来。
2024/2/11
2024/2/11
一 实验原理
• 电泳将蛋白质从凝胶转移到固体支持物 上是通过电转移仪器完成的。它是将固 体支持物面对阳极、凝胶面对阴极，二 者结合在一起，然后将外面二侧用 Whatman 3MM滤纸结合，形成“三明治 ”结构，放入电转移仪器上，加入电泳 缓冲液，通上电源后，蛋白质即可从凝 胶上转移到固体支持物上。
2024/2/11
一 实验原理
其定量关系符合以下公式： • Ve=Vo+KV1 • Ve：某一溶质的洗脱体积 • Vo：层析柱的外水体积 • Vi：层析柱的内水体积 • K：某一溶质的分配系数
2024/2/11
二试剂和器材
1．试剂
电转移缓冲液 pH8.3 • 39mM甘氨酸 • 4.8mM Tris碱 • 0.037% SDS • 20% 甲醇 • 混合2.9克甘氨酸，5.8克Tris,0.37克SDS,加200ml甲2源自24/2/11三 操作步骤
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
八、检测 根据标记二抗的标记物不同,其杂交的结果检测方法 也不同,较常用的检测系统有增强化学发光(ECL)和 DAB检测系统. 1) 辣根过氧化物酶-DAB法: ①DAB显色液的配制:按照1mlH2O加显色剂A,B,C 各1滴,混匀. ②显色:将适量DAB显色液平铺在二抗杂交后的印迹 膜上,室温放置观察,可出现明显的棕褐色蛋白显色 带 ③终止:用Tris-HCl缓冲液或水漂洗杂交膜即可终止 反应.
凝胶浓度 (T) 的选择与被分离物质分子量密切 相关。 表3.4 分子量范围与凝胶浓度的关系
分子量范围 适用的凝胶浓度/(%)
蛋
10KD 1O-40KD 1O-100KD 100KD 500KD
白 质
20-30 15-20 10-15 5-10 2-5
分离胶的聚合（12%）
5ml体系
七、抗体杂交 抗体表面主要采用间接法。即先加入未标记特 异性抗体与膜上抗原结合，再加入标记的抗体 进行杂交检测，标记二抗物质有放射性核素、 酶以及生物素等。 杂交过程： １）封闭后的杂交膜放入杂交袋中，加入抗体 稀释液稀释的一抗，封口，4℃孵育过夜或室温 （22-25℃）摇动孵育2h. ２） 液洗膜3次x10min ３）标记的二抗室温1h，洗膜3x10min
考马斯亮蓝和DAB
考马斯亮蓝染色： 将凝胶取出放入培养皿中加入少量的染色液，以浸没凝胶为宜，在摇床 上震荡，直到凝胶上出现明显的条带为止，一般5-6小时或者4℃过夜。 然后倾去染色液，用脱色液洗涤震荡，其间要不断换脱色液，直至脱色 液颜色稍清亮，凝胶背景清楚为止。 DAB显色
常见问题及解决方案
注意事项:
1. 免疫印迹杂交的敏感与检测系统有关。因此，凝胶电 泳时的蛋白上样量应该保证被检测抗原量不至于太低， 如果过低应该重新纯化和浓缩使用，或者建议做一次 梯度稀释，上样电泳后，直接考马斯亮蓝染色选择最 佳上样量。 2. 形成凝胶的试剂要有足够的纯度，激活剂的浓度适当， 不仅可以决定凝胶聚合的速度，也将影响凝胶的质量， 凝胶时的温度也将影响凝胶聚合的速度。因此，建议 要根据不同温度下适量增减激活剂的用量以保证分离 胶从加入激活剂起至开始出现凝胶凝聚的时间为1520分钟最佳，对于浓缩胶最佳聚合时间为8-10分钟 开始可见聚合。灌完分离胶加水封闭分离胶与外界氧 气的结合。
3、电泳 将电泳仪与电源接通，打开电泳仪稳流，开始时电 流约20mA，待样品进入分离胶后，将电流调至25-30 mA，当溴酚蓝染料距底框0.5cm时，停止电泳，关闭 电源
4、染色与脱色 电泳结束后，取下凝胶板，用胶铲撬开短玻璃板，从 凝胶板上切下一角作为加样标记。加入染色液染色1-2 h，再加自来水(加几滴3MKCl)煮沸三次(10min/次)脱色， 则可见蛋白质区带清晰。
2) 辣根过氧化物酶-ECL法： 增强化学发光(ECL)检测是利用辣根过氧化物酶催化化 学发光物质，生成一种不稳定的中间物质，其衰变时在 暗室内形成明显的肉眼可见的化学发光带，利用X线胶 片感光原理,将结果记录下来。 ECL显色剂配制：按EP管中加显色剂A、B各1滴,混匀， 在暗室将杂交后印迹膜放入显色盒中，加上混合好的显 色液，反应1-5分钟， 用纸巾吸去印迹膜边缘或者边角 部分多余的显色液，将一透明的保鲜膜盖住抚平，并确 定干的表面与胶片接触。 将印迹膜在暗室中使胶片暴光1-5分钟，冲洗胶片以确定 所测抗原的正确暴光时间，暴光时间可短至几秒也可以 长到数小时。 冲洗胶片步骤：先在显影液中冲洗至胶片上出现条带或 者胶片透明为止，在放入定影液中漂洗，十秒即可。
30%丙烯酰胺的配制
1、称量Acrylamide290g，Bis10 g，置于1 L烧 杯中 2、向烧杯中加入约600 ml的去离子水，充分搅 拌溶解。 3、 加去离子水将溶液定容至1 L，用0.45 mm滤 膜滤去杂质。 4. 于棕色瓶中4℃保存。 注意：丙烯酰胺具有很强的神经毒性，并可通过 皮肤吸收，其作用具有积累性，配制时应戴手套、 口罩等。聚丙烯酰胺无毒，但也应谨慎操作，因 为有可能含有少量的未聚合成份。
5、转移电泳： 凝胶电泳结束前30min，将PDVF膜浸泡 在转移缓冲液中。从模具中取出凝胶放在 PDVF膜上，驱除气泡，然后置于滤纸上 放入转移模具中，将模具放入转移电泳槽， PDVF膜一面朝正极，恒压100伏70min， 4℃电泳过夜，次日取出PDVF膜做好标 记。
六、膜的封闭 在进行抗体杂交之前，需要先对转印膜进行封闭，以防止免 疫试剂的非特异性吸附。封闭一般采用异源性蛋白质或去污 剂，常用的有0.2%Tween-20，20%BSA，5%脱脂奶等，至 于选择哪一类封闭液，首先应考虑与检测试剂相适应，如采 用葡萄球蛋白A（SPA）作用检测试剂，就不能用全血清封 闭，其次是尽可能使非特异着色背静浅，封闭液以20%BSA 效果较好，其次是5%N-fat milk. 封闭过程： 1) 洗转印膜：室温漂洗3次x10min,以尽量洗去转印膜上的 SDS，防止影响后面的抗体结合。 2) 取漂洗的转印膜，放入5% No-fat milk的封闭液内，摇床 震动，室温封闭1h，也可在4度过夜。 3) 用1xTBS-T ，PH7.6洗液，室温漂洗3次x10min.
蒸馏水 30%丙烯酰胺 1.5MpH8.8 Tris-SDS 10%AP 1.634ml 2.0ml 3.7ml 25ul
Байду номын сангаас
TEMED
5ul
上层加异丙醇压胶，室温一小时
积层胶的聚合（5%）
2.5ml体系
蒸馏水 1.75ml
30%丙烯酰胺
1MpH6.8 Tris-SDS 10%AP TEMED 室温一小时
3. 未聚合的丙烯酰胺具有神经毒性，操作时应该戴手套 口罩防护。梳子插入浓缩胶时，应确保没有气泡，可将 梳子稍微倾斜插入以减少气泡的产生，梳子拔出来时应 该小心，不要破坏加样孔，如有加样孔上的凝胶歪斜可 用针头插入加样孔中纠正，但要避免针头刺入胶内。 4. 电泳槽内加入电泳缓冲液冲洗清除黏附在凝胶底部的 气和未聚合的丙烯酰胺，同时建议低电压短时间的预电 泳，清除凝胶内的杂质，疏通凝胶孔径以保证电泳过程 中电泳的畅通(恒压10-20V，20-30min) 5. 加样前样品应先离心，尤其是长时间放置的样品，以 减少蛋白质沉淀堵塞胶孔。 6. 为避免边缘效应，可在未加样的孔中加入等量的样品 缓冲液。
0.413ml
0.338ml 12.5ul 2.5ul
过程图
http://202.114.128.248/newkj/my/moban2/index.htm
（二）方法 1、制胶：制备凝胶板，将混合后的分离胶溶液，用1ml枪加 至距梳齿下缘约1 cm。用1 mL枪在凝胶表面沿短玻璃板边缘轻 轻加一层异丙醇(约高3–4 mm)，用于隔绝空气，使胶面平整。 约30-60 min凝胶完全聚合，则可看到水与凝固的胶面有折射率 不同的界线。 将异丙醇倒去用重蒸水洗净胶面，将混合均匀后的浓缩胶溶液 加入分离胶上方，轻轻插入梳子. 待上层胶聚合，拔出梳子，放 入电泳槽，加入电极缓冲液，使液面没过短玻璃板约0.3 cm，即 可加样。 2、样品处理： 样品经反复冻融裂解，离心，测浓度后，向样品中加入适量的 上样缓冲液6*SDS，金属浴105°C 10min，加样量一般每个样 品池10~40l。
SDS－PAGE电泳分离蛋白质与 蛋白质免疫印迹
蛋白免疫印迹杂交（Western Blot ）是将 蛋白样本通过聚丙烯酰胺电泳按分子量大 小分离，再转移到杂交膜（blot）上，然后 通过一抗/二抗复合物对靶蛋白进行特异性 检测的方法。WB是进行蛋白质分析最流行 和成熟的技术之一。
原理
聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺 (Acr)和交 联剂 N,N- 甲叉双丙烯酰胺 (Bis)在加速剂 N， N， N，N—四甲基乙二胺(简称TEMED)和催化剂过 硫酸铵(简称AP)作用下聚合交联成三维网状结 构的凝胶，以此凝胶为支持物的电泳称为聚丙 烯酰胺凝胶电泳(PAGE)。
7. 样品缓冲液中煮沸的样品可在-20℃存放数 月，但是反复冻融会使蛋白质降解。 8. 为减少蛋白质条带的扩散，上样后应尽快进 行电泳，电泳结束后也应尽快转印。 9. 上样时，小心不要使样品溢出而污染相临加 样孔。 10. 取出凝胶后应注意分清上下，可用刀片切 去凝胶的一角作为标记(如左上角)，转膜时也 应用同样的方法对PDVF膜做上标记(如左上角) 以分清正反面和上下关系。 11. 转膜时应依次放好PDVF膜与凝胶所对应 的电极，即凝胶对应负极。PDVF膜对应正极。