SDS-PAGE电泳分离蛋白质与蛋白质免疫印迹

3、电泳 将电泳仪与电源接通，打开电泳仪稳流，开始时电 流约20mA，待样品进入分离胶后，将电流调至25-30 mA，当溴酚蓝染料距底框0.5cm时，停止电泳，关闭 电源
4、染色与脱色 电泳结束后，取下凝胶板，用胶铲撬开短玻璃板，从 凝胶板上切下一角作为加样标记。加入染色液染色1-2 h，再加自来水(加几滴3MKCl)煮沸三次(10min/次)脱色， 则可见蛋白质区带清晰。
注意事项:
1. 免疫印迹杂交的敏感与检测系统有关。因此，凝胶电 泳时的蛋白上样量应该保证被检测抗原量不至于太低， 如果过低应该重新纯化和浓缩使用，或者建议做一次 梯度稀释，上样电泳后，直接考马斯亮蓝染色选择最 佳上样量。 2. 形成凝胶的试剂要有足够的纯度，激活剂的浓度适当， 不仅可以决定凝胶聚合的速度，也将影响凝胶的质量， 凝胶时的温度也将影响凝胶聚合的速度。因此，建议 要根据不同温度下适量增减激活剂的用量以保证分离 胶从加入激活剂起至开始出现凝胶凝聚的时间为1520分钟最佳，对于浓缩胶最佳聚合时间为8-10分钟 开始可见聚合。灌完分离胶加水封闭分离胶与外界氧 气的结合。
考马斯亮蓝和DAB
考马斯亮蓝染色： 将凝胶取出放入培养皿中加入少量的染色液，以浸没凝胶为宜，在摇床 上震荡，直到凝胶上出现明显的条带为止，一般5-6小时或者4℃过夜。 然后倾去染色液，用脱色液洗涤震荡，其间要不断换脱色液，直至脱色 液颜色稍清亮，凝胶背景清楚为止。 DAB显色
常见问题及解决方案

凝胶浓度 (T) 的选择与被分离物质分子量密切 相关。 表3.4 分子量范围与凝胶浓度的关系
分子量范围 适用的凝胶浓度/(%)
蛋
10KD 1O-40KD 1O-100KD 100KD 500KD
白 质
20-30 15-20 10-15 5-10 2-5
分离胶的聚合（ห้องสมุดไป่ตู้2%）
5ml体系
七、抗体杂交 抗体表面主要采用间接法。即先加入未标记特 异性抗体与膜上抗原结合，再加入标记的抗体 进行杂交检测，标记二抗物质有放射性核素、 酶以及生物素等。 杂交过程： １）封闭后的杂交膜放入杂交袋中，加入抗体 稀释液稀释的一抗，封口，4℃孵育过夜或室温 （22-25℃）摇动孵育2h. ２） 液洗膜3次x10min ３）标记的二抗室温1h，洗膜3x10min
2) 辣根过氧化物酶-ECL法： 增强化学发光(ECL)检测是利用辣根过氧化物酶催化化 学发光物质，生成一种不稳定的中间物质，其衰变时在 暗室内形成明显的肉眼可见的化学发光带，利用X线胶 片感光原理,将结果记录下来。 ECL显色剂配制：按EP管中加显色剂A、B各1滴,混匀， 在暗室将杂交后印迹膜放入显色盒中，加上混合好的显 色液，反应1-5分钟， 用纸巾吸去印迹膜边缘或者边角 部分多余的显色液，将一透明的保鲜膜盖住抚平，并确 定干的表面与胶片接触。 将印迹膜在暗室中使胶片暴光1-5分钟，冲洗胶片以确定 所测抗原的正确暴光时间，暴光时间可短至几秒也可以 长到数小时。 冲洗胶片步骤：先在显影液中冲洗至胶片上出现条带或 者胶片透明为止，在放入定影液中漂洗，十秒即可。
7. 样品缓冲液中煮沸的样品可在-20℃存放数 月，但是反复冻融会使蛋白质降解。 8. 为减少蛋白质条带的扩散，上样后应尽快进 行电泳，电泳结束后也应尽快转印。 9. 上样时，小心不要使样品溢出而污染相临加 样孔。 10. 取出凝胶后应注意分清上下，可用刀片切 去凝胶的一角作为标记(如左上角)，转膜时也 应用同样的方法对PDVF膜做上标记(如左上角) 以分清正反面和上下关系。 11. 转膜时应依次放好PDVF膜与凝胶所对应 的电极，即凝胶对应负极。PDVF膜对应正极。
3. 未聚合的丙烯酰胺具有神经毒性，操作时应该戴手套 口罩防护。梳子插入浓缩胶时，应确保没有气泡，可将 梳子稍微倾斜插入以减少气泡的产生，梳子拔出来时应 该小心，不要破坏加样孔，如有加样孔上的凝胶歪斜可 用针头插入加样孔中纠正，但要避免针头刺入胶内。 4. 电泳槽内加入电泳缓冲液冲洗清除黏附在凝胶底部的 气和未聚合的丙烯酰胺，同时建议低电压短时间的预电 泳，清除凝胶内的杂质，疏通凝胶孔径以保证电泳过程 中电泳的畅通(恒压10-20V，20-30min) 5. 加样前样品应先离心，尤其是长时间放置的样品，以 减少蛋白质沉淀堵塞胶孔。 6. 为避免边缘效应，可在未加样的孔中加入等量的样品 缓冲液。
SDS－PAGE电泳分离蛋白质与 蛋白质免疫印迹
蛋白免疫印迹杂交（Western Blot ）是将 蛋白样本通过聚丙烯酰胺电泳按分子量大 小分离，再转移到杂交膜（blot）上，然后 通过一抗/二抗复合物对靶蛋白进行特异性 检测的方法。WB是进行蛋白质分析最流行 和成熟的技术之一。
原理
聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺 (Acr)和交 联剂 N,N- 甲叉双丙烯酰胺 (Bis)在加速剂 N， N， N，N—四甲基乙二胺(简称TEMED)和催化剂过 硫酸铵(简称AP)作用下聚合交联成三维网状结 构的凝胶，以此凝胶为支持物的电泳称为聚丙 烯酰胺凝胶电泳(PAGE)。
30%丙烯酰胺的配制
1、称量Acrylamide290g，Bis10 g，置于1 L烧 杯中 2、向烧杯中加入约600 ml的去离子水，充分搅 拌溶解。 3、 加去离子水将溶液定容至1 L，用0.45 mm滤 膜滤去杂质。 4. 于棕色瓶中4℃保存。 注意：丙烯酰胺具有很强的神经毒性，并可通过 皮肤吸收，其作用具有积累性，配制时应戴手套、 口罩等。聚丙烯酰胺无毒，但也应谨慎操作，因 为有可能含有少量的未聚合成份。
0.413ml
0.338ml 12.5ul 2.5ul
过程图
http://202.114.128.248/newkj/my/moban2/index.htm
（二）方法 1、制胶：制备凝胶板，将混合后的分离胶溶液，用1ml枪加 至距梳齿下缘约1 cm。用1 mL枪在凝胶表面沿短玻璃板边缘轻 轻加一层异丙醇(约高3–4 mm)，用于隔绝空气，使胶面平整。 约30-60 min凝胶完全聚合，则可看到水与凝固的胶面有折射率 不同的界线。 将异丙醇倒去用重蒸水洗净胶面，将混合均匀后的浓缩胶溶液 加入分离胶上方，轻轻插入梳子. 待上层胶聚合，拔出梳子，放 入电泳槽，加入电极缓冲液，使液面没过短玻璃板约0.3 cm，即 可加样。 2、样品处理： 样品经反复冻融裂解，离心，测浓度后，向样品中加入适量的 上样缓冲液6*SDS，金属浴105°C 10min，加样量一般每个样 品池10~40l。
八、检测 根据标记二抗的标记物不同,其杂交的结果检测方法 也不同,较常用的检测系统有增强化学发光(ECL)和 DAB检测系统. 1) 辣根过氧化物酶-DAB法: ①DAB显色液的配制:按照1mlH2O加显色剂A,B,C 各1滴,混匀. ②显色:将适量DAB显色液平铺在二抗杂交后的印迹 膜上,室温放置观察,可出现明显的棕褐色蛋白显色 带 ③终止:用Tris-HCl缓冲液或水漂洗杂交膜即可终止 反应.
5、转移电泳： 凝胶电泳结束前30min，将PDVF膜浸泡 在转移缓冲液中。从模具中取出凝胶放在 PDVF膜上，驱除气泡，然后置于滤纸上 放入转移模具中，将模具放入转移电泳槽， PDVF膜一面朝正极，恒压100伏70min， 4℃电泳过夜，次日取出PDVF膜做好标 记。
六、膜的封闭 在进行抗体杂交之前，需要先对转印膜进行封闭，以防止免 疫试剂的非特异性吸附。封闭一般采用异源性蛋白质或去污 剂，常用的有0.2%Tween-20，20%BSA，5%脱脂奶等，至 于选择哪一类封闭液，首先应考虑与检测试剂相适应，如采 用葡萄球蛋白A（SPA）作用检测试剂，就不能用全血清封 闭，其次是尽可能使非特异着色背静浅，封闭液以20%BSA 效果较好，其次是5%N-fat milk. 封闭过程： 1) 洗转印膜：室温漂洗3次x10min,以尽量洗去转印膜上的 SDS，防止影响后面的抗体结合。 2) 取漂洗的转印膜，放入5% No-fat milk的封闭液内，摇床 震动，室温封闭1h，也可在4度过夜。 3) 用1xTBS-T ，PH7.6洗液，室温漂洗3次x10min.
蒸馏水 30%丙烯酰胺 1.5MpH8.8 Tris-SDS 10%AP 1.634ml 2.0ml 3.7ml 25ul
TEMED
5ul
上层加异丙醇压胶，室温一小时
积层胶的聚合（5%）
2.5ml体系
蒸馏水 1.75ml
30%丙烯酰胺
1MpH6.8 Tris-SDS 10%AP TEMED 室温一小时