QIAGEN DNA甲基化试剂盒说明中文版

QIAGEN EpiTect® Bisulfite

•重亚硫酸盐处理DNA时，

需要经高盐浓度、高温和低PH

条件，会导致DNA断裂和片段

化，并在随后的纯化过程中丢

失，所以需要大量的input DNA

•重亚硫酸盐转化未甲基化

的胞嘧啶，转化率超过99%

•Bisulfite Mix 足够做8个

反应，用时要将Bisulfite Mix

溶于800μl RNase-free water中，

溶解的Bisulfite Mix 在-20℃可

以保存4周

•DNA Protect Buffer 能保

护重亚硫酸盐处理的DNA在高

温、低ph条件下被片段化

•Carrier RNA 能提高小量

DNA（小于500pg，体积大于

40μl）绑定在回收柱滤膜上的

效率，帮助核酸沉淀；总量大

于100ng的基因组DNA没有必

要加Carrier RNA

•EpiTect Bisulfite Kit 在-20℃

可以保存3年；可以适用于大

范围的DNA量，input DNA范

围为1ng~2μg；模板DNA片段

范围可以在500bp~30kb之间

DNA量在1ng~2μg之间，体积20μl以上

开始前的准备重点：

•Bisulfite Mix 足够做8个反应，如果样本少于8个，可以把溶解的Bisulfite Mix 保存于-20℃，4周内并不会影响其性能

•DNA Protect Buffer在加入DNA–Bisulfite Mix后会由绿变蓝（step 2），表明溶液混合很充分且PH值正确

•所有的离心分离步骤均在室温（15–25°C）下完成

开始前准备的东西：

•加入30ml乙醇（96%~100%）到Buffer BW中，室温（15–25°C）保存，使用之前摇匀•加入27ml乙醇（96%~100%）到Buffer BD中，2~8℃保存，使用之前摇匀，使用之后要立即盖上盖子。储存一段时间后底部可能会出现白色沉淀，沉淀不影响Buffer BD的性能，但是还是要避免将沉淀吸到回收柱中。

•加入310μl RNase-free water到冻干的carrier RNA（310 μg）中，配成1 μg/μl的溶液。当一次处理48个样本，将溶解的carrier RNA加入到Buffer BL的瓶子中，摇匀并确认瓶盖标签。如果处理的样本较少，则将溶解的carrier RNA分装，并储存于-20℃，分装的carrier RNA能保存1年。如果少于48个样本要在2周之内完成处理，则参照表1的体积比取一定体积的Buffer BL与carrier RNA混合。DNA量大于100ng不需要加carrier RNA。如果Buffer BL有沉淀，则需加热（最高不超过70℃）并温和搅拌使其溶解。

表1 Buffer BL与carrier RNA的体积比

•室温平衡样本和Buffers

重亚硫酸盐转化DNA

1.融化DNA备用，溶解Bisulfite Mix，加入800μl RNase-free water，混匀5min使其完全溶

解。如有必要，60℃加热并混匀Bisulfite Mix–RNase-free water溶液使其溶解。注意不要将溶解的Bisulfite Mix置于冰上。

2.在200μl离心管中配制重亚硫酸盐转化反应液，参照表2配制反应体系，DNA体积不足

20μl则用RNase-free water补足。（处理低浓度DNA（1~500ng或小于500pg）时，DNA 体积增加到40μl，DNA Protect Buffer减少为15μl，总体积140μl不变）

表2 重亚硫酸盐转化反应体系

3.盖上PCR管盖，混匀反应液，置于室温（15–25°C）。DNA Protect Buffer在加入DNA–Bisulfite

Mix后会由绿变蓝，表明混匀充分且PH值正确。

4.在循环加热器上进行重亚硫酸盐转化DNA反应，反应条件参照表3。整个反应过程需要

5h。

表3 重亚硫酸盐转化反应条件

5.将PCR管放入循环加热器中，开始转化反应。注意PCR管中不要加入矿物油，保证管盖

密封。已经转化的DNA可以在循环加热器中保存过夜，不会影响其性能。

纯化重亚硫酸盐转化的DNA

6.待转化反应完成之后，取出PCR管，瞬时离心，再将PCR管中的反应液转到一个1.5ml

的干净的离心管中。转移反应液不影响其性能。

7.在每个样本中加入560μl现配的Buffer BL（参照表1加入10μg/ml carrier RNA），涡流混

匀并瞬时离心。如果DNA大于100ng，则不需要加入carrier RNA。（处理FFPE样本或DNA量小于500pg的样本时，加入现配的Buffer BL的体积减少为310μl（加入10μg/ml carrier RNA），混匀离心，之后再加入250μl 96~100% 乙醇，混匀15s后瞬时离心）

8.将收集管和回收柱按样本编号并放置在架子上，将1.5ml离心管中的样本混合液全部转

移到相应的回收柱内。

9.以离心机最大转速离心1min，弃收集管内的液体，再将回收柱放回收集管中。

10.在每个回收柱内加入500 μl Buffer BW（wash buffer），用最大转速离心1min，弃收集管

内的液体，再将回收柱放回收集管中。

11.在每个回收柱内加入500 μl Buffer BD（desulfonation buffer，脱磺酸基），盖上回收柱盖

子，室温（15–25°C）放置15min。如果Buffer BD中有沉淀，避免将沉淀加到回收柱内。

装有Buffer BD的瓶子在使用后要立即盖上盖子，避免接触的空气中的CO2发生酸化。

12.以离心机最大转速离心1min，弃收集管内的液体，再将回收柱放回收集管中。

13.在每个回收柱内加入500 μl Buffer BW，用最大转速离心1min，弃收集管内的液体，再

将回收柱放回收集管中。

14.重复步骤13一次。

15.将回收柱放到一个新的2ml收集管中，以离心机最大转速离心1min，移除所有的残余

液体。

16.（推荐）将回收柱放到一个干净的1.5ml离心管中，56℃加热5min，使残余的液体完全

蒸发。

17.再将回收柱转移到一个新的1.5ml离心管中，在每个回收柱的滤膜上加20μl Buffer EB，

然后15000g（12000rpm）离心1min洗脱DNA。要增加洗脱的DNA产量，可以再加20μl Buffer EB ，最大转速离心洗脱一次。洗脱的DNA如果要存放不超过24h，建议2~8℃保存；如果需要存放超过24h，建议-20℃保存。使用该试剂盒洗脱的已经转化的DNA可以在-20℃保存至少3年，其质量和性能不会降低。