生物化学实验报告

2012年生物化学实验B

实验报告

姓名：XXXX

学号：XXXXXX

实验时间：2012年11月17日实验分组：第7组

组内成员：XXXXXXXXXXX

XXXXXXXXXXX 任课教师：XXXX

摘要

本实验通过从小牛肠中通过刮去，离心，析出等方式提取小牛肠碱性磷酸酶，再通过SDS-聚丙烯凝胶电泳测定蛋白质相对分子量，利用考马斯亮蓝法测定蛋白质含量及测定酶的活性。

1.实验部分

1.1试剂与仪器

1.试剂：

（1）正丁醇、丙酮。

（2）1 mol/L 醋酸，1 mol/L NaOH，硫酸铵。

（3）平衡缓冲液：0.01 mol/L Tris-HCl，pH 8.0。

（4）底物缓冲液：1 mol/L 二乙醇胺-盐酸缓冲液。

（5）酶的底物溶液：用底物缓冲液配制15×10-3 mol/L 对硝基苯磷酸二钠溶液。

（6）30% 丙烯酰胺置棕色瓶。

（7）分离胶缓冲液：1.5 mol/L Tris-HCl缓冲液，pH 8.8，已加入10% SDS。

（8）浓缩胶缓冲液：0.5 mol/L Tris-HCl缓冲液，pH 6.8，已加入10% SDS。

（9）10% 过硫酸铵。

（10）TEMED（四甲基乙二胺）。

（11）上样缓冲液：称100 mg SDS、2 mg溴酚蓝、2 g甘油，加0.1 mL巯基乙醇、

2 mL 0.05mol/L pH 8.0 Tris-HCl，加超纯水定容至10 mL。

（12）染色液：配置含0.1% 考马斯亮蓝R250，40%甲醇和10%冰醋酸的染色液

500 mL，过滤后备用。

（13）脱色液：500 mL 10%甲醇和10%冰醋酸的脱色液1000 mL。

（14）电泳缓冲液。

2.仪器

匀浆机、eppebdorf5型冷冻离心机、GSY—2型恒温水浴、UV762型紫外可见分光光度计。离心管，剪刀，载玻片，不锈钢盘，搪瓷盘，滤布，漏斗，分液漏斗，量筒，烧杯，移液抢，比色皿，DYY—11型电泳仪，24D型电泳槽，制胶板，揺床，移液枪。

1.2 小牛肠碱性磷酸酶提取方法

1）取新鲜小牛肠，用剪刀剖开，用载玻片刮取小肠内粘膜，放到盘子一角。

2）将小肠粘膜液集中倒入匀浆机中，加冰冷蒸馏水，高速匀浆，重复多次。

3）缓慢加入冰冷正丁醇高速匀浆重复多次。在4℃，10000 rpm条件下离心。

4）用滤布过滤去除杂质，倒入分液漏斗中，静止分层，取下层水相，用HAc溶液调pH到4.9。4℃，10000 rpm，离心。

5）得到上清后放入离心管中，用NaOH溶液调pH至6.5，称取硫酸铵加到离心管中溶解；再加冰冷丙酮，混匀，4℃静置30 min以上。4℃，10000 rpm，离心。

6）上清液中加入冰冷丙酮，4℃放置30 min以上。4℃，10000 rpm，离心。

7）取沉淀溶于平衡缓冲液至全部溶解至冰箱保存待用。

8）底物处理：底物37℃水浴5 min。

1.3 小牛肠碱性磷酸酶酶活检测方法

1）将酶稀释10倍。

2）紫外分光光度计检测条件为405 nm波长，测定时间60 s，取值2 s，记录范围

0.0-1.5。3）取2个2 mL比色皿，加入上述（2）加热的底物缓冲液，校对归零。

4）将稀释10倍的酶液加到其中1个比色皿中（仪器外侧），用手堵住皿口。快速上下倒2次，放回分光光度计中，测定酶动力学曲线

1.4 聚丙烯凝胶制备

1）装板：将垂直板型电泳的玻璃片洗净、晾干；放好胶条，用夹子夹好玻璃板，上面插上梳子，垂直放置在水平台面上备用。

2）制备分离胶：在小烧杯中按下表配制所需浓度的分离胶。

分离胶制备（浓度10%，制备量10 mL）

试剂用量

H2O 4.1 mL

30% 丙烯酰胺 3.4 mL

1.5 mol/L Tris-HCl缓冲液pH 8.8

2.4 mL

10% 过硫酸铵100 μL

TEMED 10 μL

3）制备浓缩胶：在小烧杯中按下表配制所需浓度的浓缩胶。

浓缩胶制备（浓度5%，制备量6 mL）

试剂用量

H2O 3.4 mL

30% 丙烯酰胺 1.0 mL

0.5 mol/L Tris-HCl缓冲液pH 6.8 1.5 mL

10% 过硫酸铵60 μL

TEMED 8 μL

4）蛋白样品处理：在1.5 mL离心管中按1：1体积比例，加样品和上样缓冲液，100 C加热使蛋白变性。

5）浓缩胶完全聚合后，去掉夹子和胶条，拔去梳子，将凝胶玻璃板固定于电泳装置内槽上，加入电泳缓冲液，缓冲液高过玻璃板凹面。

1.5 考马斯亮蓝法测定蛋白质含量

1）玻璃试管中加入考马斯亮蓝。

2）在1.5 mL离心管中，取酶液分别稀释50、100、200倍。

3）各取100 μL加入到5 mL考马斯亮蓝试管中，混匀，反应5 min以上。

4）紫外分光光度计检测条件：595 nm 波长。

5）取2个比色皿，加入考马斯亮蓝，分光光度计中校对归零。

6）将样品放入外侧比色皿中，读吸光值。

7）根据蛋白浓度标准曲线，计算酶蛋白浓度。

1.6 SDS-聚丙烯凝胶电泳测定蛋白质相对分子量

1）用移液枪依次在泳道加样。

2）电泳：连接正、负极，待溴酚兰指示剂迁移至下沿处，停止电泳。

3）剥胶染色：电泳结束后，取出凝胶玻璃板，用水冲洗，将剥离下来的凝胶用水漂洗，转入染色缸中，加染色液，置摇床染色。

4）脱色：染色完毕，回收染色液，用水漂洗，加入脱色液，置摇床脱色，脱色至背景清晰。

5）观察测定蛋白的迁移率及条带，对照标准样品，分析蛋白样品的分子量及纯度。

6）拍照电泳结果，用于完成实验报告。