生物化学设计性实验

生物化学设计性实验

组员:

牛血清白蛋白的提取与鉴定

【实验目的】掌握牛血清白蛋白的提取与鉴定方法【实验原理】牛血清白蛋白是牛血清中的简单蛋白，是血液的主要成分(38／100ml)，分子量68KD。应用相同浓度硫酸铵盐析法降血清中白蛋白与其它球蛋白分离，最后用透析法除盐，即可提取白蛋白。再利用电泳过程中带电粒子的移动速度与粒子荷电量、电场强度、粒子重量与半径及介质的粘度等有关，对牛血清白蛋白进行分离与鉴定。

【实验步骤】

1.盐析取小牛血清0.5毫升+PBS0.5毫升+饱和硫

酸铵2.3毫升，充分混匀，静止20分钟，2500转／分离心10分钟。

2.透析取玻璃纸一张，折成袋形，将离心后的上

清液倒入袋内，用线扎紧上口（注意要留有空隙），放入装有自来水的小烧杯中透析，要不断搅拌，每隔2分钟换一次水，共换15次。用纳氏试剂检查带外液体的铵根离子，观察颜色变化，直至袋内盐分透析完毕。将袋内液体倾入试管，即得牛血清白蛋白溶液。

3.电泳

1）点样

取一张膜条，将薄膜无光泽面向下，放入培养皿

中的巴比妥缓冲液中使膜条充分浸透，取出，用

干净滤纸吸去多余的缓冲液，以薄膜的无光泽面

距一端1.5cm处作点样线，将牛血清样品与待测

的牛血清白蛋白溶液分别用点样器在同一张薄

膜的点样线处不同位置点样。

2）电泳

将点样后的膜条置于电泳槽架上，放置时无光泽

面向下，点样端置于阴极，平衡5分钟，开电源

160伏60分钟，关闭电源后用镊子将膜条取出。

3）染色

将膜条直接浸于盛有氨基黑10B的染料中，染2

分钟取出，立即浸于漂洗液中，分别在漂洗液1、

2、3中各漂洗5分钟，直至背景漂洗干净为止，

用滤纸吸干薄膜。

4.鉴定比较样品与待测液中白蛋白在薄膜上的电

泳结果，看位置是否是一致。

【实验仪器和试剂】

仪器：离心管、离心机、试管、玻璃纸、烧杯、比色瓷盘、滴管、玻璃棒、电泳仪、醋酸纤维素薄膜、分光光度计。

试剂：牛血清待测液、牛血清样品、PBS（磷酸盐缓冲溶液，用0.01mol／L磷酸盐缓冲液（pH7.2）配制的0.9％Nacl溶液、纳氏试剂、巴比妥缓冲液、氨基黑10B染色液、漂洗液、0.4N氢氧化钠溶液。

5.预测结果

位置一致，试验成功。若在待测液的电泳结果中出现其他球蛋白的黑带区域，则说明提取不够纯。