细胞破碎与固液分离技术
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第四章 细胞破碎和分离技术
（一）双水相分离技术 1、双水相体系简介
1896年，荷兰微生物学家Beijerinck发现
明胶
琼脂（或可溶性淀粉）
传统的双水相体系是指高聚物双水相体系
憎水程度有所差异
2、常用双水相体系 （1）聚乙二醇(PEG)/葡聚糖； （2）聚乙二醇(PEG)/盐相（硫酸盐或者磷酸盐）
聚乙二醇(PEG) 无毒、无刺激性，具有良好的水溶性
洋葱质壁分离
2、冷冻-融化法
（1）方法：将细胞放在低温下冷冻，然后在 室温中融化，反复多次而达到破壁作用。
（2）原理：一方面破坏细胞膜的通透性，另 一方面胞内水结晶，形成冰晶粒，细胞液浓度 增高引起细胞溶胀而破裂。
大肠杆菌：可用液氮/37℃反复冻融法破壁
适用于细胞壁较脆弱的菌体，需反复 多次，速率慢，产量低，在冻融过程 中可能引起某些蛋白质变性。
举例
珠磨法 固体剪切作用 便宜 大规模处理
高压匀浆法 液体剪切作用 适中 大规模处理 超声波法 液体剪切作用 昂贵 小规模处理
（二）物理法 1、渗透压冲击法 2、冷冻-融化法
1、渗透压冲击法（最温和）
将细胞放在高渗溶液中（如高浓度蔗糖溶液），由 于渗透压的作用，细胞内水分便向外渗出，细胞发 生收缩，当达到平衡后，将细胞转入水或低渗缓冲 液中，由于渗透压的突然变化，胞外的水迅速渗入 胞内，引起细胞快速膨胀而破裂。 仅适用 2、酸处理 3、化学试剂法
1、碱处理 pH值=11.5---12.5碱处理可导致细胞溶解。
优点：价格便宜，适于任何规模 的操作，易使蛋白使活。
2、酸热法
盐酸对细胞壁中的某些成分（主要是多糖和 蛋白质）的水解作用，使细胞壁结构变疏松， 同时经沸水浴处理，细胞吸水膨胀破裂。
缺点：破壁效果差，后续处理难除HCl。
细胞破碎与固液初级分离技术
法超 高 珠 捣 声压磨碎 波匀法法ຫໍສະໝຸດ 破浆 碎法机 械 破 碎 法
酶 酸 有 法渗 法冻 法 非
溶碱机 透 结 机
法法溶 压
--
械
剂冲融 破
法击化 碎
发酵液过滤特性的改变
降低液体粘度 调整pH 凝聚和絮凝 加入助滤剂 加入反应剂
杂质的去除
高价无机离子的去除 杂蛋白的去除
二、固液初级分离的方法与应用
离心分离 粗滤分离 泡沫分离
离心分离
离心分离设备 离心分离方法及其应用
离心分离设备
大容量冷冻离心机
离心分离方法及其应用
差速离心法 密度梯度离心法 等密度离心法
粗滤分离
粗滤分离设备 粗滤分离方法及应用
板框压滤机
泡沫分离
泡沫分离的原理 泡沫分离的应用
等密度离心的有效 分离仅取决于粒子 的密度差，与粒子 的大小和形状无关， 但是此二者决定着 达到平衡的速度、 时间和区带宽度。
细胞破碎与固液初级分离技术
第一节 细胞破碎技术
一、破碎方法
机械破碎法 非机械破碎法
二、选择破碎方法的依据
细胞的处理量 细胞壁的强度和结构 目标产物对破碎条件的敏感性 破碎程度
第二节 固—液初级分离 技术
一、发酵液的预处理
发酵液过滤特性的改变 杂质的去除
杂蛋白的去除
1、沉淀法：主要针对蛋白质。 2、吸附法：加入吸附剂或沉淀剂。 3、变性法：常用方法有加热、大幅度调 pH值、加有机溶剂或表面活性剂。
差速离心法：在不同离心速度及 不同离心时间下分批分离的方法。 一般用于分离沉降系数相差较大 的粒子，如常用于细胞匀浆中细
胞器的分离 。
细胞破碎与固液分离技术
精品PPT
第一节 发酵液的预处理技术 (jìshù)
3．凝聚和絮凝 凝聚和絮凝的主要作用为增大混合液中悬浮粒 子的体积，提高固液分离速度，同时可除去一些 (yīxiē)杂质。 （1）凝聚作用 凝聚作用是指在某些电解质作用下， 使胶体粒子聚集的过程。这些电解质称为凝聚剂。 胶体粒子能保持分散状态的原因是其带有相同电荷 和扩散双电层的结构。当分子热运动使粒子间距离 缩小到使它们的扩散层部分重叠时，即产生电排斥 作用，使两个粒子分开，从 精品PPT 而阻止了粒子的聚集。
加水稀释法可有效降低液体粘度，但会增加悬浮液的体 积，使后处理任务加大，并且只有当稀释后过滤速率提高的 百分比大于加水比时，从经济上才能认为有效。
精品PPT
第一节 发酵液的预处理技术 (jìshù)
升高温度可有效降低液体粘度，从而提高过滤速率，常用 于粘度随温度变化较大的流体。另外，应用加热法的同时，可 控制适当温度和受热时间，使蛋白质凝聚形成较大颗粒，进一 步改善发酵液的过滤特性。如链霉素发酵液，调酸至pH3.0后， 加热至70℃，维持半小时，液相粘度下降至1/6，过滤速率可 增大10～100倍。使用加热法时必须(bìxū)注意：①加热的温 度必须(bìxū)控制在不影响目的产物活性的范围内；②对于发 酵液，温度过高或时间过长，可能造成细胞溶解，胞内物质外 溢，而增加发酵液的复杂性，影响其后的产物分离与纯化。
精品PPT
第一节 发酵液的预处理技术 (jìshù)
常用的凝聚剂有AlCl3·6H2O、Al2(SO4)3·18H2O、 K2SO4·Al2(SO4)3·24H2O、FeSO4·7H2O、FeCl3·6H2O、 ZnSO4和MgCO3等。电解质凝聚能力可用凝聚值来表示，使胶粒 发生(fāshēng)凝聚作用的最小电解质浓度（mmol/L）称为凝 聚值。根据Schuze-Hardy法则，阳离子的价数越高，该值就越 小，即凝聚能力越强。阳离子对带负电荷的发酵液胶体粒子凝 聚能力的次序为：Al3+>Fe3+>H+>Ca2+>Mg2+>K+>Na+>Li+。
第一节 发酵液的预处理技术 (jìshù)
3．凝聚和絮凝 凝聚和絮凝的主要作用为增大混合液中悬浮粒 子的体积，提高固液分离速度，同时可除去一些 (yīxiē)杂质。 （1）凝聚作用 凝聚作用是指在某些电解质作用下， 使胶体粒子聚集的过程。这些电解质称为凝聚剂。 胶体粒子能保持分散状态的原因是其带有相同电荷 和扩散双电层的结构。当分子热运动使粒子间距离 缩小到使它们的扩散层部分重叠时，即产生电排斥 作用，使两个粒子分开，从 精品PPT 而阻止了粒子的聚集。
加水稀释法可有效降低液体粘度，但会增加悬浮液的体 积，使后处理任务加大，并且只有当稀释后过滤速率提高的 百分比大于加水比时，从经济上才能认为有效。
精品PPT
第一节 发酵液的预处理技术 (jìshù)
升高温度可有效降低液体粘度，从而提高过滤速率，常用 于粘度随温度变化较大的流体。另外，应用加热法的同时，可 控制适当温度和受热时间，使蛋白质凝聚形成较大颗粒，进一 步改善发酵液的过滤特性。如链霉素发酵液，调酸至pH3.0后， 加热至70℃，维持半小时，液相粘度下降至1/6，过滤速率可 增大10～100倍。使用加热法时必须(bìxū)注意：①加热的温 度必须(bìxū)控制在不影响目的产物活性的范围内；②对于发 酵液，温度过高或时间过长，可能造成细胞溶解，胞内物质外 溢，而增加发酵液的复杂性，影响其后的产物分离与纯化。
精品PPT
第一节 发酵液的预处理技术 (jìshù)
常用的凝聚剂有AlCl3·6H2O、Al2(SO4)3·18H2O、 K2SO4·Al2(SO4)3·24H2O、FeSO4·7H2O、FeCl3·6H2O、 ZnSO4和MgCO3等。电解质凝聚能力可用凝聚值来表示，使胶粒 发生(fāshēng)凝聚作用的最小电解质浓度（mmol/L）称为凝 聚值。根据Schuze-Hardy法则，阳离子的价数越高，该值就越 小，即凝聚能力越强。阳离子对带负电荷的发酵液胶体粒子凝 聚能力的次序为：Al3+>Fe3+>H+>Ca2+>Mg2+>K+>Na+>Li+。
第二章固液分离和细胞破碎案例
絮凝——指在某些高分子絮凝剂存在下，基于桥 架作用，使胶体颗粒交联成网，形成10mm大小 絮凝团的过程。
（1）凝聚
发酵液中的细胞、菌体或蛋白质等胶体粒子双电 层的结构使胶粒之间不易聚集而保持稳定的分散状态。
阳离子对带负电荷的胶粒凝聚能力的次序为： Al3+ >Fe3+ >H+ >Ca2+ >Mg2+ >K+ >Na+ >Li+ 常用的凝聚剂电解质有： 硫酸铝 Al2(SO4)3•18H2O(明矾) 氯化铝 AlCl3•6H2O 三氯化铁 FeCl3
B. 常用过滤设备
(1) 板框压滤机
广泛应用于培养基制备的过滤及霉菌、放线菌、酵母 菌和细菌等多种发酵液的固液分离。适合于固体含量 1-10%的悬浮液的分离。 优点:过滤面积大，结构简单，价格低，动力消耗少，
对不同过滤特性的发酵液适应性强。 缺点:不能连续操作，设备笨重，劳动强度大，卫生条 件差，非过滤的辅助时间较长。
第二章
固液分离和细胞破碎
目的
不仅在于分离细胞、菌体和其它悬浮颗粒（细胞碎 片、核酸和蛋白质的沉淀物）， 还希望除去部分可溶性杂质和改变滤液的性质，以 利于后继各步操作。
采用絮凝或凝聚的方法，设法增大悬浮液中固体粒子
的大小，提高其沉降速度；
或采用稀释、加热等方法降低黏度，以利于过滤。
第一节
二、发酵液的相对纯化 发酵液中的杂质
高价无机离子（Ca2+、Mg2+、Fe3+）
杂蛋白
在采用离子交换和吸附法提取时会降低其交换容量和 吸附能力， 在有机溶剂法或双水相萃取时，易产生乳化现象，使 两相分离不清。
在常规过滤或膜过滤时，易使过滤介质堵塞或受污染， 影响过滤效率。
（1）凝聚
发酵液中的细胞、菌体或蛋白质等胶体粒子双电 层的结构使胶粒之间不易聚集而保持稳定的分散状态。
阳离子对带负电荷的胶粒凝聚能力的次序为： Al3+ >Fe3+ >H+ >Ca2+ >Mg2+ >K+ >Na+ >Li+ 常用的凝聚剂电解质有： 硫酸铝 Al2(SO4)3•18H2O(明矾) 氯化铝 AlCl3•6H2O 三氯化铁 FeCl3
B. 常用过滤设备
(1) 板框压滤机
广泛应用于培养基制备的过滤及霉菌、放线菌、酵母 菌和细菌等多种发酵液的固液分离。适合于固体含量 1-10%的悬浮液的分离。 优点:过滤面积大，结构简单，价格低，动力消耗少，
对不同过滤特性的发酵液适应性强。 缺点:不能连续操作，设备笨重，劳动强度大，卫生条 件差，非过滤的辅助时间较长。
第二章
固液分离和细胞破碎
目的
不仅在于分离细胞、菌体和其它悬浮颗粒（细胞碎 片、核酸和蛋白质的沉淀物）， 还希望除去部分可溶性杂质和改变滤液的性质，以 利于后继各步操作。
采用絮凝或凝聚的方法，设法增大悬浮液中固体粒子
的大小，提高其沉降速度；
或采用稀释、加热等方法降低黏度，以利于过滤。
第一节
二、发酵液的相对纯化 发酵液中的杂质
高价无机离子（Ca2+、Mg2+、Fe3+）
杂蛋白
在采用离子交换和吸附法提取时会降低其交换容量和 吸附能力， 在有机溶剂法或双水相萃取时，易产生乳化现象，使 两相分离不清。
在常规过滤或膜过滤时，易使过滤介质堵塞或受污染， 影响过滤效率。
发酵液预处理办法细胞破碎和固液分离
❖ 化学试剂处理
表面活性剂：十二烷基磺酸钠（SDS)，Triton X100,十四烷基胺盐(CTAB);
螯合剂：乙二胺四乙酸（EDTA），与金属离子结合， 如阴性菌外层Mg2+、Ca2+处理的方法;
有机溶剂:如苯、甲苯、丁醇、丙酮、氯仿及尿素。 这些试剂容易引起生化物质破坏，还会带来分离和 回收化学物质的问题。
过滤助剂
过滤助剂可解决两个问题
➢滤饼的可压缩性问题 ➢小粒子如菌丝碎片和细菌细胞，会渗入到转
鼓真空过滤预覆盖层内部，堵塞部分孔。
常用的过滤助剂 硅藻土、珍珠岩、活性白土
助滤剂两种加入方法
助滤剂用量等于悬浮 液中固体含量
预先铺一层助滤剂 (1~2mm)
（2） 过滤设备
➢板框过滤机 ➢真空转鼓过滤机 ➢加压叶滤机 ➢带式过滤机 ➢袋式过滤机
非机械方法 ：辅助方法
– 2.2.3.2 化学和生物化学渗透 （1）酸碱处理；（2）化学试剂处理； （3）酶溶 – 2.2.3.3 物理渗透法 （1）渗透压冲击；（2）冻结-融化法
2.2.3.1 机械破碎
细胞匀浆液
（1）
阀座
高
压
匀 细胞悬浮液
浆
法
碰撞环 阀
图2.11 高压匀浆器结构简图
• 破碎原理：
• 离心转速r=5000 r/min，半径R=30 cm， • 离心力？g
Zg=8385g Z=1.118×10-5×(r)2×R
超离心法
分为：差速离心，区带离心。
差速离心(differential centrifugation)
主要是采取逐渐提高离心速度的方法分离
不同大小的细胞器。
区带离心（Zonal centrifugation）
表面活性剂：十二烷基磺酸钠（SDS)，Triton X100,十四烷基胺盐(CTAB);
螯合剂：乙二胺四乙酸（EDTA），与金属离子结合， 如阴性菌外层Mg2+、Ca2+处理的方法;
有机溶剂:如苯、甲苯、丁醇、丙酮、氯仿及尿素。 这些试剂容易引起生化物质破坏，还会带来分离和 回收化学物质的问题。
过滤助剂
过滤助剂可解决两个问题
➢滤饼的可压缩性问题 ➢小粒子如菌丝碎片和细菌细胞，会渗入到转
鼓真空过滤预覆盖层内部，堵塞部分孔。
常用的过滤助剂 硅藻土、珍珠岩、活性白土
助滤剂两种加入方法
助滤剂用量等于悬浮 液中固体含量
预先铺一层助滤剂 (1~2mm)
（2） 过滤设备
➢板框过滤机 ➢真空转鼓过滤机 ➢加压叶滤机 ➢带式过滤机 ➢袋式过滤机
非机械方法 ：辅助方法
– 2.2.3.2 化学和生物化学渗透 （1）酸碱处理；（2）化学试剂处理； （3）酶溶 – 2.2.3.3 物理渗透法 （1）渗透压冲击；（2）冻结-融化法
2.2.3.1 机械破碎
细胞匀浆液
（1）
阀座
高
压
匀 细胞悬浮液
浆
法
碰撞环 阀
图2.11 高压匀浆器结构简图
• 破碎原理：
• 离心转速r=5000 r/min，半径R=30 cm， • 离心力？g
Zg=8385g Z=1.118×10-5×(r)2×R
超离心法
分为：差速离心，区带离心。
差速离心(differential centrifugation)
主要是采取逐渐提高离心速度的方法分离
不同大小的细胞器。
区带离心（Zonal centrifugation）
第三章 细胞破碎、蛋白质复性及固液分离
14
15
第三章 细胞破碎、蛋白质复性及固液分离
——细胞破碎
三、常用的细胞破碎方法
2、珠磨法（bead mill）
16
第三章 细胞破碎、蛋白质复性及固液分离
——细胞破碎
三、常用的细胞破碎方法
2、珠磨法
进料速度与 微生物浓度、 破碎率、能耗 之间关系。 可见，进料 速率增加，能 降低单位重量 细胞的能耗， 但也会降低细 胞的破碎率。
超声波产生的化学自由基团能使某些敏感性活性物 质失活。
产生的噪声令人难以忍受
23
第三章 细胞破碎、蛋白质复性及固液分离
——细胞破碎
三、常用的细胞破碎方法
4、化学渗透法（chemical permeation）：
某些有机溶剂（如苯、甲苯）、抗生素、表面 活性剂（SDS、Triton X-100）、金属鏊合剂 （EDTA）、变性剂（盐酸胍、脲）等化学药品都 可以改变细胞壁或膜的通透性，从而使内含物有选 择地渗透出来。 化学渗透法取决于化学试剂的类型以及细胞壁 和膜的结构与组成，不同化学试剂对各种微生物作 用的部位和方式有所不同。
1、高压匀浆法（high press homogenization） （1）作用机理：在高压匀浆器中，高压室的压力高达几十个兆帕， 细胞悬浮液从阀座3和阀杆5之间的小环隙中喷出时，每秒速度可达 几百米。这种高速喷出的浆液又射到静止的撞击环上，被迫改变方 向从出口管流出。细胞在这一系列高速运动过程中经历了剪切、碰 撞及由高压到常压的变化，从而造成细胞破碎。
2
分离的对象：
生物反应的悬浮液： 动物细胞培养液、植物细胞培养液、微生物发酵液、 动物血液、乳液和动植物组织提取液等。 悬浮液的共同性质：
3
15
第三章 细胞破碎、蛋白质复性及固液分离
——细胞破碎
三、常用的细胞破碎方法
2、珠磨法（bead mill）
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第三章 细胞破碎、蛋白质复性及固液分离
——细胞破碎
三、常用的细胞破碎方法
2、珠磨法
进料速度与 微生物浓度、 破碎率、能耗 之间关系。 可见，进料 速率增加，能 降低单位重量 细胞的能耗， 但也会降低细 胞的破碎率。
超声波产生的化学自由基团能使某些敏感性活性物 质失活。
产生的噪声令人难以忍受
23
第三章 细胞破碎、蛋白质复性及固液分离
——细胞破碎
三、常用的细胞破碎方法
4、化学渗透法（chemical permeation）：
某些有机溶剂（如苯、甲苯）、抗生素、表面 活性剂（SDS、Triton X-100）、金属鏊合剂 （EDTA）、变性剂（盐酸胍、脲）等化学药品都 可以改变细胞壁或膜的通透性，从而使内含物有选 择地渗透出来。 化学渗透法取决于化学试剂的类型以及细胞壁 和膜的结构与组成，不同化学试剂对各种微生物作 用的部位和方式有所不同。
1、高压匀浆法（high press homogenization） （1）作用机理：在高压匀浆器中，高压室的压力高达几十个兆帕， 细胞悬浮液从阀座3和阀杆5之间的小环隙中喷出时，每秒速度可达 几百米。这种高速喷出的浆液又射到静止的撞击环上，被迫改变方 向从出口管流出。细胞在这一系列高速运动过程中经历了剪切、碰 撞及由高压到常压的变化，从而造成细胞破碎。
2
分离的对象：
生物反应的悬浮液： 动物细胞培养液、植物细胞培养液、微生物发酵液、 动物血液、乳液和动植物组织提取液等。 悬浮液的共同性质：
3
细胞破碎、蛋白质复性、固液分离
以及细胞碎片进一步变小，影响后面对碎片的分离。
被破碎的破碎率符合如下公式： ln[1/(1-R)]=KNPɑ 式中 R — 破碎率，为N次循环后，蛋白质的释放
量Rn与最大释放量Rm之比；
K － 与温度、粘度等有关的破碎速度常数；
P － 操作压力，MPa；
ɑ－ 与微生物种类有关的常数。
活损失可以忽略。对于温度敏感性物质低温操作是
必需的。高压匀浆一般需多级操作，每次循环前往 往进行级间冷却。尽管提高压力有利于细胞破碎， 但是提高压力需增加能耗（3.5kW/100MPa），同 时为移走产生的热量（23.8℃/100Mpa）需要付出
代价。机械破碎的能耗主要包括提供动力（如压力）
消耗的能量以及低温操作耗费的能量。
影响高压匀浆器细胞破碎因素
升高压力有利于破碎，
减少细胞的循环次数，甚至一次通过匀浆阀就可达
到几乎完全的破碎，这样就可避免细胞碎片不至过 小。 Brokman等人已研究了能适应于高压操作的匀 浆阀，试验表明在约175 MPa的压力下，破碎率可达 100％，
但压力大到一定值时对匀浆器的磨损增加，也有实
糖结构为多层网状结构，其中75%的肽聚糖亚单位
相互交联，网格致密坚固。
革兰氏阴性细菌的细胞壁
O-特异多糖 (O-polysaccharide)
核心多糖(corepolysaccharide)
蛋白质 类脂A
孔蛋白
(脂多糖)
(Lipid A)
革兰氏阴 性细菌的 外膜
脂蛋白
磷脂分子
壁膜间隙
革兰氏阴性细菌的细胞壁包括内壁层和外壁层，内 壁层较薄（2~3nm），由肽聚糖组成；外壁层较厚
微生物发酵产物下游分离纯化策略
微生物发酵产物下游分离纯化策略微生物发酵作为一种生物技术，在生产药物、食品添加剂、工业酶制剂、生物燃料等领域发挥着至关重要的作用。
然而，微生物发酵产生的目标产物往往与其他杂质混合在一起，因此，高效的下游分离纯化策略是确保产物质量、提高生产效率和降低成本的关键环节。
以下是针对微生物发酵产物下游分离纯化策略的六个核心点：1. 预处理：固液分离与细胞破碎预处理是下游分离纯化的第一步，主要涉及将发酵液中的细胞与液体介质分离，随后破碎细胞释放出胞内产物。
常用的固液分离技术包括离心分离和过滤分离，前者利用离心力快速分离细胞，后者则通过物理屏障拦截细胞。
细胞破碎方法多样，常见的有机械破碎（如高压匀浆、珠磨）、化学裂解（利用渗透压改变或溶剂破坏细胞壁）及酶促裂解。
选择合适的预处理方式对于后续纯化步骤至关重要，能有效提高产物回收率。
2. 初步纯化：吸附与沉淀初步纯化旨在去除大部分杂质，同时浓缩目标产物。
吸附法利用特定吸附材料（如离子交换树脂、活性炭、疏水相互作用色谱填料）捕获目标产物或杂质，通过改变pH值、盐浓度或洗脱剂来实现产物的解吸。
沉淀法则是通过添加特定试剂（如盐析、有机溶剂沉淀、等电点沉淀）促使目标产物或杂质形成沉淀，从而达到分离目的。
这些技术的选择依据目标产物的物理化学性质，以及杂质的种类和浓度。
3. 精制：层析技术层析技术是微生物发酵产物精制的核心，包括但不限于凝胶过滤层析、离子交换层析、亲和层析等。
凝胶过滤层析基于分子大小差异进行分离；离子交换层析利用电荷差异；而亲和层析则是基于生物分子之间的特异性相互作用，如抗体与抗原、酶与底物的结合。
层析技术具有高分辨率、选择性强的特点，能够有效提高产物纯度，但操作成本相对较高，需要精确的条件优化。
4. 浓缩与脱盐经过层析后的产物通常还需进一步浓缩和脱盐，以满足最终产品的规格要求。
浓缩可通过蒸发、反渗透、超滤等方法实现，这些技术能有效减少溶剂体积而不影响产物活性。
固液分离和细胞破碎讲述案例课件
固液分离和细胞破碎讲述案例课 件
目 录
• 固 技术应用与展望
01
固液分离技术介绍
离心分离
利用离心力对不同密度物质进行分离的方法。
离心分离是利用物质在离心力场中受到不同离心力而产生不同的运动轨迹，从而实现不同密度物质之间的分离。在离心分离 过程中，密度大的物质会向旋转轴心移动，而密度小的物质则会向外围移动。离心分离技术广泛应用于固液分离、细胞破碎 和蛋白质分离等领域。
案例名称
啤酒生产中的固液分离
技术应用
使用过滤和离心技术进行固液分离。过滤技术通 过滤网或滤布去除固体杂质，而离心技术则利用 离心力的作用将固体颗粒和液体进行分离。
描述
在啤酒生产过程中，固液分离技术用于将麦芽汁 中的固体颗粒与液体有效分离，从而获得清澈的 麦芽汁，为后续发酵和啤酒制作提供高质量原料 。
过滤分离
通过过滤介质将悬浮颗粒从液体中分离出来的方法。
过滤分离是利用过滤介质（如滤纸、滤布、砂芯等）将悬浮颗粒截留在过滤介质 表面或内部，从而实现液体与固体颗粒的分离。过滤分离技术广泛应用于化工、 制药、食品和环保等领域。
其他分离技术
其他非主流的固液分离技术。
除了离心分离和过滤分离之外，还有一些其他固液分离技术，如沉降分离、浮选分离和电泳分离等。 这些技术在实际应用中不如离心分离和过滤分离常用，但在特定情况下仍具有一定的应用价值。
技术应用与展望
固液分离技术应用与展望
固液分离技术应用
固液分离技术是生物工程和制药工业中 常用的技术，主要用于从液体混合物中 分离固体物质。该技术广泛应用于细胞 培养物、发酵液、食品加工废水等领域 。
VS
固液分离技术展望
随着生物技术的不断发展，固液分离技术 的需求也在不断增加。未来，固液分离技 术将朝着高效、低能耗、环保的方向发展 。新型的固液分离技术，如超滤、纳滤、 反渗透等，将逐渐取代传统的沉淀、离心 等分离方法，提高分离效率和分离效果。
目 录
• 固 技术应用与展望
01
固液分离技术介绍
离心分离
利用离心力对不同密度物质进行分离的方法。
离心分离是利用物质在离心力场中受到不同离心力而产生不同的运动轨迹，从而实现不同密度物质之间的分离。在离心分离 过程中，密度大的物质会向旋转轴心移动，而密度小的物质则会向外围移动。离心分离技术广泛应用于固液分离、细胞破碎 和蛋白质分离等领域。
案例名称
啤酒生产中的固液分离
技术应用
使用过滤和离心技术进行固液分离。过滤技术通 过滤网或滤布去除固体杂质，而离心技术则利用 离心力的作用将固体颗粒和液体进行分离。
描述
在啤酒生产过程中，固液分离技术用于将麦芽汁 中的固体颗粒与液体有效分离，从而获得清澈的 麦芽汁，为后续发酵和啤酒制作提供高质量原料 。
过滤分离
通过过滤介质将悬浮颗粒从液体中分离出来的方法。
过滤分离是利用过滤介质（如滤纸、滤布、砂芯等）将悬浮颗粒截留在过滤介质 表面或内部，从而实现液体与固体颗粒的分离。过滤分离技术广泛应用于化工、 制药、食品和环保等领域。
其他分离技术
其他非主流的固液分离技术。
除了离心分离和过滤分离之外，还有一些其他固液分离技术，如沉降分离、浮选分离和电泳分离等。 这些技术在实际应用中不如离心分离和过滤分离常用，但在特定情况下仍具有一定的应用价值。
技术应用与展望
固液分离技术应用与展望
固液分离技术应用
固液分离技术是生物工程和制药工业中 常用的技术，主要用于从液体混合物中 分离固体物质。该技术广泛应用于细胞 培养物、发酵液、食品加工废水等领域 。
VS
固液分离技术展望
随着生物技术的不断发展，固液分离技术 的需求也在不断增加。未来，固液分离技 术将朝着高效、低能耗、环保的方向发展 。新型的固液分离技术，如超滤、纳滤、 反渗透等，将逐渐取代传统的沉淀、离心 等分离方法，提高分离效率和分离效果。
第四章 细胞破碎和分离技术
（2）有机溶剂法
有机溶剂能溶解细胞壁的脂类，从而改变细 胞通透性。
（3）表面活性物质
能溶解膜结构中的脂蛋白，使细胞通透性增加。
化学法的优缺点 优点 细胞外形保持完整，碎片少，浆液粘度低，
易于固液分离和进一步提取。
①通用性差； 缺点 ②时间长，效率低，一般胞内物质释放率 不超过 80％。 ③有些化学试剂有毒，后续工作需设法分 离除去。
纳豆激酶
1980年，日本心脑血管专家须见洋行博士， 从事溶解血栓药物研究工作
“下午两点半”实验 下午两点半：纳豆提取物加入到人工 血栓中；
下午五点半：血栓溶解2厘米
纳豆的制作
1、泡豆蒸豆
大豆，加水浸泡一夜后，蒸烂。
2、接种纳豆菌
纳豆菌用热水溶解后，加入到大豆中，搅拌均匀，分装。
3、在恒温下发酵14-36小时 4、后熟（活菌低温休眠）
洋葱质壁分离
2、冷冻-融化法
（1）方法：将细胞放在低温下冷冻，然后在 室温中融化，反复多次而达到破壁作用。 （2）原理：一方面破坏细胞膜的通透性，另 一方面胞内水结晶，形成冰晶粒，细胞液浓度 增高引起细胞溶胀而破裂。
大肠杆菌：可用液氮/37℃反复冻融法破壁
适用于细胞壁较脆弱的菌体，需反复 多次，速率慢，产量低，在冻融过程 中可能引起某些蛋白质变性。
（二）膨胀床分离技术
1、膨胀床的定义
（1）固定床：又称填充床，填充的固体物通常呈 颗粒状，堆积成一定高度的床层。床层静止不动， 流体通过床层进行分离纯化。 （2）流化床：当流体通过床层的速度逐渐提高到 某值时，填料颗粒出现松动，颗粒间空隙增大，床 层体积出现膨胀，但是颗粒仍逗留在床层内而不被 流体带出。床层的这种状态和液体相似称为流化床
（5）柱床的再生和清洗
第三章生物材料的预处理、细胞破碎和液固分离
— 错流过滤： 料液与过滤介质表面平行的大流量冲刷
过滤收率高 滤液质量好 减少处理步骤
2.过滤设备 板框过滤机
真空鼓式过滤机
3.过滤介质和助滤剂
（1）过滤介质 滤布或膜 耐酸碱、高温、化学试剂、抗拉性能好、有一 定的机械强度和孔隙度等
（2）助滤剂 要求为惰性物质、无毒、有一定细度及硬度， 成本低廉。 加入方法： —预铺法：预铺在过滤机上 — 混合法：与发酵液一起加入 — 生成法：反应中生成沉淀 新生霉素发酵液： 常用有：硅藻土、纸浆、石棉、纤维素等
三、动物材料的预处理
绞肉机绞碎 匀浆和组织捣碎
四、细胞培养液的预处理
为什么需要预处理？ 可溶性粘胶状物质：杂蛋白、不溶性多 糖等
粘度增加、影响提取操作
无机盐
在采用离子交换提取时，会影响树脂对生化物质的 交换容量。
1.细胞及蛋白质的处理 （1）加入凝聚剂
凝聚作用： 指在某些电解质作用下，使胶体粒子的扩散双 电层的排斥电位降低，破坏了胶体系统的分散 状态，而使胶体粒子聚集的过程。
G
+
-
溶菌酶
溶菌酶、EDTA
常 用 的 溶 酶
G
放线菌
酵母菌
溶菌酶
β-葡聚糖酶
霉菌
植物
几丁质酶、
纤维素酶、半纤维素酶
细胞壁溶解酶是几种酶的复合物
酶解法的优点
发生酶解的条件温和 能选择性地释放产物 胞内核酸等泄出量少，细胞外形较完整，便于 后步分离等 但酶水解价格高，故小规模应用较广
超声波法
高速匀浆法 珠磨破碎法
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细胞破碎与固液分离技术
（2）急热骤冷法 将材料投入沸水中，维持85-90分钟，至水浴
中急速冷却，此法可用于细菌及病毒材料。 （3）渗透破碎法
利用细胞内外渗透压差使水分进入细胞而破碎。
细胞破碎与固液分离技术
3、化学及生物化学法 自溶法和酶溶法利用自身或制备酶对细胞进行破碎，
需要进行适当处理。 酶溶法适用性广、温和且可控。 化学法利用有机试剂改变细胞壁或膜的通透性，也
多孔固体介质：具有很多微细孔道的固体材料，如 多孔陶瓷、多孔金属及多孔性塑料制成的管或板， 能截留1-3 m的微小颗粒。
堆积介质：由沙、木炭之类的固体颗粒堆积而成的 床层，称作滤床，用作过滤介质使含少量悬浮物的 液体澄清。
多孔膜：用于膜过滤的各种有机分子膜和无机材料 膜。
细胞破碎与固液分离技术
用超声波的空穴作 用使细胞破碎
适中
械
须使细胞通过的小
法 匀浆法（孔型）孔，使细胞受到剪 剧烈
切力而破碎
珠磨破碎法
细胞被玻璃珠或铁 珠捣碎
剧烈
成本 举例
适中
动物组织及 动物细胞
便宜
昂贵
细胞悬浮液 小规模处理
适中
细胞悬浮液 大规模处理
便宜
细胞悬浮液 和植物细胞 的大规模处 理
细胞破碎与固液分离技术
破碎技术
法和机械法结合的方法
细胞破碎与固液分离技术
破碎过程中应注意的问题
A、多种破碎方法相结合可产生很大优势 B、对下游分离技术的影响：破碎颗粒清除，产物
分离纯化 C、在上游发酵阶段，考虑到发酵过程和环境对破
碎难易程度影响 D、菌种的培育及改造，胞内产物 胞外产物
细胞破碎与固液分离技术
细胞结构与破碎
1、直接测定法 设备：显微镜、电子微粒计数器 破碎前细胞数 破碎后细胞数：用染色法排除释放物对计数的干扰。 如：碎的G+可染色呈G-的颜色。G染色法受损酵母
亮红色，未损酵母呈紫色。
细胞破碎与固液分离技术
目的产物测定法
测定释放的蛋白质量或酶的活力。通常将破碎后的 细胞悬浮液离心，测定上清液中蛋白质的含量或酶 的活力，并与所获得的标准数值直接比较。
过滤推动力
过滤推动力是指滤饼和过滤介质两侧的压力差。
此压力差可以是重力或人为压差。增加过滤推动力 的方法有： 1、增加悬浮液本身的液柱压力，一般不超过 50KN/m2，称为重力过滤。 2、增加悬浮液液面的压力，一般可达500KN/m2称为 加压过滤。 3、在过滤介质下面抽真空，通常不超过真空度 86.6KN/m2，称为真空过滤。
2、物理法 （1）反复冻溶法 原理：因突然冷冻，细胞内冰晶的形成及胞内外溶
剂浓度的突然改变而破坏细胞。 方法：将待破碎的细胞在-20度以下冰冻，室温融
解，反复几次，由于细胞内冰粒形成和剩余细胞液 的盐浓度增高引起溶胀，使细胞结构破碎。 特点：此法适用于组织细胞，多用于动物性材料， 对微生物细胞作用较差。
较温和，但效率低，易造成污染。
细胞破碎与固液分离技术
比较
这些方法中，化学及生物化学法较温和，细胞 破坏后产物多数不会发生不可逆的变性，规模也容易 放大，生产中最常用。机械法剪切力破坏较大，产生 热量，而且不容易规模放大，但设备较成熟，也常用； 物理法处理量少，只用于实验室。
细胞破碎与固液分离技术
破碎率的测定
化学及生物化学法
自溶法 酶溶法 化学渗透法
细胞破碎与固液分离技术
破碎技术
1、机械法 主要通过机械切力的作用使组织细胞破碎的方法，
常用的器械有组织捣碎机、匀浆器、研钵和研磨、 压榨器等。
细胞破碎与固液分离技术
方 法
技术
原理
效果
匀浆法（片型）细胞被搅拌器劈碎 适中
研磨法 细胞被研磨物磨碎 适中
机
超声波法
细胞破碎与固液分离技术
对于胞内产物，则需首先收集菌体，进行细胞破碎， 使代谢产物转入液相中，然后，再进行细胞碎片的 分离。
大多数情况下，抗生素、胞外酶、一些多糖及氨基 酸等目标产物存在于在发酵液中。
使胞内产物释放出来一般需要破碎细胞壁。细胞破 碎的方法在生物化学领域中得到了很广泛的运用， 但多数在小规模生产中，在大规模生产尤其是基因 工程中应用极少。
细胞破碎与固液分离技术
测定导电率
原理：细胞破碎后，大量带电荷的内含物释放到水 相，电导率上升，而与破碎率的增加呈线性关系。
先制定标准曲线：微生物的种类、处理的条件、细 胞浓度、温度和悬浮液中电解质的含量
在同等条件下测其电导率，计算破碎率。
细胞破碎与固液分离技术
固液分离
固液分离将两种不同状 态的物质进行区分，以 便于后续工作，是重要 的基础环节。
第二章 细胞破碎与固液分离技术
获取目的物质的先期步骤
细胞破碎与固液分离技术
概述
生物分离的第一步是将生物机体从发酵液中分离， 通常使用过滤和离心等方法。
发酵细胞的代谢产物有的分泌到细胞或组织之外， 还有许多是存在于细胞内部。
对于胞外产物只需直接将发酵液预处理及过滤，获 得澄清的滤液，作为进一步纯化的出发原液。
细胞破碎与固液分离技术
生物分离工作的一般过程
动、植物组织、体液等
胞外产物
提取
发酵液 → 预处理 →c分离 →c破碎 →碎片分离 → 初步纯化 →
培养液 加 热 沉 淀 匀 化
离心
沉淀
酶反应 调 pH 离 心 超 声 萃 取
吸附
絮凝 过滤 胞溶 过滤
萃取
错流过滤 研 磨 错流过滤 超 滤
精制 → 制成品 分子筛 无菌过滤 离 子 超滤 亲 和 冻干 吸 附 喷干
憎 水 结晶 电泳
细胞破碎与固液分离技术
过滤
利用一种能将固体微粒截留而让流体通过的多孔介 质，将固体微粒从气体中或液体中分离出来。
细胞破碎与固液分离技术
过滤介质
织物介质：最常用的过滤介质，工业上称为滤布 (网)，由天然纤维、玻璃纤维、合成纤维或者金属 丝编织而成。可截留的最小颗粒的直径为5-65微米。
为了破碎细胞，必须克服的主要阻力是网状结构的 共价键。
在用酶法或化学法来溶解细胞壁时，细胞壁的结 构和组成显得特别重要，可用来作为选择溶菌酶和 化学方法的依据。
细胞破碎与固液分离技术
细胞破碎技术
机械法
固体剪切作用 液体剪切作用
组织捣碎机、研钵、细菌磨 高压匀浆、超声破碎、撞击法
目的
破碎目的是使产物最大限度的释放出来 同时，细胞破碎需要考虑对后期分离的影响。 材料和产物的特性、提纯要求是选择破碎方法的依
据。
细胞破碎与固液分离技术
破碎方法的选择
选择的一般原则 A、提取产物在细胞质内，用机械法破碎 B、提取产物在细胞膜附近，用化学法 C、提取产物与细胞膜或细胞壁结合，可采用化学
（2）急热骤冷法 将材料投入沸水中，维持85-90分钟，至水浴
中急速冷却，此法可用于细菌及病毒材料。 （3）渗透破碎法
利用细胞内外渗透压差使水分进入细胞而破碎。
细胞破碎与固液分离技术
3、化学及生物化学法 自溶法和酶溶法利用自身或制备酶对细胞进行破碎，
需要进行适当处理。 酶溶法适用性广、温和且可控。 化学法利用有机试剂改变细胞壁或膜的通透性，也
多孔固体介质：具有很多微细孔道的固体材料，如 多孔陶瓷、多孔金属及多孔性塑料制成的管或板， 能截留1-3 m的微小颗粒。
堆积介质：由沙、木炭之类的固体颗粒堆积而成的 床层，称作滤床，用作过滤介质使含少量悬浮物的 液体澄清。
多孔膜：用于膜过滤的各种有机分子膜和无机材料 膜。
细胞破碎与固液分离技术
用超声波的空穴作 用使细胞破碎
适中
械
须使细胞通过的小
法 匀浆法（孔型）孔，使细胞受到剪 剧烈
切力而破碎
珠磨破碎法
细胞被玻璃珠或铁 珠捣碎
剧烈
成本 举例
适中
动物组织及 动物细胞
便宜
昂贵
细胞悬浮液 小规模处理
适中
细胞悬浮液 大规模处理
便宜
细胞悬浮液 和植物细胞 的大规模处 理
细胞破碎与固液分离技术
破碎技术
法和机械法结合的方法
细胞破碎与固液分离技术
破碎过程中应注意的问题
A、多种破碎方法相结合可产生很大优势 B、对下游分离技术的影响：破碎颗粒清除，产物
分离纯化 C、在上游发酵阶段，考虑到发酵过程和环境对破
碎难易程度影响 D、菌种的培育及改造，胞内产物 胞外产物
细胞破碎与固液分离技术
细胞结构与破碎
1、直接测定法 设备：显微镜、电子微粒计数器 破碎前细胞数 破碎后细胞数：用染色法排除释放物对计数的干扰。 如：碎的G+可染色呈G-的颜色。G染色法受损酵母
亮红色，未损酵母呈紫色。
细胞破碎与固液分离技术
目的产物测定法
测定释放的蛋白质量或酶的活力。通常将破碎后的 细胞悬浮液离心，测定上清液中蛋白质的含量或酶 的活力，并与所获得的标准数值直接比较。
过滤推动力
过滤推动力是指滤饼和过滤介质两侧的压力差。
此压力差可以是重力或人为压差。增加过滤推动力 的方法有： 1、增加悬浮液本身的液柱压力，一般不超过 50KN/m2，称为重力过滤。 2、增加悬浮液液面的压力，一般可达500KN/m2称为 加压过滤。 3、在过滤介质下面抽真空，通常不超过真空度 86.6KN/m2，称为真空过滤。
2、物理法 （1）反复冻溶法 原理：因突然冷冻，细胞内冰晶的形成及胞内外溶
剂浓度的突然改变而破坏细胞。 方法：将待破碎的细胞在-20度以下冰冻，室温融
解，反复几次，由于细胞内冰粒形成和剩余细胞液 的盐浓度增高引起溶胀，使细胞结构破碎。 特点：此法适用于组织细胞，多用于动物性材料， 对微生物细胞作用较差。
较温和，但效率低，易造成污染。
细胞破碎与固液分离技术
比较
这些方法中，化学及生物化学法较温和，细胞 破坏后产物多数不会发生不可逆的变性，规模也容易 放大，生产中最常用。机械法剪切力破坏较大，产生 热量，而且不容易规模放大，但设备较成熟，也常用； 物理法处理量少，只用于实验室。
细胞破碎与固液分离技术
破碎率的测定
化学及生物化学法
自溶法 酶溶法 化学渗透法
细胞破碎与固液分离技术
破碎技术
1、机械法 主要通过机械切力的作用使组织细胞破碎的方法，
常用的器械有组织捣碎机、匀浆器、研钵和研磨、 压榨器等。
细胞破碎与固液分离技术
方 法
技术
原理
效果
匀浆法（片型）细胞被搅拌器劈碎 适中
研磨法 细胞被研磨物磨碎 适中
机
超声波法
细胞破碎与固液分离技术
对于胞内产物，则需首先收集菌体，进行细胞破碎， 使代谢产物转入液相中，然后，再进行细胞碎片的 分离。
大多数情况下，抗生素、胞外酶、一些多糖及氨基 酸等目标产物存在于在发酵液中。
使胞内产物释放出来一般需要破碎细胞壁。细胞破 碎的方法在生物化学领域中得到了很广泛的运用， 但多数在小规模生产中，在大规模生产尤其是基因 工程中应用极少。
细胞破碎与固液分离技术
测定导电率
原理：细胞破碎后，大量带电荷的内含物释放到水 相，电导率上升，而与破碎率的增加呈线性关系。
先制定标准曲线：微生物的种类、处理的条件、细 胞浓度、温度和悬浮液中电解质的含量
在同等条件下测其电导率，计算破碎率。
细胞破碎与固液分离技术
固液分离
固液分离将两种不同状 态的物质进行区分，以 便于后续工作，是重要 的基础环节。
第二章 细胞破碎与固液分离技术
获取目的物质的先期步骤
细胞破碎与固液分离技术
概述
生物分离的第一步是将生物机体从发酵液中分离， 通常使用过滤和离心等方法。
发酵细胞的代谢产物有的分泌到细胞或组织之外， 还有许多是存在于细胞内部。
对于胞外产物只需直接将发酵液预处理及过滤，获 得澄清的滤液，作为进一步纯化的出发原液。
细胞破碎与固液分离技术
生物分离工作的一般过程
动、植物组织、体液等
胞外产物
提取
发酵液 → 预处理 →c分离 →c破碎 →碎片分离 → 初步纯化 →
培养液 加 热 沉 淀 匀 化
离心
沉淀
酶反应 调 pH 离 心 超 声 萃 取
吸附
絮凝 过滤 胞溶 过滤
萃取
错流过滤 研 磨 错流过滤 超 滤
精制 → 制成品 分子筛 无菌过滤 离 子 超滤 亲 和 冻干 吸 附 喷干
憎 水 结晶 电泳
细胞破碎与固液分离技术
过滤
利用一种能将固体微粒截留而让流体通过的多孔介 质，将固体微粒从气体中或液体中分离出来。
细胞破碎与固液分离技术
过滤介质
织物介质：最常用的过滤介质，工业上称为滤布 (网)，由天然纤维、玻璃纤维、合成纤维或者金属 丝编织而成。可截留的最小颗粒的直径为5-65微米。
为了破碎细胞，必须克服的主要阻力是网状结构的 共价键。
在用酶法或化学法来溶解细胞壁时，细胞壁的结 构和组成显得特别重要，可用来作为选择溶菌酶和 化学方法的依据。
细胞破碎与固液分离技术
细胞破碎技术
机械法
固体剪切作用 液体剪切作用
组织捣碎机、研钵、细菌磨 高压匀浆、超声破碎、撞击法
目的
破碎目的是使产物最大限度的释放出来 同时，细胞破碎需要考虑对后期分离的影响。 材料和产物的特性、提纯要求是选择破碎方法的依
据。
细胞破碎与固液分离技术
破碎方法的选择
选择的一般原则 A、提取产物在细胞质内，用机械法破碎 B、提取产物在细胞膜附近，用化学法 C、提取产物与细胞膜或细胞壁结合，可采用化学