实验四 细菌、真菌、放线菌的分离与培养
实验4放线菌、酵母菌、霉菌形态观察.
实验4放线菌、酵母菌、霉菌形态观察.实验四放线菌、酵母菌、霉菌形态观察（一）放线菌的形态观察1 目的观察放线菌的基本形态特征掌握培养放线菌的几种方法2 原理放线菌一般由分枝状菌丝组成，它的菌丝可分为基内菌丝(营养菌丝)、气生菌丝或有孢子丝三种。
放线菌生长到一定阶段，大部分气生菌丝分化成孢子丝，通过横割分列的方式产生成串的分生孢子。
孢子丝形态多样，有直、波曲、钩状、螺旋状、轮生等多种形态。
孢子也有球形、椭圆形、杆状和瓜子状等等。
它们的形态构造都是放线菌分类鉴定的重要依据。
放线菌的菌落早期绒状同细菌菌落月牙状相似，后期形成孢子菌落呈粉状、干燥，有各种颜色呈同心圆放射状。
3 材料3.1 菌种灰色链霉菌(Str. griseus),天蓝色链霉菌(Str. coelicolor),细黄链霉菌（Str.microflavus）。
3.2 培养基高氏1号培养基。
3.3 器皿培养皿，载玻片、盖玻片、无菌滴管、镊子、接种环、小刀(或刀片)、水浴锅，显微镜，超净工作台，恒温培养箱。
4 流程4.1插片法: 倒平板→插片→接种→培养→镜检→记录绘图4.2压印法: 倒平板→划线接种→挑取菌落→加盖玻片→镜检→记录绘图4.3埋片法: 倒琼脂→切槽→接种→培养→镜检→记录绘图5 步骤5.1插片法5.1.1倒平板将高氏1号培养基熔化后，倒10~12毫升左右于灭菌培养皿内，凝固后使用.5.1.2插片将灭菌的盖玻片以45度角插入培养皿内的培养基中，插入深约为1/2或1/3(图5-1)。
5.1.3接种与培养用接种环将菌种接种在盖玻片与琼脂相接的沿线，放置28℃培养3～7天。
5.1.4观察培养后菌丝体生长在培养基及盖玻片上，小心用镊子将盖玻片抽出，轻轻擦去生长较差的一面的菌丝体，将生长良好的菌丝体面向的载玻片，压放于载玻片上。
直接在显微镜下观察。
5.2压印法5.2.1制备放线菌平板同5.1.1。
在凝固的高氏1号培养基平板上用划线分离法得到单一的放线菌菌落。
细菌的分离培养及培养性状的观察
实验四 细菌的分离培养及培养性状的观察在细菌学检验中，细菌的分离培养是重要的基本技术之一。
从混杂微生物中获得单一菌株纯培养的方法称为分离；纯培养是指一株菌种或一个培养物中所有的细菌都是由一个细胞分裂、繁殖而产生的后代。
分离培养的目的在于从被检材料中，或者从污染的众多杂菌中分离出纯的病原菌。
细菌分离培养应先从被检材料或病料中分离培养单个菌落，然后钓取可疑菌落进行纯培养，再将纯培养物移植培养。
目的要求1．学习、掌握需氧菌和厌氧菌分离培养的基本要领和技术。
2．了解细菌的菌落形态及其在各种培养基上的培养性状。
3．了解培养性状对细菌鉴别的重要意义。
4．掌握钓菌、纯培养及移植技术。
操作步骤一．需氧性细菌分离培养法1. 平板划线分离法菌种被其他杂菌污染时或混合菌悬液常用平板划线法进行纯种分离，此法是借助将蘸有混合菌悬液的接种环在平板表面多方向连续划线，使混杂的微生物细胞在平板表面分散，经培养得到分散的由单个微生物细胞繁殖而成的菌落，从而达到纯化目的。
但划线分离的培养基必须事先倾倒好，需充分冷凝待平板稍干后才可使用；为便于划线，一般培养基不宜太薄，每皿约倾倒20 ml 培养基，培养基应厚薄均匀，平板表面光滑。
划线分离主要有连续划线法（图4-1）和分区划线法（图4-2）两种。
划线法示意图见图4-3。
（1）连续划线法以无菌操作用接种环直接取平板上待分离纯化的菌落。
将菌种点种在平板边缘一处，取出接种环，烧去多余菌体。
将接种环再次通过稍打开皿盖的缝隙伸入平板，在平板边缘空白处接触一下使接种环冷却，然后从接种细菌的部位在平板上自左向右轻轻划线，划线时平板面与接种环面成30～40度角，以手腕力量在平板表面轻巧滑动划线，接种环不要嵌入培养基内划破培养基，线条要平行密集，充分利用平板表面积，注意勿使前后两条线重叠。
划线完毕，关上皿盖。
灼烧接种环，待冷却后放置接种架上。
培 养皿倒置于适宜的恒温箱内培养。
培养后在划线平板上观察沿划线处长出的菌落形态，涂片镜检为纯种后再接种斜面。
土壤分离培养实验报告
一、实验目的1. 掌握土壤微生物分离培养的基本原理和操作技术。
2. 熟悉不同微生物在不同培养基上的生长特征。
3. 学会观察和分析微生物的菌落形态特征。
二、实验原理土壤中含有丰富的微生物资源，包括细菌、放线菌、真菌等。
通过分离培养，可以从土壤中筛选出具有特定生理功能的微生物。
本实验采用平板分离法，利用不同微生物对不同培养基的嗜好性，从土壤中分离纯化微生物。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：土壤样品、细菌培养基、放线菌培养基、真菌培养基、无菌水、无菌平板、无菌接种环、酒精灯、培养箱等。
2. 实验仪器：天平、药匙、烧杯、量筒、玻璃棒、试管、无菌涂棒、接种环、培养皿、酒精灯、培养箱等。
四、实验步骤1. 样品处理：称取土壤样品10g，加入90mL无菌水，充分振荡混匀，制成土壤悬液。
2. 土壤悬液稀释：取土壤悬液适量，按照10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5的梯度进行稀释。
3. 接种：取稀释后的土壤悬液，用无菌涂棒涂布于细菌培养基、放线菌培养基、真菌培养基平板上。
4. 培养与观察：将接种后的平板倒置，放入培养箱中培养，观察不同微生物在不同培养基上的生长情况。
5. 挑取单菌落：在平板上挑选典型的单菌落，分别接种于新的平板上，重复培养，直至获得纯培养。
6. 菌落观察：观察不同微生物的菌落形态特征，如菌落大小、颜色、质地、边缘等。
五、实验结果与分析1. 细菌培养：在细菌培养基平板上，观察到白色、黄色、绿色等不同颜色的菌落，菌落大小不一，质地较松散。
2. 放线菌培养：在放线菌培养基平板上，观察到白色、粉红色、紫色等不同颜色的菌落，菌落呈放射状、链状生长，质地较坚硬。
3. 真菌培养：在真菌培养基平板上，观察到白色、粉红色、黑色等不同颜色的菌落，菌落呈绒毛状、絮状生长，质地较疏松。
六、实验总结通过本次实验，我们掌握了土壤微生物分离培养的基本原理和操作技术，学会了观察和分析微生物的菌落形态特征。
在实验过程中，我们成功分离出细菌、放线菌、真菌等微生物，并对其进行了纯培养。
细菌 、放线菌 、酵母菌及霉菌的分离与纯化
土壤中细菌、放线菌、酵母菌及霉菌的分离与纯化一、实验目的1. 学习、掌握从土壤稀释分离、划线分离各类微生物的技术。
2. 学习从样品中分离、纯化出所需菌株。
3. 学习并掌握平板倾注法和斜面接种技术，了解培养细菌、放线菌、酵母菌及霉菌四大类微生物的培养条件和培养时间。
4. 学习平板菌落计数法。
二、实验原理将待分离的样品进行一定的稀释，使微生物的细胞（或孢子）尽量呈分散状态，选用有针对性的培养基，在不同温度、通风等条件下培养，让其长成一个纯种单个菌落。
要想获得某种微生物的纯培养，还需提供有利于该微生物生长繁殖的最适培养基及培养条件。
微生物四大类菌的分离培养基、培养温度、培养时间见表2-1所示。
表2-1 微生物四大类菌的分离和培养要求样品来源分离对象分离方法稀释度培养基名称培养温度/℃培养时间/d土样细菌稀释分离10-5，10-6，10-7牛肉膏蛋白胨30～37 1～2土样放线菌稀释分离10-3，10-4，10-5高氏1号28 5～7土样霉菌稀释分离10-2，10-3，10-4马丁氏琼脂28～30 3～5面肥或土样酵母菌稀释分离10-4，10-5，10-6马铃薯葡萄糖28～30 2～3细菌分离平板细菌单菌落划线分离10-2 牛肉膏蛋白胨30～37 1～2三、实验材料1. 菌源土样2. 培养基牛肉膏蛋白胨培养基，马丁氏培养基，高氏合成1号培养基，马铃薯葡萄糖培养基(制平板和斜面)，见附录Ⅲ。
3. 无菌水 250 mL锥形瓶，每瓶装99 mL无菌水(或95mL为分离霉菌用)，内装10粒玻璃珠。
4.5 mL无菌水试管(每人5～7支)。
4. 其他物品无菌培养皿，无菌移液管，无菌玻璃涂棒(刮刀)，称量纸，药勺，橡皮头，10%酚溶液。
（一）系列稀释平板法1. 取土样选定取样点，按对角交叉（五点法）取样。
先除去表层约2cm的土壤，将铲子插入土中数次，然后取2～10cm处的土壤。
盛土的容器应是无菌的。
将5点样品约1kg充分混匀，除去碎石、植物残根等杂物，装入已灭过菌的牛皮纸袋内，封好袋口，并记录取样地点、环境及日期。
实验四微生物的纯培养
微生物纯培养的原理
01
无菌操作
在微生物纯培养过程中，无菌操作是关键。通过在无菌条件下进行样品
的采集、分离、纯化、培养等步骤，确保获得的微生物菌落是单一的、
纯净的。
02
选择性培养基
选择性培养基是根据不同微生物的特殊营养需求和生长特点设计的培养
基，通过选择性培养基能够促进所需微生物的生长，抑制其他微生物的
的微生物群体中分离出来。
纯化
通过反复的分离、移植和纯培养过 程，逐步淘汰其他杂菌，最终获得 纯种的微生物。
鉴定
对纯化的微生物进行形态学、生理 生化及遗传学等方面的鉴定，以确 认其种属和特性。
04
实验结果与分析
微生物的培养结果观察与记录
观察与记录
在实验过程中，我们观察并记录 了微生物在不同培养基上的生长 情况，包括菌落形态、颜色、大 小、生长速度等特征。
微生物纯化
通过反复划线分离或稀释分离 的方法，将微生物逐渐纯化， 获得单一的菌落。
样品采集
根据研究目的选择合适的样品， 采集具有代表性的样品。
微生物分离
通过划线分离法、稀释分离法 等方法将微生物从样品中分离 出来。
微生物培养
将纯化的微生物接种到适宜的 培养基中进行培养，观察其生 长情况并进行记录。
03
改进建议2
寻找成本较低的替代品或国产试剂， 降低实验成本。同时，合理规划实验 材料的使用，避免浪费。
实验在未来的应用前景与发展方向
应用前景
随着微生物资源的深入研究和开发，微生物的纯培养 技术在农业、工业和医疗等领域具有广阔的应用前景 。例如，某些特殊微生物可用于生物农药和生物肥料 的开发，提高农作物产量和品质；某些具有特殊功能 的微生物可用于工业发酵生产；某些药用微生物可用 于抗生素和生物药物的生产。
实验四 细菌、真菌、放线菌的分离与培养
实验报告课程名称：环境微生物学实验实验类型：综合实验实验项目名称：微生物的分离与培养与菌落观察学生姓名：专业：环境工程学号：同组学生姓名：指导老师：实验地点：实验日期：2018 年 10月16日一、实验目的和要求1.掌握微生物接种培养技术2.掌握微生物分离纯化技术3.学习并掌握放菌落形态结构的观察方法，认识并理解它们的形态特征。
二、实验内容和原理土壤是微生物生活的大本营，是寻找和发现具有重要价值微生物的主要菌源。
在不同土壤中，各类微生物的数量千差万别。
为了分离获得某种微生物,需要预先制备不同稀释度的菌悬液，并添加相应的抗生素抑制不需要的微生物，例如，添加链霉素25~50U/mL抑制细菌;添加0.5%重铬酸钾液或制霉素50 U/mL 抑制霉菌。
通过10倍稀释以及平板分离、平板涂布和平板划线等操作，微生物可在平板上分散成单个的个体，经过适宜条件培养，单个个体可形成单个菌落。
挑取单个菌落转接至新鲜平板上，即可使目的菌种纯化。
1.菌种的分离纯化：从混杂微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物分离与纯化。
在分子生物学的研究及应用中，不仅需要通过分离纯化技术从混杂的天然微生物群中分离出特定的微生物，而且还必须随时注意保持微生物纯培养物的“单一性”，防止其他微生物的混入。
2.平板涂布法：因为将微生物悬液先加到较烫的培养基中再倒平板易造成某些热敏感菌的死亡，且采用稀释倒平板法也会使一些严格好氧菌因被固定在琼脂中间缺乏氧气而影响其生长，因此在微生物学研究中常用的纯种分离方法是涂布平板法。
用途上，一般多用于从菌种的纯化;优点是可以观察菌落特征，对混合菌进行分离;但不能计数3.平板划线法：最简单的分离微生物的方法是平板划线法，其原理是将微生物样品在固体培养基表面多次作“由点到线”稀释而达到分离目的的。
划线的方法很多，常见的比较容易出现单个菌落的划线方法有斜线法、曲线法、方格法、放射法、四格法等。
用途一般多用于筛选菌株。
放线菌的选择分离培养
3,培养
平板倒置于 28℃培养箱中培养7天,观察菌落的生长情况,菌落特征.
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1 ,取样
三 ,操作步骤
2, 制备土壤稀释液
3, 倾注平板
4,培养
四,实验操作内容
每组所需材料:
土样,装有无菌水和少量玻璃珠的三角瓶1瓶,9ml无菌水两支, 1或2ml移 液管2支,2副培养皿,60ml高氏1号培养基1瓶.
实验步骤
1,制备土壤稀释液 取土样0.5g,土样热处理后,加入装有无菌水和少量玻璃珠的三角瓶中, 室温下手摇振荡10分钟,静止5分钟,用移液管取上清液1ml(10-2)加入到9ml 无菌水稀释到10-3,同样操作稀释到10-4.注意回收玻璃珠. 用移液管分别吸取10-2原液和10-4稀释液各0.5ml于标志稀释倍数的平板上 ( 10-2原液1个平行, 10-4稀释液1个平行).
二,平板分离法
A 平板划线分离法 B 倾注平板法 C 稀释涂布平板法
1)放线菌分离常用基础培养基 2)选择性培养基
选择培养基的设计
如:高氏一号琼脂;精氨酸-甘油琼脂;葡萄糖-天冬酰胺琼脂.
a,为抑制细菌及霉菌的生长,可加入链霉素(抑制细菌)和制霉素等. b,加入重铬酸钾可同时抑制细菌和霉菌的生长;对放线菌生长无抑制作用 .
文化素质教育课程
"生命科学导论"实验
放线菌的选择分离培养
一,放线菌的选择分离培养
1 ,目的要求
从土壤中分离纯化放线菌,初步掌握微生物的土壤中放线菌最丰富,品种齐全.从堆肥或过热的材料中如干草或蔗渣 中可分离到大量的嗜热放线菌,从淡水和海洋环境中分离到嗜碱性的和 嗜酸性的菌种. 土壤中含有丰富的放线菌,主要是链霉菌.而链霉菌以外的其他放线 菌,如小单孢菌,游动放线菌,诺卡氏菌等,它们是生物活性物质重要 的产生菌.但往往由于样品中稀有放线菌的数量太少,常规的分离方法 很难得到. 对样品进行风干,干热处理,培养基添加重铬酸钾的方法减少细菌和真 菌的数量;用干热和苯酚处理减少链霉菌数量的方法,可以分离得到更 多种类的放线菌.
实验四 土壤微生物的分离和计数
牛肉膏蛋白胨培养基； 高氏1号培养基； 马铃薯葡萄糖培养基（添加有抗生素）；
灭菌水、移液器、吸头、接种针、涂布器、灭 菌离心管、消毒酒精、试管架、记号笔、吸水 纸、酒精灯、平皿、漩涡振荡器、天平等。
实验内容
土壤微生物的分离和纯化 系列稀释法 划线法（讲解） 分离微生物的形态观察 （3天后） 细菌 放线菌 真菌
记录系列稀释法分离土壤微生物的结果：
真菌菌落的种类和数量，菌落特征描述； 细菌菌落的种类和数量，菌落特征描述； 放线菌菌落的种类和数量，菌落特征描述；
通过试验和查阅资料，独立完成思考题。 实验中出现问题的分析和讨论。
3天后观察记录分离试验结果，上交实验报告。
思考题：
在分离真菌时，有哪些方法可以避免或减少 细菌的污染？
称取土壤样品0.5~1.0 g加入含30ml灭菌水的塑料离心管 中振荡3～5分钟（旋涡振荡器），形成土壤悬浊液； 取0.1ml加入装有0.9ml灭菌水试管中，振荡均匀。依次稀 释，共5次。 细菌的分离：取第3，4，5 ，6四个稀释水平的样品分别 取0.1ml，均匀涂布在牛肉膏蛋白胨培养平板上； 放线菌的分离：取第1，2，3 ，4四个稀释水平的样品分 别取0.1ml，均匀涂布在高氏1号培养基； 真菌的分离：取第2，3，4 ，5四个稀释水平的样品分别 取0.1ml，均匀涂布在含抗生素的PDA平板上； 菌液被培养基吸收后，反转放置，做好标记，28℃培养。
细菌菌落的共同特征
湿润 粘稠 质地均匀 较透明 易挑取（与培养基结合不紧密） 菌落正、反面、边缘、中心颜色一致
注意事项：
实验四细菌的划线分离与培养
实验四细菌的划线分离与培养一、实验前要说明的几点问题点名,查看学生出勤情况;总结上次作业,提出作业中出现的问题并讲解; 二、板书部分一目的要求1.掌握需氧菌分离培养的基本要领;2.了解厌氧菌的分离培养原则及方法;二实验内容1.用普通琼脂平板做一次划线分离培养;2.用普通肉汤做一管大肠杆菌的移植培养;3.用普通琼脂斜面做一管金黄葡萄球菌的移植培养;4.用划线法进行真菌的分离培养示教三作业1.为什么要进行细菌的分离培养2.进行分离培养应注意哪些事项3.细菌分离培养的方法有哪些重点叙述平板划线法4.叙述真菌的划线分离方法;三、实验内容主要内容有分离培养及目的、注意事项、分离培养的方法、真菌的培养方法、患病动物病料中分离培养、钓菌、移植;1.什么是分离培养及目的：分离培养是细菌学检验的基本技术之一;分离培养之目的,在于从被检材料中由多种细菌里分离出一种细菌;2.注意事项：1分离培养前应考虑所分离的细菌的特性,选择适合其生长需要的培养基需氧还是厌氧、营养的要求高还是不高、培养温度等等;例如：链球菌在普通琼脂不长,要加血清或血液;大肠杆菌和葡萄球菌要求较低,普通的培养基即可生长;2防止污染;分离培养的整个过程要严格无菌操作;培养基和一切用具必须彻底灭菌；操作时必须靠近火焰；操作完毕后,禁止再让培养基接触外界空气;3防止接种器械过热,很容易杀死分离培养的细菌,如接种环在烧灼灭菌后,不能立即钓取细菌材料,应在酒精灯旁凉凉；另外还应注意防止已钓取菌料的接种环,不慎通过火焰而将细菌杀死;4初代分离时发现有多种细菌,观察找到目的菌落,再拿一肉汤培养基纯化培养;然后在接种实验动物,作成凝集抗原,做血清学鉴定,;还可以反过来做抹片染色观察;3.分离培养的方法：主要分需氧菌的分离培养方法、厌氧菌的分离培养方法和需要CO菌的培养分离方法;1）需氧菌的分离培养法1平板划线法：划线后有单个菌落,便于观察菌落的形态、溶血性等;方法左手拿琼脂平板,使其与水平面成45;角；右手拿铂金耳,使之与水平面平行,靠近酒精灯火焰操作;将接种环于酒精灯火焰中灼烧灭菌,待其冷却后,蘸取欲检材料少许,注意不要划破琼脂,不要划得太疏,以免造成浪费,不要重复划线,以免形成菌苔;划线方法：方格划线、蛇形划线、区域划线、交叉划线,选择其中一种进行划线;划毕,将接种环烧灼灭菌,于皿底用蜡笔标记被检材料名称及日期,倒转置恒温箱中培养;思考题：方格划线哪个地方会长出单个菌落比较多2倾注法：不常用,这里不做介绍2厌氧菌的分离培养方法厌氧菌生长繁殖的环境不能有游离氧的存在;故在培养厌氧菌时,必须创造一个厌氧环境,一般以降低氧的张力或保持减低的氧张力为原则;目前应用于厌氧菌的分离方法颇多,现就其中较简便且常用的几种方法介绍如下：1焦性没食子酸法利用焦性没食子酸在碱性溶液内能大量地吸收氧的原理进行厌氧培养;通常100cm3空间用焦性没食子酸1g,10%氢氧化钠或氢氧化钾10ml;具体方法有下列有平板培养法、干燥器培养法;平板培养法是将厌氧菌划线接种于适宜的琼脂平板,取一小团直径约2cm的脱脂棉,置于平皿盖的内面中央,其上滴加10%氢氧化钠溶液约5ml；在靠近脱脂棉的一侧放置焦性没食子酸约0.5g,注意暂勿使两者接触,立即将已接种好的平板覆盖于平皿盖上,迅速用融化的石蜡密封平皿边缘周围;封毕,轻轻摇动平皿,使被氢氧化钠溶液浸湿的脱脂棉与焦性没食子酸接触,然后置37℃恒温箱中培养之;干燥器培养法是于干燥器底部放入氢氧化钠溶液适量,然后再放入2-3个略高于液面的玻璃圆柱如链霉素小瓶,将适量焦性没食子酸用纸或纱布包好,放置于圆柱上面,使暂勿与氢氧化钠接触,然后放下隔板,将已接种的培养皿或试管置于隔板上,待一切准备好后,将盖盖好密封,并轻轻摇动干燥器,使焦性没食子酸落入氢氧化钠溶液中;2高层琼脂柱摇震培养分离法取长约15cm,直径约5mm的玻璃棒一支,一端塞以小木塞,另一端塞以棉花塞,高压灭菌备用；加热融化一管适合分离厌氧菌用的琼脂培养基,待冷却至50℃左右,接入少许经适当稀释的待分离的培养物或含菌材料,充分摇震均匀；在琼脂凝固前,迅速以无菌滴管吸取上述已接种的琼脂培养基,注入上述1准备好的玻璃管内,置恒温箱中培养;3连二亚硫酸钠法将已接种的平板或斜面培养基,置于一玻璃干燥器内预先测出体积,按每1000ml容积称取连二亚硫酸钠又称保险粉和无水碳酸钠各4g,并分别研细均匀,临用前混合置于一平皿内,放在培养基上层,然后将盖盖严,用凡士林密封,置37℃恒温箱中培养;2二氧化碳培养法少数细菌如布氏杆菌牛型,在含有10%二氧化碳的环境下生长良好;要创造这样的环境,常用的方法为烛缸法;将接种的培养基置玻璃干燥器或其他可以密闭的玻璃缸内,于其内点燃一小段蜡烛,加上盖盖边涂凡士林以防漏气,约一分钟左右蜡烛熄灭,此时缸内氧气已被耗尽,缸内所含二氧化碳约10%;注意蜡烛勿太长,而且不宜靠近缸壁,以免因局部玻璃过热而破裂;凡士林不能太多也不能太少,多了盖子滑落,少了则封口不严;4.真菌的分离培养法简单介绍应用细菌的平板分离法划线、倾注,能容易而满意地得到真菌的纯培养;划线法：2-5天长霉菌;1取琼脂培养基熔化,冷却至45℃,注入无菌平皿中,每皿15-20ml,作成平板待用;2取要分离的材料如田土、混杂的或污染的真菌培养物、真菌少许,投入盛无菌水之试管中,摇振,使分离菌悬浮水中;3将接种环经火焰灭菌并冷却后,蘸取上述悬浮液,进行平板划线;4划线完毕,置温箱中培养2-5天,待形成子实器官后,钓取单个菌落的部分,制片检查;若只有一种菌生长,即得纯种;另外,亦可在放大镜的观察下,用无菌镊子夹取一段待分离的真菌菌丝,直接放在平板上作分离培养,即可获得该种真菌的纯培养;5.自患病动物病料中分离病原菌方法简单介绍1琼脂斜面分离法取琼脂斜面三管,用接种环蘸取欲检病料少许如为脏器,现将表面灼烧后,用灭菌解剖刀切开,以接种环由切面钓取组织,混合于第一管的凝集水中,再做斜面划线；然后取出接种环,不经烧灼,继续在第二管、第三管斜面上作同样的划线;划毕,置温箱中培养;经此法分离培养后,第二管的菌落较第一管为少,第三管的菌落更少,如此较易得到单个菌落,达到纯培养之目的;2琼脂平板涂布分离法液体被检病料如血液、腹水等,可用灭菌毛细吸管或吸管吸取,置1-2滴于平板中央,用L形玻棒或玻璃刮铲作均匀涂布;如为脏器病料,可先做成乳剂再行涂布；或取其一小块,用镊子夹住,表面烧烙后,用灭菌刀切开,以其切面直接进行涂布;此法适用于含菌量较少的病料的分离;3通过试验动物分离法被检材料中疑有某种病原菌存在,可将病料接种于有易感性的动物体内,如疑有猪丹毒杆菌存在的病料,可注射于鸽体,鸽死后,再取其脾脏以分离猪丹毒杆菌,常可得到纯培养;四、钓菌和纯培养被检材料经分离培养后,选择欲分离的可疑菌落,用灭菌接种环针钓取少许,接种在新的培养基上,称为钓菌;钓取一个菌落培养出来的细菌培养物,称为纯培养;纯培养的目的在于进一步进行微生物学检验和其他试验研究;方法：首先用肉眼或放大镜观察并选择可疑的单个菌落,然后以蜡笔在可疑菌落下面的平皿底上作一记号,用灭菌的接种环针轻轻接触菌落,蘸取菌料少许,作抹片,染色,镜检;如其形态一致,即接种于适当的培养基上,置温箱中培养;6.细菌和真菌的移植方法简单介绍1接种环移植法:以左手持长有细菌或真菌的菌种和无菌的琼脂斜面各一管,管口并齐,管底握于掌中,以右手作握笔状紧执接种环,并进行火焰灭菌；以右手的小指和无名指扭开并夹住第一管的棉塞,无名指和中指扭开并夹住第二管的棉塞,或以小指和无名指同时扭开并夹住两管的棉塞;将管口通过火焰灭菌,然后用烧灼灭菌后的接种环插入菌种管内,钓取少许菌料,接种于无菌的琼脂斜面上;同样将管口通过火焰灭菌后,塞好棉塞,最后将接种环烧灼灭菌,用蜡笔在试管上标记菌名、日期,置温箱中培养;厌氧菌移植常用培养基和培养方法如上述钓菌项;2吸管或注射器移植法:移植定量的液体培养或表面有液体石蜡的厌氧菌培养物,一般也可以利用吸管或注射器移植,其操作方法系以无菌吸管或无菌注射器吸取培养物,代替接种环进行移植;四、示教1. 用普通琼脂平板做一次划线分离培养：点上酒精灯,取实验三所做好的普通琼脂平板,倒置,将培养基靠近酒精灯呈45度打开,然后用铂金耳钓取一环菌在培养基上划线,选四种方格划线、蛇形划线、区域划线、交叉划线画法中的一种;2. 用普通肉汤做一管大肠杆菌的移植培养：手拿大肠杆菌的培养试管和一管肉汤培养基,充分震荡;靠近酒精灯,灼烧管口,充分灼烧铂金耳,放到酒精灯旁边放凉,打开试管塞,灼烧试管口,将铂金耳钓取一环菌,然后将铂金耳放到肉汤培养基,摇晃;灼烧铂金耳,灼烧试管口,把试管塞上;充分灼烧铂金耳;将接好试管和铂金耳放到试管架;3.用普通琼脂斜面做一管金黄葡萄球菌的移植培养：用相同的方法接种,在斜边培养基上划线;放到温箱培养;4.用划线法进行真菌的分离培养示教：与细菌的划线培养相同,画好线后放如温箱培养30℃,2-5天,待形成子实器官后,钓取单个菌落的部分,制片检查;若只有一种菌生长,即得纯种;另外,亦可在放大镜的观察下,用无菌镊子夹取一段待分离的真菌菌丝,直接放在平板上作分离培养,即可获得该种真菌的纯培养;五、实验中应注意的问题1分离培养前应考虑所分离的细菌的特性,选择适合其生长需要的培养基需氧还是厌氧、营养的要求高还是不高、培养温度等等;例如：链球菌在普通琼脂不长,要加血清或血液;大肠杆菌和葡萄球菌要求较低,普通的培养基即可生长;2防止污染;分离培养的整个过程要严格无菌操作;培养基和一切用具必须彻底灭菌；操作时必须靠近火焰；操作完毕后,禁止再让培养基接触外界空气;3防止接种器械过热,很容易杀死分离培养的细菌,如接种环在烧灼灭菌后,不能立即钓取细菌材料,应在酒精灯旁凉凉；另外还应注意防止已钓取菌料的接种环,不慎通过火焰而将细菌杀死;4初代分离时发现有多种细菌,观察找到目的菌落,再拿一肉汤培养基纯化培养;然后在接种实验动物,作成凝集抗原,做血清学鉴定,;还可以反过来做抹片染色观察;六、作业1.为什么要进行细菌的分离培养2.进行分离培养应注意哪些事项3.细菌分离培养的方法有哪些重点叙述平板划线法4.叙述真菌的划线分离方法;七、本次实验总结1.掌握划线法,熟悉四种划线方法;以及细菌的移植方法;2.在操作过程中要防止污染;分离培养的整个过程要严格无菌操作;培养基和一切用具必须彻底灭菌；操作时必须靠近火焰；操作完毕后,禁止再让培养基接触外界空气;3.操作的过程中要注意不要让接种器械过热;防止杀死细菌或真菌,如接种环在烧灼灭菌后,不能立即钓取细菌材料,应在酒精灯旁凉凉；另外还应注意防止已钓取菌料的接种环,不慎通过火焰而将细菌杀死;八、附：实验四：细菌的划线分离与培养实验所需物品一、试验材料名称组别数量合计备注1、酒精灯 5 2 10 火机柴2、接种环 5 2 103、培养基自备用前融解普通琼脂4、菌种大肠杆菌肉汤、金黄色葡萄球菌斜面每组各1管5、病料粪便6、霉菌菌种7、真菌培养基马铃薯－葡萄糖培养基,应提前制备平板每班2个8、9ml生理盐水试管4只9、5ml吸管10、吸球11、酒精棉球二、仪器设备名称1、干燥箱1台2、水浴锅1台3、培养箱1台表1、试验仪器设备统计表学院牧医工程实验室名称畜牧微生物实验名称实验四细菌的划线分离与培养表2、试验试剂消耗情况统计表学院牧医工程实验室名称畜牧微生物实验名称实验四细菌的划线分离与培养表3.实验用低值易耗品及实验动物统计表系别：牧医实验室名称：畜牧微生物实验名称：。
放线菌实验报告
放线菌实验报告放线菌实验报告一、引言放线菌是一类广泛存在于土壤和水体中的微生物，其具有重要的生物学意义和应用价值。
本次实验旨在通过对放线菌的培养、鉴定和抗菌活性测试，了解放线菌的特性和应用前景。
二、材料与方法1. 放线菌培养基的制备：将葡萄糖、酵母粉、肉膏粉、胰蛋白胨等按一定比例溶解于蒸馏水中，加热煮沸，倒入培养瓶中，待冷却后加入抗生素。
2. 放线菌的采集：在适宜的环境中采集土壤或水样，并将样品分装于离心管中。
3. 放线菌的分离：取适量样品并加入适量的生理盐水，摇匀后进行稀释，取适量稀释液分别均匀涂布于放线菌培养基上。
4. 放线菌的纯化：从培养基上挑选出单菌落，进行连续传代，直至获得纯种放线菌。
5. 放线菌的鉴定：通过形态特征、生理生化特性和分子生物学方法对放线菌进行鉴定。
6. 抗菌活性测试：采用平板扩散法或孔隙扩散法，将放线菌菌液或提取物涂布于琼脂平板上，观察抑菌圈的形成情况。
三、结果与分析经过培养和分离，我们成功获得了多个放线菌菌株。
在鉴定过程中，我们观察到这些放线菌菌株形态各异，有的呈现棕黄色，有的呈现淡黄色，有的呈现灰白色。
此外，通过生理生化特性的检测，我们发现这些放线菌菌株对某些碳源和氮源具有不同的利用能力。
进一步的分子生物学分析结果显示，这些放线菌菌株属于不同的物种。
在抗菌活性测试中，我们选取了几个放线菌菌株进行了评估。
结果显示，这些放线菌菌株对多种细菌具有一定的抑制作用。
其中，某一放线菌菌株对金黄色葡萄球菌表现出了较强的抗菌活性，形成了较大的抑菌圈。
这表明该放线菌菌株可能具有潜在的抗生素生产能力。
四、讨论与展望通过本次实验，我们成功地获得了多个放线菌菌株，并对其进行了鉴定和抗菌活性测试。
然而，由于时间和设备的限制，我们并未对放线菌的抗生素产物进行深入研究。
因此，未来可以进一步探索这些放线菌菌株的抗生素产物，并对其进行分离、纯化和结构鉴定，以期发现新的抗生素。
此外，放线菌不仅具有抗菌活性，还具有其他生物活性物质的合成能力，如抗肿瘤物质、抗病毒物质等。
放线菌的实验报告
放线菌的实验报告放线菌的实验报告一、引言放线菌是一类广泛存在于自然界中的微生物，以其独特的形态和生物学特性而备受研究者的关注。
本实验旨在通过对放线菌的分离培养、形态观察和抗生素产生能力的检测，进一步了解放线菌的特点和应用潜力。
二、材料与方法1. 放线菌分离培养：将土壤样品取自自然环境中，加入到含有适宜培养基的培养皿中，进行稀释均匀。
然后将培养皿密封，置于恒温培养箱中，在适宜的温度下培养一段时间，直至观察到单个菌落的形成。
2. 放线菌形态观察：取一颗单个菌落，用显微镜观察其形态特征，包括菌丝的形状、颜色、分枝情况等。
3. 抗生素产生能力检测：将分离得到的放线菌菌株接种到含有抗生素敏感菌株的琼脂平板上，观察菌落周围是否出现抑制圈。
三、结果与讨论1. 放线菌的分离培养：经过一段时间的培养，观察到培养皿中出现了单个菌落。
将这些菌落通过传代培养，得到纯种的放线菌菌株。
2. 放线菌的形态观察：在显微镜下观察到放线菌菌丝呈分枝状，颜色多样，有的呈白色、黄色或橙色。
菌丝通常呈直线状，但也有少数呈弯曲或环状。
3. 抗生素产生能力检测：将分离得到的放线菌菌株接种到含有抗生素敏感菌株的琼脂平板上，观察到菌落周围出现了抑制圈。
这表明放线菌具有抗生素产生的能力，可以对其他细菌产生抑制作用。
放线菌作为一类重要的微生物资源，具有广泛的应用前景。
其产生的抗生素被广泛应用于医药领域，用于治疗各种感染性疾病。
此外，放线菌还具有其他生物活性物质的合成能力，如抗肿瘤物质、抗氧化物质等。
因此，对放线菌的深入研究具有重要意义。
在本次实验中，我们成功地从自然环境中分离出了放线菌，并观察到了其形态特征和抗生素产生能力。
然而，实验中仍存在一些不足之处。
首先，由于实验时间有限，我们只对放线菌的形态进行了简单的观察，没有进行更深入的分类和鉴定。
其次，我们只检测了放线菌的抗生素产生能力，而未对其产生的抗生素进行具体的鉴定和分析。
为了更好地发掘和利用放线菌的潜力，今后的研究可以从以下几个方面展开：1. 对分离得到的放线菌菌株进行进一步的形态学和生理学研究，以了解其多样性和适应能力；2. 对放线菌产生的抗生素进行鉴定和分析，以寻找新的抗生素种类和开发新的药物；3. 利用基因工程技术改造放线菌，提高其抗生素产量和质量。
实验四 细菌、真菌、放线菌的分离与培养
实验报告课程名称：环境微生物学实验实验类型：综合实验实验项目名称：微生物的分离与培养与菌落观察学生姓名：专业：环境工程学号：同组学生姓名：指导老师：实验地点：实验日期：2018 年 10月16日一、实验目的和要求1.掌握微生物接种培养技术2.掌握微生物分离纯化技术3.学习并掌握放菌落形态结构的观察方法，认识并理解它们的形态特征。
二、实验内容和原理土壤是微生物生活的大本营，是寻找和发现具有重要价值微生物的主要菌源。
在不同土壤中，各类微生物的数量千差万别。
为了分离获得某种微生物,需要预先制备不同稀释度的菌悬液，并添加相应的抗生素抑制不需要的微生物，例如，添加链霉素25~50U/mL抑制细菌;添加0.5%重铬酸钾液或制霉素50 U/mL 抑制霉菌。
通过10倍稀释以及平板分离、平板涂布和平板划线等操作，微生物可在平板上分散成单个的个体，经过适宜条件培养，单个个体可形成单个菌落。
挑取单个菌落转接至新鲜平板上，即可使目的菌种纯化。
1.菌种的分离纯化：从混杂微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物分离与纯化。
在分子生物学的研究及应用中，不仅需要通过分离纯化技术从混杂的天然微生物群中分离出特定的微生物，而且还必须随时注意保持微生物纯培养物的“单一性”，防止其他微生物的混入。
2.平板涂布法：因为将微生物悬液先加到较烫的培养基中再倒平板易造成某些热敏感菌的死亡，且采用稀释倒平板法也会使一些严格好氧菌因被固定在琼脂中间缺乏氧气而影响其生长，因此在微生物学研究中常用的纯种分离方法是涂布平板法。
用途上，一般多用于从菌种的纯化;优点是可以观察菌落特征，对混合菌进行分离;但不能计数3.平板划线法：最简单的分离微生物的方法是平板划线法，其原理是将微生物样品在固体培养基表面多次作“由点到线”稀释而达到分离目的的。
划线的方法很多，常见的比较容易出现单个菌落的划线方法有斜线法、曲线法、方格法、放射法、四格法等。
用途一般多用于筛选菌株。
实验四、土壤中放线菌的分离
实验四、土壤中放线菌的分离一、实验目的1、从土壤中分离、纯化放线菌；初步掌握药用微生物的分离纯化方法和操作技术。
2、了解不同生境条件中土壤放线菌的种类与数量。
二、实验内容筛选放线菌永远是新抗生素研究的课题之一。
迄今为止，已发现的抗生素约有80%来自于放线菌。
土壤中放线菌最丰富，品种齐全。
通常情况下，放线菌在比较干燥、偏碱性、含有机质丰富的土壤中数量居多。
随着地理分布、植被及土壤性质的不同，放线菌的种类、数量和拮抗性也各不相同。
从堆肥或过热的材料中如干草或蔗渣中可分离到大量的嗜热放线菌，从淡水和海洋环境中可分离到嗜碱性的和嗜酸性的菌种。
土壤中含有的放线菌主要是链霉菌，人们通常将除链霉菌以外的其它放线菌统称为稀有放线菌，如小单孢菌、游动放线菌、诺卡氏菌等，它们是生物活性物质重要的产生菌。
但往往由于样品中稀有放线菌的数量太少，常规的分离方法很难得到。
对样品进行风干、干热处理、培养基添加重铬酸钾等方法可以减少细菌和真菌的数量，以提高放线菌的获得率。
用干热和苯酚处理可减少链霉菌数量和比例的方法，可以分离得到更多种类的放线菌。
土壤中分离放线菌的方法很多，其中包括稀释法、弹土法、混土法和喷土法等，本实验主要采用稀释法来获得放线菌。
注：从土壤中分出的放线菌要进一步鉴别是否为抗生菌。
首先应根据筛选目的确定试验模型，然后利用培养基平板进行拮抗性测定。
常用的方法有琼脂块法和滤纸片法。
其主要依据是扩散原理，即观察在抗生菌周围是否会出现明显的抑菌圈。
抑菌圈的大小和透明度则表明了该菌株抗菌活性的强弱。
三、实验原理、方法和手段原理一：稀释涂布平板法；如图1。
原理二：对样品进行风干、干热处理以减少细菌和真菌的数量；原理三：向培养基添加适量的重铬酸钾能抑制其他细菌、真菌的生长，但不影响放线菌的生长。
图1 稀释涂平板法示意图四、实验组织运行要求根据本实验的特点、要求和具体条件，采用“采用集中授课形式，分组试验进行”的组织运行模式。
土壤中放线菌的分离和纯化实验(精选5篇)精选全文完整版
可编辑修改精选全文完整版土壤中放线菌的分离和纯化实验（精选5篇）第一篇：土壤中放线菌的分离和纯化实验土壤中放线菌的分离和纯化实验一、实验目的1、制作MS培养基的方法，掌握母液的保存方法。
2、掌握培养基的灭菌方法。
掌握外植体的消毒和超净工作台的使用。
4、掌握放线菌的分离纯化及染色的基本流程；5、掌握高氏一号培养基的配制方法；6、复习分离纯化放线菌的基本操作技术、培养方学会使用高压蒸汽灭菌锅。
7、培养微生物实验的设计思路和动手能力。
二、实验材料高压蒸汽锅、培养瓶、石斛的愈伤组织、超净工作台，酒精灯、酒精棉球、镊子、电子天平、称量纸、烧杯、量筒、显微镜、三角锥形瓶、无菌培养皿、接种环、酒精灯、分析天平；接种环、载玻片、盖玻片、玻璃珠、移液枪、剪刀三、实验原理植物组织培养即植物无菌培养技术，又称离体培养，是根据植物细胞具有全能性的理论，利用植物体离体的器官(如根、茎、叶、茎尖、花、果实等）、组织（如形成层、表皮、皮层、髓部细胞、胚乳等）第 1 页或细胞（如大孢子、小孢子、体细胞等）以及原生质体,在无菌和适宜的人工培养基及温度等人工条件下，能诱导出愈伤组织、不定芽、不定根，最后形成完整的植株的学科。
四、实验步骤1、配制MS培养基8L，称取马铃薯1600g、香蕉400g、蔗糖240g、活性炭8半勺、琼脂80g、配制母液。
2、配制培养液时应注意：①在使用提前配制的母液时，应在量取各种母液之前，轻轻摇动盛放母液的瓶子，如果发现瓶中有沉淀、悬浮物或被微生物污染，应立即淘汰这种母液，重新进行配制；为防止母液被微生物污染，有机母液放在冰箱里4℃保存；②用量筒或移液管量取培养基母液之前，必须用所量取的母液将量筒或移液管润洗2次；③量取母液时，最好将各种母液按将要量取的顺序写在纸上，量取1种，划掉1种，以免出错。
溶化琼脂用粗天平分别称取琼脂9 g、蔗糖30 g，放入1 000 mL的搪瓷量杯中，再加入蒸馏水750 mL，用电炉加热，边加热边用玻璃棒搅拌，直到液体呈半透明状。
【精品】实验八 土壤中细菌、放线菌、酵母菌及霉菌的分离与纯化95
五、实验报告
1、在你所制备的培养基的平板上长出的菌落分别属于哪个类群？简述它们的菌落形态特征。 2、在分区平板划线法中，为什么每次都需将接种环上剩物烧掉？ 3、为什么要把培养皿备。 2、培养基：牛肉膏蛋白胨培养基，高氏一号培养基，马丁氏培养基，豆芽汁葡萄糖培养基 3、无菌生理盐水。 4、其它物品 无菌培养皿、无菌移液管、无菌玻璃涂棒、称量纸、药勺、橡皮头、10％酚溶液。
四、实验步骤
1、制备土壤稀释液 2、涂布法进行分离 3、培养 4、菌落计数 5、划线分离
实验八 土壤中细菌、放线菌、 酵母菌及霉菌的分离与纯化
一、实验目的 1、熟悉从自然界中分离微生物的原理； 2、掌握细菌、放线菌、酵母菌、霉菌的分离纯化方法。
酵母菌及霉菌的分离与纯化 1、熟悉从自然界中分离微生物的原理； 1、在你所制备的培养基的平板上长出的菌落分别属于哪个类群？简述它们的菌落形态特征。 1、在你所制备的培养基的平板上长出的菌落分别属于哪个类群？简述它们的菌落形态特征。 1、熟悉从自然界中分离微生物的原理； 1、熟悉从自然界中分离微生物的原理； 2、在分区平板划线法中，为什么每次都需将接种环上剩物烧掉？ 2、掌握细菌、放线菌、酵母菌、霉菌的分离纯化方法。 3、为什么要把培养皿倒置培养？ 酵母菌及霉菌的分离与纯化 酵母菌及霉菌的分离与纯化 2、掌握细菌、放线菌、酵母菌、霉菌的分离纯化方法。 1、熟悉从自然界中分离微生物的原理； 2、在分区平板划线法中，为什么每次都需将接种环上剩物烧掉？ 2、掌握细菌、放线菌、酵母菌、霉菌的分离纯化方法。 2、在分区平板划线法中，为什么每次都需将接种环上剩物烧掉？ 微生物四大类菌的分离和培养 2、掌握细菌、放线菌、酵母菌、霉菌的分离纯化方法。 2、在分区平板划线法中，为什么每次都需将接种环上剩物烧掉？ 4、其它物品 无菌培养皿、无菌移液管、无菌玻璃涂棒、称量纸、药勺、橡皮头、10％酚溶液。
放线菌的实训报告
放线菌的实训报告放线菌实训报告一、实训目的：本次实训旨在了解放线菌的基本特征和培养方法，培养并观察放线菌的形态特征，掌握放线菌筛选的基本技巧，并进行放线菌的鉴定和分离。
二、实训材料和设备：实验材料：放线菌培养基、放线菌菌种、蒸馏水、琼脂平板。
实验设备：培养箱、无菌工作台、显微镜。
三、实训步骤：1.消毒操作：接种前用75%酒精对培养箱和显微镜进行消毒处理，以保证实验环境的无菌。
2.制备放线菌培养基：按照装瓶要求，取适量的放线菌培养基粉末，加入适量的蒸馏水，搅拌均匀后煮沸5-10分钟，灭菌后并倒入培养瓶中。
3.接种放线菌菌种：取一支含有放线菌菌种的接种环，沾取适量的菌种，均匀划线于琼脂平板上。
4.培养放线菌：将接种好的琼脂平板放入培养箱中，在适宜的温度下进行培养，观察并记录菌落的形状、颜色等特征。
5.放线菌的分离：当菌落生长到一定程度后，用显微镜观察菌落上的单个细菌，用无菌的锥形瓶将单个菌落转移到新的琼脂平板上，分离出纯系的放线菌。
6.放线菌的鉴定：分离纯系的放线菌后，用显微镜观察菌落的形态特征，并测定其生理和生化特性，辅以其他鉴定方法，如抗生素敏感性试验等，以确定其分类地位。
四、实训结果：通过本次实训，我们培养出了放线菌菌落，观察到它们的形态特征，如菌落的形状、颜色、质地等。
经过放线菌的分离和鉴定，我们确定了放线菌的分类地位，进一步深入了解了放线菌的基本特征。
五、实训体会：本次实训让我们对放线菌有了更深入的了解，通过亲自操作，我们掌握了放线菌的培养方法和分离技巧，提高了实验操作能力。
放线菌作为一类重要的微生物资源，在药物和生物工程等领域有着广泛的应用前景，通过学习和实验，我们对其应用和潜力有了更深刻的认识。
六、实验总结：本次实训通过培养、观察、分离和鉴定放线菌，加深了我们对放线菌的认识，并掌握了放线菌培养的基本技巧。
实验中，我们要严格遵守操作规程，保持实验环境的无菌，并且要仔细观察菌落的形态变化，及时记录实验数据。
环境微生物学-实验四(五) 细菌的纯培养、分离
实验四（五）环境中微生物分离与培养一、实验目的1、掌握从环境（土壤、水体、活性污泥、垃圾堆肥等）中分离培养细菌的方法，获得若干种细菌纯种培养技能。
2、掌握几种接种技术。
3、了解菌种的保藏方法。
二、实验仪器和材料恒温箱、涂布器、细铁丝、接种环、酒精灯、吸耳球、棉花、记号笔；无菌培养皿（直径90毫米）、无菌移液管（1毫升和10毫升）；肉汤蛋白胨培养基、高氏１号培养基、马铃薯培养基；活性污泥或土壤10克、无菌水90毫升、9毫升无菌水（试管中）；酵母、大肠杆菌。
三、细菌纯种分离的操作方法细菌纯种分离的方法有两种：稀释平板法和平板划线法。
（一）稀释平板分离的方法1、取样用无菌锥形瓶到现场取一定数量的活性污泥或土壤，迅速带回实验室。
2、稀释水样将1瓶90毫升和5管9毫升的无菌水排列好，按10-1、10-2、10-3、10- 4、10-5、10-6依次编号。
在无菌操作条件下，将样品（10克）置于第一瓶90毫升无菌水中，用手摇10分钟，将颗粒状样品打散，即为10-1浓度的菌液。
用1毫升无菌移液管吸取1毫升10-1浓度的菌液于一管9毫微升无菌水中，同样方法，依次稀释到10-6。
每次稀释时，需用不同的无菌移液管，或将同一移液管用无菌水洗三次。
3、平板的制作取10套无菌培养皿编号，10-4、10-5、10-6各3个，另1个为空气对照。
取1支1毫升无菌移液管从浓度小的10-6菌液开始，以10-6、10-5、10-4为序分别吸取0.5毫升菌液于相应编号的培养皿内（注：每次吸取前，用移液管在菌液中吹泡使菌液充分混匀），加热熔化培养基，当培养基冷至45℃左右时，右手拿装有培养基的锥形瓶，左手拿培养皿，以中指、无名指和小指托住皿底，拇指和食指夹住皿盖，靠近火焰，将皿盖掀开，倒入培养基后将培养皿平放在桌上，顺时针和逆时针来回转动培养皿，使培养基和菌液充分混匀，冷凝后即成平板，倒置于30℃恒温箱中培养48小时，然后观察结果。
取对照无菌培养皿，打开皿盖10分钟后盖上皿盖，倒置30℃恒温箱中培养48小时后，观察结果。
土壤微生物测定方案
2 三大类土壤微生物培养基的分离
三大类土壤微生物的分离采用稀释平板涂抹法，每个菌种要求做 3 个稀释度，每个稀释度做
3-4 次重复，选取细菌和放线菌的菌落在 20~-200 之间的培养皿、真菌的菌落在 10-~100 的培养皿计数，并计算三次重复的平均值。每克干土中微生物数量计算式：
③根据各类微生物在土壤中的数量多少选择适当稀释度的悬液接种。本实验选择细菌的稀释度为 10-~10-5，放线菌为 10~-10-4，真菌为 10-1~-10-3。 -3-2
④土壤悬液的接种方法：在无菌培养皿中倒入 15~20 ml 选择性培养基，待凝固后，用 0.2 ml无菌移液枪吸取0.2 ml各稀释度的土壤悬液，然后立即用涂抹棒将悬液均匀的涂抹于培养基表面。用同一支吸管接种时，从高稀释度开始，依次接种到低稀释度。
0.5g、NaCl 0.5g、琼脂 18g、3%重铬酸钾溶液 3.3ml、蒸馏水 1000ml、pH 值 7.2~-7.4
3，真菌：马丁氏培养基（虎红琼脂）：蛋白胨 5g、KH2PO4 1g、MgSO4 0.5g、葡萄糖 10g、琼脂 18.5g、孟加拉红 0.033g、氯霉素 0.1g、蒸馏水 1000ml
所有培养基需在湿热灭菌锅中 121°C 灭菌 20-~30 min。
②将上面的土壤悬液用无菌移液管吸取 5 ml 到 45 ml 稀释液中，即为 10-2稀释度，依次按 10倍法稀释，制成 10-1~-~10-6稀释度。（注意：每次吸取悬液时，在稀释液中反复吸入和吹出 3-~5 次，减少因管壁吸附而造成的误差，并使悬液进一步分散，每个稀释度需要更换无菌吸管吸取悬液。）
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实验报告课程名称：环境微生物学实验实验类型：综合实验实验项目名称：微生物的分离与培养与菌落观察学生姓名：专业：环境工程学号：同组学生姓名：指导老师：实验地点：实验日期：2018 年 10月16日一、实验目的和要求1.掌握微生物接种培养技术2.掌握微生物分离纯化技术3.学习并掌握放菌落形态结构的观察方法，认识并理解它们的形态特征。
二、实验内容和原理土壤是微生物生活的大本营，是寻找和发现具有重要价值微生物的主要菌源。
在不同土壤中，各类微生物的数量千差万别。
为了分离获得某种微生物,需要预先制备不同稀释度的菌悬液，并添加相应的抗生素抑制不需要的微生物，例如，添加链霉素25~50U/mL抑制细菌;添加0.5%重铬酸钾液或制霉素50 U/mL 抑制霉菌。
通过10倍稀释以及平板分离、平板涂布和平板划线等操作，微生物可在平板上分散成单个的个体，经过适宜条件培养，单个个体可形成单个菌落。
挑取单个菌落转接至新鲜平板上，即可使目的菌种纯化。
1.菌种的分离纯化：从混杂微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物分离与纯化。
在分子生物学的研究及应用中，不仅需要通过分离纯化技术从混杂的天然微生物群中分离出特定的微生物，而且还必须随时注意保持微生物纯培养物的“单一性”，防止其他微生物的混入。
2.平板涂布法：因为将微生物悬液先加到较烫的培养基中再倒平板易造成某些热敏感菌的死亡，且采用稀释倒平板法也会使一些严格好氧菌因被固定在琼脂中间缺乏氧气而影响其生长，因此在微生物学研究中常用的纯种分离方法是涂布平板法。
用途上，一般多用于从菌种的纯化;优点是可以观察菌落特征，对混合菌进行分离;但不能计数3.平板划线法：最简单的分离微生物的方法是平板划线法，其原理是将微生物样品在固体培养基表面多次作“由点到线”稀释而达到分离目的的。
划线的方法很多，常见的比较容易出现单个菌落的划线方法有斜线法、曲线法、方格法、放射法、四格法等。
用途一般多用于筛选菌株。
一般用于平板培养基的回收率计数。
优点是可以计数，可以观察菌落特征。
缺点是吸收量较少，较麻烦，平板不于燥效果不好，容易蔓延。
如果菌液密度天的话，长不出单菌落。
4.稀释倒平板法：稀释倒平板法是将细菌与液态的培养基混合后倒入培养皿再冷却凝固，使样品中的微生物细胞充分分散开，使其均匀分布于平板中的培养基内。
经培养后，单个细胞及聚在一起的细胞可以生长繁殖，形成一个肉眼可见的菌落，统计菌落数目，即可用以评价样品中的微生物的数量。
所以细菌在培养基的内部和表面都有,适合厌氧型微生物。
5.菌种保藏：菌种保藏是将微生物的菌种经长时间的保存，不污染其它杂菌，及可保持其形态特征和生理性状，减少变异，防止衰老，以便于将来使用。
保藏菌种一-般是选用它的休眠休，如孢子;芽孢等等，并且要创造一一个低温;干燥; 缺氧;避光和缺少营养的环境条件，以利于休眠体能长期地处于休眠状态。
对于不产孢子的微生物，应使其新陈代谢处于最低状态，又不会死亡，从而达到长期保存的目的7.微生物分离培养结果观察：在环境样品的微生物分离过程中，虽然用了不同的培养基并添加了一定的选择性抑茵物，但并不能保证牛肉膏蛋白胨培养基上长的都是细苗，高氏号培养基上长的都是放线菌，马铃薯蔗糖培养基上长的都是真茵。
因此，必须对微生物的的落形态进行识别。
*菌落识别：菌落特征是细胞(首丝群体形态在宏观上的反映，是鉴定各类微生物的重要形态学指标。
熟悉和掌握四大类敬生物细菌、放线菌、酵母药、需菌茵落形态的特征，对于菌种识别和筛选具有重要作用。
*移植：从疏离孤独的单药落中挑取培养物接种至新鲜培养基。
三、主要仪器试剂（必填）1.菌源:选定采取土样的地点后，铲去表士层(2~3 cm)，取深层(3~10 cm)土壤109.装入无菌牛皮袋内，封好袋口，并记录取样地点、环境特征和详细日期。
取回土样后，及时分离菌种，若不能及时分离,将土样保存在低温、干燥的条件下，尽可能减少菌相变化。
2.培养基(10 mL装):牛肉膏蛋白胨琼脂培养基，淀粉琼脂培养基，马铃薯蔗糖培养基。
3.无菌水:在250 mL锥形瓶中,灌装45 mL蒸馏水，放人10粒玻璃珠;在5~7支试管中灌装9mL蒸馏水，灭菌备用。
4.试剂:5000 U/mL链霉素液;0.5%重铬酸钾液或50 U/mL制霉素。
5.其他用品:无菌培养皿，无菌移液管，无菌三角玻棒接种环酒精灯，特种铅笔，标签纸，胶水，天平,恒温水浴锅，恒温培养箱。
四、操作方法和实验步骤1.土壤稀释液的制备：称取5克土至装有45ml无菌水的三角瓶(佛政璃珠)中，振荡10min (注意不要弄湿瓶塞)后，即成1O^-1的土壤悬液，静置30秒后取样。
取三支装有9ml无菌水的试管，分月编上10^-2、10^-3。
10^-4.用无菌吸管收取土壤悬液1ml，移入10^-2管中反复吹吸三次，充分混匀后即得10^-2稀释液，换一只无菌试管依次10^-3、10^-4稀释液。
2.划线法分离细菌：曲一瓶培养基先倒平板，带平板凝固后，用接种环从相应的土壤悬液取一环用分区划线法在平板上划线。
在28~30度下倒置培养，观察。
3.涂布法分离放线菌：倒平板前先加0.1ml0.5%重铬酸钾于灭菌培养皿中，并取配置好的培养基到平板。
轻轻混匀培养皿上的重铬酸钾与培养基。
待培养基干固后，用移液管移取土壤稀释液0.2ml 于平板上，用三角波棒轻轻涂抹，在表面均匀抹开，在28~30度下倒置培养6~7天，观察。
4.混菌法分离真菌：取5000U/ml链霉素0.2ml至于培养皿一边，再分别取10^-4、10^-3土壤稀释液各1ml，至于培养皿另一边，严防二者相混。
向每皿倒入以融化并冷却至50度左右的真菌培养基，将培养基放在桌上进行运转，使菌液、链霉素、培养基混合均匀。
待凝固后，在28~30度下倒置培养5~6天，观察5.细菌的分离纯化：(1)细茵:挑取单菌落，以分区划线法在平板培养基上进步分离纯化，后续进行生理生化鉴定。
(2)放线菌:挑取单菌落，移植至斜面培养基(3)真菌:挑取单菌落，移植至斜面培养基五、实验结果与分析菌落照片菌落形态与描述细菌1 *细菌菌落与培养基结合叫不紧密，容易被接种环挑起，有臭味，菌落分布不均菌落1：外形为不规则状，边缘为波形，表面稍稍隆起，表面湿润，淡黄色，稍透明，表面扁平，没有运动能力。
菌落2：外形为丝状，边缘为丝状，表面湿润，呈乳黄色，表面扁平，遍布于大面积的平板，扩散至未划线区，为有鞭毛可以运动之细菌。
菌落3：外形为圆形，边缘为光滑，表面湿润，乳白色，表面凸透镜状，没有运动能力。
菌落4：外形为圆形，边缘为光滑，表面湿润，橙黄色，表面凸透镜状，没有运动能力。
细菌2 同细菌1，有菌落1、2、3、4。
菌落5：外形为圆形，边缘为光滑，表面湿润，呈色，不透明，表面凸透镜状，没有运动能力。
放线菌3 *闻起来有土腥味，培养基变深色，菌落分布均匀菌落6：外形为不规则状，边缘为波浪形，表面湿润，乳白色，透明，表面突起，没有运动能力。
菌落7：外形为圆形，边缘光滑，表面湿润，乳白色，稍透明，表面突起，没有运动能力。
菌落8：外形为圆形，表面干燥呈细致粉末状，菌落呈非色，不透明，表面凸透镜状，菌落与培养基牢固结合。
菌落9：外形为圆形，表面干燥呈细致粉末状，菌落呈白色，不透明，表面突起，菌落与培养基牢固结合。
菌落10：外形为不规则状，表面较为湿润，边缘为不规则形，菌落浅黄色，稍透明，表面隆起。
放线菌4 *闻起来有土腥味，菌落分散不均菌落11：外形为圆形，表面干燥呈致密粉末状，，菌落外围为白色考中心部位为灰色，不透明，表面隆起。
有菌落6、10、9菌落12：外形为椭球形，表面较为湿润，边缘为光滑，菌落呈棕色，稍透明，表面隆起。
真菌5 *培养皿表面覆满白色绒毛状结构，从皿底一直延伸到顶部与皿盖接和，开盖时可以闻到一股霉味，从皿底看培养皿中的培养基呈黄色。
菌落13：菌落表面覆盖有白色丝状的绒毛结构，其结构一被接种环碰到就会塌陷，菌落底部可以看见黑色的细小颗粒，有序的排列在菌落表面，从底部难菌落外围呈黑色，中心呈棕黄色。
菌落14：菌落表面覆盖有白色丝状的绒毛结构，菌落底部可以看见呈黑色，为不规则状，边缘为波形。
菌落15：菌落表面覆盖有白色丝状的绒毛结构，菌落底部可以看见呈棕色，外形呈椭圆形，边缘为光滑。
真菌6 *培养皿表面不像真菌5那般布满绒毛，但可见培养基上布满粉状的孢子菌落16：菌落表面覆盖有白色丝状的绒毛结构，，外形呈圆形，边缘为光滑。
菌落17：菌落表面覆盖有白色丝状的绒毛结构，，外形呈不规则状，边缘崎岖。
且菌落外边出现一无粉状孢子分布的小区。
六、讨论、心得本次实验中初次的划线法分离细菌完成度较差，后续可做纯化单菌落较少，推测原因为在进行划线时线条过于密集，尤其是第四区的线，过于稠密，故难以得到独居疏离群体的纯菌落。
而在放线菌的培养中出现了许多表面湿润的菌落，一其表面特征推测其非为放线菌，可能为细菌或酵母菌，且由于这些菌的污染使的许多放线菌的菌落无法使用，尤其在稀释倍数较低的涂布平板上此现象特别明显，因此可能下次可以提高加入的重铬酸钾的浓度。
在真菌的培养中，由于霉菌的生长速度较快，其气生菌丝大多都已占领整个平板并开始散布孢子，应此几乎不可能得到纯种菌株，下次应可考虑将培养时间缩短，已做观察。
七、思考题1.什么叫做无菌操作?分离放线菌与真菌为何需要加入重铬酸钾和链霉素?无菌操作，是指在无菌室或超净台中进行以防止微生物进入人体或污染供试菌的操作技术。
无菌操作是各种生物实验和生产实践中一项重要的基本操作。
无菌操作的要求是：操作前将操作空间中的细菌和病毒等微生物杀灭；操作过程中保证操作空间与外界隔离，避免微生物的侵入。
培养基中加入一些抑菌剂或者消毒剂等特殊成分，是为了抑制某些微生物生长，而目标微生物的生长不受干扰。
链霉素对细菌有非常强的抑制作用，可以防止培养基上细菌生长过快而干扰霉菌的生长。
重铬酸钾对土壤真菌、细菌有明显的抑制作用，而对放线菌无抑制作用，可作为选择性分离放线菌的一种高效、便宜的抑制剂。
2.平板培养时为什么要把培养皿倒置?皿盖向上培养时，培养基蒸发的水分会凝结在皿盖上，并可能掉落到培养基表面，影响培养结果。
而培养皿倒置，水分蒸发会在培养基表面均匀凝结，并且蒸发与凝结会形成平衡，不会影响培养结果，同时水雾的形成也较不会干扰视线。
这是主要原因。
其次是倒置不会在拿起时只拿起皿盖。
而正置时拿培养皿，可以只把皿盖拿起来，让培养基暴露在空气中。
3.好氧培养和厌氧培养的原理和方法有何不同?有氧培养：在有氧呼吸中，氧被用作最终电子受体。
对于好氧微生物，培养中必须满足它们对氧的需要。
实验室里常用的有氧培养方法有:平板培养、斜面培养、浅层液体培养、液体振荡培养和通气搅拌培养等。