第五章DNA的分子结构下概论

dC dt
=kC2
积分
t=0，C=C0
C = —1— C0 1+kC0t
当反应完成一半，即半复性时，
C C0
Βιβλιοθήκη Baidu
=
0.5
t=t1/2
C0t1/2 = 1/k
任何特定DNA的复性都可用C0t1/2 表示，单位是 核苷酸mol.秒/L。通常用C0t1/2 来描述基因组的复 性特征。 C0t1/2值与基因组中DNA含量直接相关， DNA总量一定时，复性反应的C0t1/2与反应体系中
C0t1/2（某基因组DNA）= 复杂性（基因组DNA）
C0t1/2（大肠杆菌DNA）
4.2 × 106bp
对于大部分原核生物进行复性动力学分析都可以 得到单相C0t曲线，复杂性可以直接以基因组大小 来表示。用复性动力学对真核生物基因组作分析 时，曲线就复杂了，通常反应的C0t值跨越8个对 数量的值，因为它是由几个动力学纯的单个复性 组分组成的，每个组分有自己的特征复性动力学。 根据这种C0t曲线可以计算出在该真核生物基因组 中各种类别重复DNA的比例及其拷贝数。
式中69.3是无G-C对存在时的Tm。
②溶液的离子强度
在不同盐浓度的同一种DNA热溶液中， Tm随盐浓度增加而增高，而且变性过程跨 越的温度范围更狭窄，也就是盐溶液浓度 越大，变性越困难。在纯水中，双链互相 排斥，DNA在室温下就会变性。
③溶液的pH
溶液在pH 5-9的范围内改变时，Tm变化不明显， pH低于5.0时，DNA不稳定，易脱嘌呤。更酸的条 件使碱基广泛质子化；高pH条件下碱基广泛去质子， 氢键破坏，当pH>11.3时，所有氢键均不存在， DNA完全变性。
第五章 DNA的结构
一、DNA的一级结构及序列测定 二、 DNA的二级结构——双螺旋结构模型 三、 DNA的三级结构 四、DNA的变性与复性 五、 DNA的顺序组织
四、DNA的变性、复性与分子杂交 1.变性 2.复性 3.分子杂交
1.变性(denaturation)
在一定条件下，DNA双螺旋可以彻底地解链，分 离成两条互补的单链，这种现象称为DNA变性。
（3）DNA片段大小：DNA片段越大，复性越慢， 一般在实验中将DNA切成400bp大小的片段进行复 性。
（4）温度：在一定的温度范围内，温度高一些，有 利于复性，温度较低时，DNA链间少数错配碱基难 以解开再重新进行正确配对。
（5）离子强度：复性必须在有一定离子强度的溶液 内进行，以降低DNA链间由于磷酸基的负电荷造成 的斥力。常用0.15~0.5mol/L的NaCl溶液。
实践中，常利用碱处理方法来制备变性DNA以避 免在高温条件下一些磷酸二酯键断裂造成降解的变 性产物。
④变性剂：能降低Tm值
DNA变性剂
变性剂 甲醇 乙醇 甲酰胺 脲
二甲基 甲酰胺
浓度mol/L 3.5 1.2 1.9 1.0 0.6
氨基甲 酸甲酯
0.5
实际工作中常在DNA溶液中加入甲酰胺来降低Tm 值，这样不仅使DNA免受高温破坏，而且易于操作。 通常用50%甲酰胺可以使Tm降低30℃。
▪复性动力学曲线（Cot曲线）
DNA复性是一种双分子二级反应： S + S’→D 单链消失的速度可用下面公式表示：
_
dC dt
=kC2
k是缔合反应速度常数，C是时间t时单链DNA浓度，当t=0时， C=C0，表明所有的DNA都是单链， C0为DNA总浓度，时间t 时剩下的单链DNA的量可表示为：
_
以C0t的对数为横坐标以
C 或1C0
C 为纵坐标 C0
可作图得DNA C0t曲线
任何基因组或部分基因组DNA的复杂性可以通过 把它们的C0t1/2与已知复杂性的标准DNA进行比较得 知。常以E.coli DNA作为标准，它的复杂性相当于整 个基因组的长度（ E.coli基因组4.2 × 106bp，按所有 顺序均不重复计算）。这个关系式为：
DNA的复杂性成正比。基因组越复杂，任何特定 顺序的拷贝数就越少，复性越慢。
基因组的复杂性是用DNA中单一序列的长度加上 各个重复序列的长度来表示。复杂性的单位是核苷酸 对的数目。如某一基因组含序列a、b、c、d而无重复 序列，则其复杂性即为a+b+c+d。这时复杂性即与分 子量相同。高等生物的DNA ，除单一序列外，还常含 重复序列，例如，某一生物的DNA由106拷贝的a ， 103拷贝的b ，10拷贝的c ，1拷贝的d和e组成，其复杂 性为a+b+c+d+e ，这时DNA的复杂性就远远小于其分 子量。
2.复性(renaturation)
变性分离的DNA两条互补链，在适当条件下重新 缔合形成双螺旋的过程称为复性或退火。
复性是一个缓慢的过程，因为在溶液中，互补的 单链首先必须找到对方，然后以合适的取向形成碱 基对。一旦形成一个短的一段双螺旋DNA区，其余 的DNA通过紧扣机制（Zippering mechanism） 可以快速复性。核酸复性时，紫外吸收降低，由于
⑤螺旋松弛蛋白
生物体内不可能有高浓度的小分子变性 剂，而大分子物质溶解度比较小，相应限 制了它们的变性效率；然而生物体内有些 蛋白质可结合到DNA链上引发DNA变性。
T4噬菌体基因32编码一个在T4 DNA复制时必要的 DNA 结合蛋白，称为32－蛋白。这种蛋白引起DNA双 链局部解旋而促进复制的进行。
核酸复性而引起紫外吸收降低的现象，称为减色效 应。
DNA复性
2. 复 性
▪ 影响复性速度的因素 ▪ 复性动力学曲线（Cot曲线）
▪ 影响复性速度的因素
复性的最适温度：比DNA的Tm低25 ℃的温度。
（1）DNA顺序的复杂性：复杂性越高，DNA复性 速度越慢。
（2）DNA浓度：DNA浓度越大，复性越快。
(1)DNA的熔解曲线和熔解温度 由核酸变性而引起紫外吸收增加的现象，称为增色 效应。 吸收值变化对DNA溶液温度的曲线称为熔解曲线。 增色效应达到最大值的50%时的温度为熔解温度
Tm值。
DNA变性（加热或极端 pH）
(2)影响Tm的因素
①DNA的碱基组成 在SSC溶液中（0.15mol/LNaCl，0.015 mol/L柠 檬酸钠，pH 7.0），经验公式 （G+C)%=(Tm-69.3) × 2.44