核酸蛋白测定仪使用说明及问题解决

仪器名称： 核酸蛋白测定仪

使用方向： 快速、可靠地检测双链/单链DNA ，RNA ，寡核苷酸，蛋白质和细菌细胞密度/混浊度

型号： B iophotometer

生产厂家： E ppendorf

添置时间： 2006

主要性能： •氙灯光源,寿命长达10年,无需预热

•可检测吸光度范围：0.000-3.000A

•波长范围230nm,260nm,280nm,320nm,562nm,595nm 1%•光度计准确度:1A 的误差 0.5%•光度计精确度：1A 约为

•可测量核酸，蛋白质的紫外测定，lowry,bradford,BAC 比色法测定以及OD600

•储存和查看最新100个检测结果

•自我检测功能

•数据可导入到PC 机

•自动计算浓度和稀释度，可转换浓度单位

使用说明： 操作说明：

准备：开始测定前只需开启仪器背后的电源开关即可开始测定，无需预热。

一、核酸浓度测定（包括dsDNA 、ssDNA 、RNA 、Oligo ）

1. 例如待测定样品为dsDNA （eg ：PCR 产物），按下键“7 / dsDNA”

（若待测样品为ssDNA ，eg ：反转录合成的第一链cDNA 产物，则相应按下键“8 /

ssDNA ”；

若待测样品为RNA ，则按下键“9 / RNA”；

若待测样品为Oligo （寡聚核苷酸），eg ：PCR 引物，则相应按下键“6 / Oligo”。）

2. 将空白对照置入样品孔。注意：空白对照是空白液，并非所有情况都是水。（例如用

Tris 溶液溶解DNA 制品，则要用Tris 液做空白对照。）

3. 按下键“Blank”；

4. 仪器记录空白对照，设置为0.000A ；

5. 将第一个样品置入样品孔；

6. 按下“Sample”；

7. 仪器显示第一个样品的吸光度值和浓度值，以及其他相关参考比值；

8. 直接放入第二个样品；

9. 按下“Sample”；

10. 仪器显示第二个样品的吸光度值和浓度值，以及其他相关参考比值；

11. 依次测定，每个样品的测定值将自动存储在机器中，查看测定结果的方法如下：

（1）按下键“./ Function”

（2）选择“DISPLAY -RESULT”,按Enter 键，查看每个样品的测定值记录（本机可存

储100个样品的测定值）。

设定样品的稀释度

（1）按下键“Dilution”；

（2）输入样品体积和稀释液体积，按Enter键确认。

二、蛋白质浓度的直接测定（280nm测定）

1. 按下键“4 / Protein”；

2. 将空白对照置入样品孔；

3. 按下键“Blank”；

4. 仪器记录空白对照，设置为0.000A；

5. 将第一个样品置入样品孔；

6. 按下“Sample”；

7. 仪器显示第一个样品的吸光度值和浓度值，以及其他相关参考比值；

8. 依次测定，每个样品的测定值将自动存储在机器中，可查看测定结果。

三、蛋白质浓度显色法的间接测定（Bradford，Lowry，BCA）

1. 按下键“1 / Bradbord”or “2 / Lowry”or“BCA”选择蛋白质显色反应的方法；注：Bradford键按两次，每次显示不同的测定范围。

2. 设置标准曲线的标准样品数量、测定次数和浓度范围。按下键“Parameter”用上下键进行选择和参数调整。

3. 将空白对照置入样品孔；

4. 按下键“Blank”；

5. 仪器记录空白对照，设置为0.000A；

6. 将第一个标准品或样品（如需沿用已存储的标准曲线，可直接测样品）置入样品孔；

7. 按下“Sample”或“Standard”；

8. 依次测定标准品或样品，每个样品的测定值将自动存储在机器中，查看测定结果。

四、OD600 细菌生长密度测定

1. 按下键“5 /OD 600”；

2. 将空白对照置入样品孔；

3. 按下键“Blank”；

4. 仪器记录空白对照，设置为0.000A；

5. 将第一个样品置入样品孔；

6. 按下“Sample”；

7. 仪器显示第一个样品的吸光度值和浓度值；

8. 依次测定，每个样品的测定值将自动存储在机器中，查看测定结果。

注意事项：

1 为了尽量减少颗粒对测试结果的影响，要求核酸吸光值至少大于0.1A，吸光值最好在0.1－1.5A。在此范围内颗粒的干扰相对较小，结果稳定。样品的浓度不能过低或者过高。

2 混合要充分，否则吸光值太低，甚至出现负值；

3 混合液中不能有气泡，空白液无悬浮物，否则读数漂移剧烈；

4 必须使用相同的比色杯测试空白液和样品，否则测定浓度结果差异太大；

5 换算系数和样品浓度单位选择要一致；

6 不能采用窗口磨损的比色杯；

7 样品的体积必须达到比色杯要求的最小体积（50ul）；

8 通常浓度的样品可以用10 mm光程长度进行检测。对于高浓度的样品，只需将比色皿旋转90°，使用稍短的2 mm光径进行检测。

重要的比值表示样品的纯度：

1 A 260 / A 280，用于评估样品的纯度。纯净的样品，比值大于1.8（DNA）或者2.0（RNA）。如果比值低于1.8 或者2.0，表示存在蛋白质或者酚类物质的影响。

2 A230 表示样品中存在一些污染物，如碳水化合物、多肽、苯酚等，较纯净的核酸A260 / A230的比值大于2.0。

3 A320 检测溶液的混浊度和其他干扰因子，纯样品A320一般是0。

FAQ:

1.问：仪器读数漂移

答：

所有的分光光度计测定的都是吸光值或者透光值，Biophotometer以吸光值表示。然后通过系列计算因子换算成浓度。所以反映数据是否准确和仪器性能的关键指标是吸光值。当同一样品的所有吸光值在均数的正负0.5%左右浮动，属于正常。如果读数位于一个标准品的1%的误差范围内，说明测试准确。

2.问：读数出现负值，或者几次读数相差非常大

答：

• 在测试之前，需要做空白测试。空白液必须与溶解和稀释样品的液体性质一致。

• 测试之前必须充分混匀，并确保无气泡产生。

• 测试种注意比色杯方向一致，光径准确。

3.问：上述所有问题我都是正确处理，依旧出现读数不稳的现象。

答：

• 样品浓度太低，A260nm的吸光值必须>0.1 ,读数才有意义。

• 考虑样品是否刚从冰箱取出，样品在室温条件下有升温现象，会导致读数不稳定现象。• 另外，大多数客户采用水作空白，应在测试前保证水新鲜和纯净。如果水中有漂浮物，会导致读数严重漂移。

4.问:A280,A230,A260,A320各个指标的意义是什么?以及A260/230,A260/A280比值范围在多少范围内正常.

答：

• 260nm波长一般是核酸的吸收峰,A260 一般表示核酸的吸光度

• 280nm波长一般是蛋白质的吸收峰,A280 一般表示蛋白质的吸光度

• 当样品中出现悬浮物,微生物等大颗粒物质,A320的读数相对增大。纯净的样品中，320nm的吸光值是0，一般如果A320大于0.01，应该设定A320correct 功能为“ON”• 230nm的吸光值表示样品中苯酚，芳香族化合物，肽，碳水化合物等杂质的含量

• A260/A280的比值表示DNA或者RNA 样品纯度，前者一般1,8-2.0,后者一般在

2.0-2.2 的范围内，表示核酸样品比较纯。如果蛋白质污染会降低这些笔直。