第四讲 核酸、蛋白质实验技术(更新)

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核酸和蛋白质基本性质及操作注意事项

核酸和蛋白质基本性质及操作注意事项

核酸的组成
核酸 核苷酸
水 解
核苷
磷酸
戊糖
碱基


核苷酸
代表戊糖, DNA而言为脱氧核糖, 代表戊糖,对DNA而言为脱氧核糖, 戊糖 而言为脱氧核糖 RNA而言为核糖; 而言为核糖 对RNA而言为核糖; 代表碱基 代表碱基 代表磷酸基 代表磷酸基
DNA的一级结构 的一级结构
DNA的一级结构是指 的一级结构是指DNA分子中核苷酸的排 的一级结构是指 分子中核苷酸的排 从结构上来说是由脱氧核糖核苷 列顺序 ,DNA从结构上来说是由脱氧核糖核苷 从结构上来说是由 单磷酸通过 通过3', 磷酸二酯键 磷酸二酯键连接而成的高聚 单磷酸通过 ,5磷酸二酯键连接而成的高聚 从同一个磷酸基的3’酯键到 酯键到5’酯键的方向 物。从同一个磷酸基的 酯键到 酯键的方向 定为链的方向 在大多数天然DNA分子长链 链的方向。 定为链的方向。在大多数天然 分子长链 的两端,总是有一个核糖带有自由的5’磷酸 磷酸, 的两端,总是有一个核糖带有自由的 磷酸, 而另一端的核糖带有自由的3'羟基 羟基, 而另一端的核糖带有自由的 羟基,前者称为 5'端,后者称为 端。DNA链的方向就是从5' 链的方向就是从 端 后者称为3’端 链的方向就是 端到3'端 端到 端。
影响DNA复性的因素
一:温度和时间。一般认为比Tm低25℃左右的温度是复性的 温度和时间。一般认为比 低 ℃ 最佳条件, 越远离此温度,复性速度就越慢 在很低的温度(如 复性速度就越慢。 最佳条件 越远离此温度 复性速度就越慢。在很低的温度 如 4℃以下 下,则不容易发生复性。 则不容易发生复性。 ℃以下)下 则不容易发生复性 二:DNA浓度。复性的第一步是两个单链分子间的相互作用 DNA浓度。 浓度 成核” 这一过程进行的速度与DNA浓度的平方成正比。 浓度的平方成正比。 “成核”。这一过程进行的速度与 浓度的平方成正比 即溶液中DNA分子越多,相互碰撞结合“成核”的机会越大。 分子越多, 即溶液中 分子越多 相互碰撞结合“成核”的机会越大。 分子,如多聚 三:DNA顺序的复杂性。简单顺序的DNA分子 如多聚 和 DNA顺序的复杂性。简单顺序的 顺序的复杂性 分子 如多聚(A)和 多聚(U)这二种单链序列复性时 互补碱基的配对较易实现。 这二种单链序列复性时,互补碱基的配对较易实现 多聚 这二种单链序列复性时 互补碱基的配对较易实现。 四:离子强度

蛋白质检测方法 ppt课件

蛋白质检测方法 ppt课件
蛋白质检测研究进展
Contents
1、蛋白质简介 2、蛋白质的检测方法 3、蛋白质与疾病的关系
精品资料
• 你怎么称呼老师? • 如果老师最后没有总结一节课的重点的难点,你
是否会认为老师的教学方法需要改进? • 你所经历的课堂,是讲座式还是讨论式? • 教师的教鞭
• “不怕太阳晒,也不怕那风雨狂,只怕先生骂我 笨,没有学问无颜见爹娘 ……”
✓ 优点:准确性高,灵敏度高,与传统的生物学技术手 段相比, 基于质谱的蛋白质组学技术更适合于临床疾病 的研究
✓ 缺点:技术发展不够完善
毛细管凝胶电泳法
✓ 原理:电泳也称作电迁移,是指溶液中带电粒子在电场中 所发生的迁移运动,运动的迁移率与组分分子的大小、极性、 亲和能力、等电点、相分配系数以及所带电荷的多少等多个 因素有关。毛细管电泳又称为毛细管电分离,是以毛细管为 分离通道、以高压直流电场为驱动力、根据带电粒子迁移率 的不同来实现组分分,小鸟说早早早……”
蛋白质简介
蛋白质是由氨基酸脱水缩合形成的空间结构复杂的大分子有机物,其 主要化学元素为 C(约 50%)、O(约23%)、N(约16%)、H(约 7%)、S(约 0~3%)。氨基酸是蛋白质的基本组成单位,蛋白质既具 有氨基酸的部分理化特性,也具有其它有机物的一些共性以及众多的 自身独有特点与性质: 高分子、两性解离及等电点、水合作用、变性作用、显色反应(双缩 脲反应、Folin-酚反应、茚三酮反应、米伦反应、黄蛋白反应、乙醛酸 反应、坂口反应、偶氮反应、考马斯亮蓝反应、氨基酸的α-氨基及α羧基反应、) 蛋白质的异常表达与体内多种疾病的发生发展息息相关
曙红Y
铬天青S
溴酚蓝 Evans blue
四羧基苯基卟啉
偶氮染料

蛋白质和核酸化学PPT课件.ppt

蛋白质和核酸化学PPT课件.ppt
试问100g大豆中含蛋白质多少克?
▪ 2. 用凯氏微量定氮法测得0.2ml血清中含
氮2.1mg,问100ml血清中含蛋白质多少克?
二、蛋白质的基本单位—氨基酸
▪ 氨基酸是蛋白质的基本组成单位。 ▪ 20标准氨基酸 ▪ 氨基(-NH2)和羧基(-COOH)
COOH H2N—Cα—H
R
不带电形式
COO+H3N—Cα—H
2.空间结构与功能的关系
▪ 蛋白质的空间
结构一旦改变 就会影响蛋白 质的生物活性。
▪ (如右图)牛
核糖核酸酶的 空间结构与功 能。
•牛脑海绵状病,简称BSE。1985年4月,医学家 们在英国发现了一种新病,专家们对这一世界 始发病例进行组织病理学检查,并于1986年11 月将该病定名为BSE,首次在英国报刊上报道。 •食用被疯牛病污染了的牛肉、牛脊髓的人,有 可能染上致命的克罗伊茨费尔德—雅各布氏症 (简称克-雅氏症),其典型临床症状为出现 痴呆或神经错乱,视觉模糊,平衡障碍,肌肉 收缩等。病人最终因精神错乱而死亡。 医学 界对克-雅氏症的发病机理还没有定论,也未 找到有效的治疗方法。
(1)
(2)
(二)
一级结构是空间结构的基础。结构与功能密切相关,蛋白质的一级 结构一旦确立,其空间结构以及生理功能也基本确立。
四、蛋白质的空间结构
▪ 多肽链需通过各种方式卷曲成特定的空间
结构。蛋白质肽链通过折叠、盘曲,使分 子内部原子形成一定的空间排布及相互关 系,称为蛋白质的构象,即空间结构。
(2)分子病
——蛋白质分子一级结构的氨基酸排列顺序与 正常有所不同的遗传病。
镰状细胞贫血(sick-cell anemia) 从患者红细胞中鉴定出特异的镰刀型或月牙型细胞。

生物化学第四章 核酸化学知识点归纳

生物化学第四章 核酸化学知识点归纳

生物化学第四章核酸化学核酸是生物体内的重要生物大分子;核酸不仅与正常的生命活动如生长繁殖等有着密切关系,而且与生命的异常活动如人体肿瘤发生、辐射损伤等也息息相关。

核酸的研究是分子生物学的重要领域。

一、核酸的概述二、核酸的化学组成目录三、核酸的分子结构四、核酸及核苷酸的性质五、核酸的分离提取和纯化一、核酸的发展史二、核酸的分类和分布三、核酸的生物学功能概述I一、核酸的发展史●1869 年,瑞士生物学家Miescher首先从外科手术绷带上脓细胞的细胞核中分离出白色微酸性的含磷有机物质-称为核质(nuclein)。

Miescher ●1889年,Altmann 制备了不含蛋白的核酸制品,提出核酸(nucleic acid);了肺炎双球菌的转化现象肺炎双球菌肺炎双球菌(Diplococcus pneumoniae)是一种病原菌,存在着光滑型(Smooth简称S型)和粗糙型(Rough简称R型)两种不同类型。

肺炎双球菌的种类S型肺炎双球菌R型肺炎双球菌菌落(肉眼观察)菌落光滑菌落粗糙菌体(显微镜观察)有多糖类荚膜无多糖类荚膜毒性(动物实验)有毒无毒致病情况使人患肺炎,使老鼠患败血症死亡不使人和老鼠患病实验证实:SⅢ型死菌体内有转化因子能引起RⅡ型活菌转化产生SⅢ型活菌,这种转化因子是遗传物质。

1944年,美国的O.Avery、C. Macleod及M.Mccarty等人在Griffith工作的基础上,利用体外转化实验对肺炎双球菌的转化本质进行了深入的研究。

实验:从SⅢ型活菌体内提取DNA、蛋白质和荚膜多糖,将它们分别和RⅡ型活菌混合均匀后,注射入小白鼠体内。

结果:只有注射SⅢ型菌DNA和RⅡ型活菌的混合液的小白鼠才死亡O.Avery实验证实:DNA是遗传物质光滑型细胞(有毒)粗糙型细胞(无毒)破碎细胞DNAase降解后的DNA 粗糙型细胞接受光滑型DNA只有粗糙型SS R RR DNA +1952年,Hershey和Chase的T2噬菌体的感染实验。

核酸与蛋白质的生物合成

核酸与蛋白质的生物合成
RNA引物的大小,在原核生物中通常为50~100个核苷酸,而在真核生物中约为10个核苷酸。RNA引物的碱基顺序,与其模板DNA的碱基顺序相配对。
3、需要引物primer
4、双向复制与复制叉
DNA复制时,局部双链解开形成两条单链,这种叉状结构称为复制叉。
DNA复制时,以复制起始点为中心,向两个方向进行复制。但在低等生物中,也可进行单向复制(如滚环复制)。
02
中心法则
反中心法则
在RNA病毒中,其遗传信息贮存在RNA分子中。因此,在这些生物体中,遗传信息的流向是RNA通过复制,将遗传信息由亲代传递给子代,通过反转录将遗传信息传递给DNA,再由DNA通过转录和翻译传递给蛋白质,这种遗传信息的流向就称为反中心法则。
第一节 DNA的复制与修复 一、DNA复制的特点 1、半保留复制 DNA在复制时,以亲代DNA的每一股作模板,合成完全相同的两个双链子代DNA,每个子代DNA中都含有一股亲代DNA链,这种现象称为DNA的半保留复制(semi-conservative replication)。
02
真核生物DNA聚合酶
2)DNA复制的保真性
为了保证遗传的稳定,DNA的复制必须具有高保真性。DNA复制时的保真性主要与下列因素有关: 遵守严格的碱基配对规律; DNA聚合酶在复制时对碱基的正确选择; 对复制过程中出现的错误及时进行校正。
5、DNA连接酶ligase
DNA连接酶(DNA ligase)可催化两段DNA片段之间磷酸二酯键的形成,从而使两段DNA连接起来。 DNA连接酶催化的条件是: 需一段DNA片段具有3‘-OH,而另一段DNA片段具有5’-Pi基; 未封闭的切口位于双链DNA中,即其中有一条链是完整的,但T4 DNA连接酶能连接平头双链DNA; 需要消耗能量,在原核生物中由NAD+供能,在真核生物中由ATP供能。

【医学PPT课件】生物大分子(蛋白质、核酸和酶)的结构与功能

【医学PPT课件】生物大分子(蛋白质、核酸和酶)的结构与功能
或酶中的巯基免受氧化。 (2)分解H2O2。 (3)解毒功能:巯基的亲核性可与外源性亲
电子毒物如致癌剂或药物结合。
目录
2. 多肽类激素及神经肽
• 体内许多激素属寡肽或多肽
• 神经肽(neuropeptide)
目录
三、蛋白质的分类
* 根据蛋白质组成成分 单纯蛋白质 结合蛋白质 = 蛋白质部分 + 非蛋白质部分
目录
3.相邻肽平面构成二面角:
一个碳原子相连的两个肽平面,由于N1 -C 和C -C2两个键为单键,肽平面可 别围绕这两个键旋转,从而构成不同的构象。
目录
蛋白质二级结构的主要形式
• -螺旋 ( -helix ) • -折叠 ( -pleated sheet ) • -转角 ( -turn ) • 无规卷曲 ( random coil )
是指蛋白质分子中某一段肽链的局部空间 结构,即该段肽链主链骨架原子的相对空 间位置,并不涉及氨基酸残基侧链的构象 。
主要的化学键: 氢键
目录
(一)肽单元(peptide unit)
肽单元又称为肽 单位,是多肽链中从 一个α碳原子到相邻 α碳原子之间的结构, 由Linus Pauling和 Robert Corey于20 世纪 30年代末确定。
3. 氧化供能
目录
第一节 蛋白质的分子组成
The Molecular Component of Protein
目录
组成蛋白质的元素
主要有C、H、O、N和S。 有些蛋白质含有少量磷或金属元素铁、 铜、锌、锰、钴、钼,个别蛋白质还含有碘 。
目录
蛋白质元素组成的特点
各种蛋白质的含氮量很接近,平均为16%。 体内的含氮物质以蛋白质为主,故测定生物 样品中的含氮量,可根据以下公式推算蛋白质的 大致含量:

核酸与蛋白质的知识点总结

核酸与蛋白质的知识点总结

核酸与蛋白质的知识点总结1.核酸的结构和功能核酸是由核苷酸(包括脱氧核苷酸和核苷酸)组成的生物大分子,主要由磷酸基、五碳糖和氮碱基组成。

核酸主要有两种类型:DNA(脱氧核糖核酸)和RNA(核糖核酸)。

DNA是细胞内的遗传物质,负责储存遗传信息和传递信息。

RNA参与了蛋白质的合成和调控等生理生化过程。

核酸的功能主要有以下几个方面:(1) 储存遗传信息:DNA是生物体内重要的遗传物质,它储存了生物体遗传信息的基因序列,对生物体的遗传特征起着决定性的作用。

(2) DNA复制:在细胞分裂过程中,需要通过DNA复制来保证子细胞遗传信息的完整传递。

(3) 转录和翻译:在蛋白质合成过程中,RNA通过转录将DNA上的信息转录成RNA,再通过翻译将RNA上的信息转译成蛋白质,从而参与了蛋白质的合成。

(4) 调控基因表达:核酸参与了生物体内基因的表达和调控,对于生物体的发育、生长、代谢等过程起着重要的作用。

2.蛋白质的结构和功能蛋白质是生物体内重要的大分子,是生物体内最具功能性的分子之一,起着重要的生理生化作用。

蛋白质是由氨基酸通过肽键连接而成的,根据氨基酸的序列和空间结构的不同,蛋白质具有多种类型,如结构蛋白、酶、激素、抗体等。

蛋白质的功能主要有以下几个方面:(1) 结构功能:蛋白质是细胞内的重要结构物质,如胞内骨架蛋白、肌纤维蛋白等,起着细胞支持和形态维持的作用。

(2) 酶催化作用:大部分酶都是蛋白质,通过酶的催化作用参与了细胞内的代谢过程,加速了生物化学反应的进行。

(3) 信号传导:许多激素、受体和信号转导蛋白都是蛋白质,它们参与了细胞信号传导的过程,调控了细胞内的生理过程。

(4) 运输功能:血红蛋白是一种运输氧气的蛋白质,它通过结合氧气和释放氧气参与了氧气的输送。

(5) 免疫功能:抗体是一种免疫球蛋白,它能够识别和结合外源抗原,起着免疫防御作用。

3.核酸与蛋白质的相互关系核酸和蛋白质是细胞内重要的生物分子,它们之间存在着相互关系。

蛋白质与核酸

蛋白质与核酸

研究意义
揭示生命本质
蛋白质和核酸是构成生物体的基 本物质,研究它们有助于深入了 解生命的本质和生物体的代谢过
程。
疾病诊断和治疗
蛋白质和核酸的异常表达与许多 疾病的发生和发展密切相关。通 过研究,可以发现新的疾病标志 物和药物靶点,有助于疾病的早
期诊断和治疗。
生物技术应用
蛋白质和核酸的研究对于生物技 术的进步具有重要意义,如基因 工程、蛋白质工程和酶工程等领
学键。
一级结构
03
指蛋白质中氨基酸的排列顺序,决定蛋白质的生物活性和功能。
蛋白质的构
二级结构
肽链局部的折叠和转角,主要由氢键维持。
三级结构
整条肽链的折叠和盘绕,形成特定的空间构象,主要由疏水键和 盐键维持。
四级结构
多个蛋白质分子聚集在一起形成的复合物,决定蛋白质的生物学 功能。
蛋白质的功能
结构蛋白
03 蛋白质与核酸的比较
组成上的比较
总结词
蛋白质和核酸在组成上存在显著差异。
详细描述
蛋白质是由氨基酸组成的,而核酸是由核苷酸组成的。氨基酸的种类有20种左 右,而核苷酸有四种,分别是腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶和胸腺嘧啶。
结构上的比较
总结词
蛋白质和核酸在结构上也有所不同。
详细描述
蛋白质的结构可以分为一级、二级、三级和四级结构。一级结构是指蛋白质中氨 基酸的排列顺序,决定了蛋白质的生物活性和功能。而核酸的一级结构是指核苷 酸的排列顺序,决定了核酸的信息储存和表达功能。
域的应用。
应用领域
医学领域
农业领域
蛋白质和核酸的研究在医学领域的应用广 泛,如诊断试剂、药物研发和个性化医疗 等方面。
蛋白质和核酸的研究有助于培育抗逆、抗 病和高产的农作物新品种,提高农业生产 效益。

人教版化学选修五4.3《蛋白质 核酸》课件 (共59张ppt)

人教版化学选修五4.3《蛋白质 核酸》课件 (共59张ppt)

⑥颜色反应
1.用试管取 2mL鸡蛋白溶 液;
2.滴加几滴 浓硝酸,微热
实验结果报告
鸡蛋白溶液遇浓硝酸加热颜色变黄。 含有苯基的蛋白质均能发生别蛋白质。
颜(显)色反应与焰色反应
颜(显)色反应: 一般指有明显颜色变化的化学反应。 如:Fe3+(aq)与苯酚或SCN-(aq);
3、核酸的重要功能
(1) DNA是主要遗传物质,是遗传信息 的载体,蛋白质的合成的模板,指挥着蛋 白质的合成、细胞的分裂和制造。
(2) RNA根据DNA提供的信息,参与蛋 白质的合成。
【练习】
1、下列过程中,不可逆的是( C )
A.蛋白质的盐析 B.酯的水解
C.蛋白质白变性 D.氯化铁的水解
2、欲将蛋白质从水中析出而又不改变它的
蛋白质
各种生物酶 均是蛋白质
动物的皮 革是衣服 的原料
驴皮熬制的 胶是一种药 材——阿胶
牛奶中的蛋 白质与甲醛 制酪素塑料
归纳蛋白质的性质:
1. 水溶性:有些可溶,有些难溶。
2. 水解:水解生成氨基酸。
3. 盐析:
O
4. 变性
CH2 C N CH2
5. 颜色反应 NH2
H
6. 灼烧产生烧焦羽毛的气味
小结:
1、氨基酸的结构特点: 含有-NH2 及-COOH
2、氨基酸的性质: (1)具有两性:碱性和酸性 (2)成肽(缩合)反应
二、蛋白质的结构与性质
1、组成: 蛋白质是由C、H、O、N、
S 等元素构成的氨基酸分子通过 肽键结合成相对分子质量很大 (几万到几千万)的有机高分子 化合物。
人体内所具有的蛋白质种类达到了10 万种以上。
铜、汞、铅等重金属盐类、 醛、浓乙醇、丙酮等有机物; 物理:加热、剧烈震荡或搅拌、紫外线、 X射线、超声波等。

第四讲蛋白质的化学修饰(共94张PPT)

第四讲蛋白质的化学修饰(共94张PPT)

二、确定修饰程度和修饰部位
通过对被修饰蛋白质的降解和氨基酸分析后鉴定修饰部 位。
通过纯化被修饰蛋白质的氨基酸及其衍生物,测定其同位素标 记量或光谱强度或顺磁共振谱或荧光标记量等来确定反应程度 。
一般认为:测定被修饰的氨基酸,要比测定氨基酸的减少 量更准确。
三、化学修饰数据的分析
⒈化学修饰的时间进程曲线 以修饰时间对蛋白质活性作图
蛋白质构象改变会导致微区极性的局部改变,这 种改变对
Trp,Met和Cys的反应性影响最小; 对氨基和咪唑基的反应性影响较大; 而对Tyr,Hcys和COOH的反应性影响最大
。此外,极性的变化也影响到反应类型。
⑵氢键效应
氢键对维持天然蛋白质及其离子稳定性有重要影响, 氢键的变化也可能导致pK发生改变。
S er O H
O H O C C H 2 C H 2
N O 2
⑸局部环境的极性
溶剂极性可能与反应速度有关,如下表:
反应类型
降低极性对速度的影响
⒈RSR+ICH2CONH2
[R2S+CH2CONH2]I- 适当或大大降低
⒉RSR+H2O2
R2SO+H2O
没有影响
⒊RS-+ ICH2CONH2
⒈试剂选择
不同实验,对修饰的专一性要求也不同,因此选择试剂在很大程 度上要依赖修饰目的。
例如,对氨基的修饰,仅修饰氨基;仅修饰α-氨基;修饰暴露的 或反应性高的氨基。
一般通过选择试剂和反应条件来控制修饰的部位和程度
•如果希望改变蛋白质的带电状态或溶解性,应该选择能引入最大
电荷量的试剂。
•例如用顺丁烯二酸酐可将中性的巯基和酸性条件下带正电荷的氨基转变成

核酸-蛋白质互作的生物化学研究方法

核酸-蛋白质互作的生物化学研究方法

核酸-蛋白质互作的生物化学研究方法
核酸-蛋白质互作是生物学中一个重要的研究领域,它涉及到核酸和蛋白质之间的相互作用,以及它们在生物体中的功能。

研究这种相互作用的生物化学方法有很多,其中最常用的是蛋白质结构分析、核酸结合实验、蛋白质-核酸相互作用实验和蛋白质-核酸相互作用的分子模拟。

蛋白质结构分析是研究核酸-蛋白质互作的重要方法,它可以帮助我们了解蛋白质的结构和功能,以及它们与核酸之间的相互作用。

通常,蛋白质结构分析可以通过X射线衍射、核磁共振成像和计算机模拟等技术来实现。

核酸结合实验是另一种研究核酸-蛋白质互作的重要方法,它可以帮助我们了解核酸与蛋白质之间的相互作用。

通常,核酸结合实验可以通过紫外光谱、荧光光谱和电泳等技术来实现。

蛋白质-核酸相互作用实验是研究核酸-蛋白质互作的重要方法,它可以帮助我们了解蛋白质与核酸之间的相互作用。

通常,蛋白质-核酸相互作用实验可以通过紫外光谱、荧光光谱、电泳和质谱等技术来实现。

最后,蛋白质-核酸相互作用的分子模拟是研究核酸-蛋白质互作的重要方法,它可以帮助我们了解蛋白质与核酸之间的相互作用。

通常,蛋白质-核酸相互作用的分子模拟可以通过分子动力学模拟、分子对接和分子模拟等技术来实现。

总之,蛋白质结构分析、核酸结合实验、蛋白质-核酸相互作用实验和蛋白质-核酸相互作用的分子模拟是研究核酸-蛋白质互作的重要生物化学方法。

这些方法可以帮助我们了解核酸和蛋白质之间的相互作用,以及它们在生物体中的功能。

蛋白质和核酸、蛋白质和蛋白质相互作用的方法介绍

蛋白质和核酸、蛋白质和蛋白质相互作用的方法介绍

蛋白质和核酸、蛋白质和蛋白质相互作用的方法介绍蛋白质和核酸、蛋白质和蛋白质相互作用的方法介绍蛋白质和核酸是组成生命的主要生物大分子,研究蛋白质和核酸的相互作用、蛋白质和蛋白质的相互作用是后基因组时代重要的研究领域之一。

目前,研究蛋白质和核酸、蛋白质和蛋白质相互作用的方法很多,今天,小编帮您来梳理下。

一、凝胶电泳迁移率(EMSA)凝胶迁移或电泳迁移率检测(Electrophoretic Mobility Shift Assay,EMSA)是一种检测蛋白质和DNA序列相互结合的技术,可用于定性和定量分析。

目前已用于研究RNA结合蛋白和特定的RNA 序列的相互作用,是转录因子研究的经典方法。

EMSA可检测DNA结合蛋白、RNA结合蛋白、特定的蛋白质,并可进行未知蛋白的鉴定。

二、染色质免疫沉淀(ChIP)染色质免疫沉淀技术(Chromatin immunoprecipitation assay, ChIP)是将样品中同抗体靶蛋白相互作用的DNA随免疫复合物沉淀,是研究体内蛋白质与DNA相互作用的有力工具,利用该技术不仅可以检测体内反式因子与DNA的动态作用,还可以用来研究组蛋白的各种共价修饰以及转录因子与基因表达的关系。

三、RNA Pull Down / DNA Pull Down蛋白质与RNA的相互作用是许多细胞功能的核心,如蛋白质合成、mRNA组装、病毒复制、细胞发育调控等。

RNA Pull Down使用体外转录法标记生物素RNA探针,然后与胞浆蛋白提取液孵育,形成RNA-蛋白质复合物。

该复合物可与链霉亲和素标记的磁珠结合,从而与孵育液中的其他成分分离。

复合物洗脱后,通过western blot实验检测特定的RNA结合蛋白是否与RNA相互作用。

四、RIPRIP 技术(RNA Binding Protein Immunoprecipitation Assay,RNA 结合蛋白免疫沉淀)主要是运用针对目标蛋白的抗体把相应的RNA-蛋白复合物沉淀下来,经过分离纯化就可以对结合在复合物上的RNA 进行q-PCR验证或者测序分析。

核酸蛋白质的免疫共沉淀

核酸蛋白质的免疫共沉淀

核酸蛋白质的免疫共沉淀
核酸蛋白质的免疫共沉淀
免疫共沉淀是一种常用的实验技术,用于研究蛋白质与核酸之间的相互作用。

通过利用特异性抗体,可以将特定的蛋白质-核酸复合物沉淀下来,以便进一步分析其结构和功能。

以下是核酸蛋白质免疫共沉淀的基本原理和步骤:
1. 抗体选择:根据研究目的选择能够与目标蛋白质特异结合的抗体。

这些抗体通常是经过充分验证的,确保其高度特异性和亲和力。

2. 样品准备:将待研究的生物样品(如细胞提取物或组织溶液)进行预处理,以确保目标蛋白质和核酸的稳定性和完整性。

3. 免疫共沉淀反应:将抗体与样品中的目标蛋白质结合,形成抗体-蛋白质复合物。

这个过程通常在低温环境下进行,并可以通过交联剂等手段增强复合物的稳定性。

4. 共沉淀:将复合物与磁珠或琼脂糖糖珠等亲和基质结合,使复合
物以沉淀形式分离出来。

这些亲和基质通常具有与抗体Fc区域相互作用的亲和分子。

5. 洗脱和分析:通过洗脱步骤去除非特异性和背景物质,并收集纯化的复合物。

纯化的复合物可以进一步用于不同的分析技术,如免疫印迹、质谱分析或核酸测序等。

核酸蛋白质免疫共沉淀是一种有力的实验方法,可用于研究核酸与特定蛋白质的相互作用,从而深入了解其在细胞中的功能和调控机制。

正确的实验设计和严格的实验操作能够确保结果的可靠性和准确性,进一步促进科学研究的进展。

蛋白质与核酸的定性与定量实验方法资料

蛋白质与核酸的定性与定量实验方法资料

蛋白质与核酸的定性与定量一、实验目的1、学习和掌握纯化蛋白质的原理和方法、蛋白质等电点的测量原理和方法。

2、进一步掌握使用双缩脲法对蛋白质的定性测定、利用定糖法对核酸的定性与定量测定二、实验原理1、蛋白质的定性测定:双缩脲法,课本P992、蛋白质的定量测定:Folin-酚法,实验P193、核酸的定性与定量测定:定糖法,课本P131、4、蛋白质等电点的测量在IEF的电泳中,具有pH梯度的介质其分布是从阳极到阴极,pH值逐渐增大。

如前所述,蛋白质分子具有两性解离及等电点的特征,这样在碱性区域蛋白质分子带负电荷向阳极移动,直至某一pH位点时失去电荷而停止移动,此处介质的pH恰好等于聚焦蛋白质分子的等电点(pl)。

同理,位于酸性区域的蛋白质分子带正电荷向阴极移动,直到它们的等电点上聚焦为止。

可见在该方法中,等电点是蛋白质组分的特性量度,将等电点不同的蛋白质混合物加入有pH梯度的凝胶介质中,在电场内经过一定时间后,各组分将分别聚焦在各自等电点相应的pH位置上,形成分离的蛋白质区带pH梯度的组成pH梯度的组成方式有二种,一种是人工pH梯度,由于其不稳定,重复性差,现已不再使用。

另一种是天然pH梯度。

天然pH梯度的建立是在水平板或电泳管正负极间引入等电点彼此接近的一系列两性电解质的混合物,在正极端吸入酸液,如硫酸、磷酸或醋酸等,在负极端引入碱液,如氢氧化钠、氨水等。

电泳开始前两性电解质的混合物pH为一均值,即各段介质中的pH 相等,用pH0表示。

电泳开始后,混合物中pH最低的分子,带负电荷最多,pI1为其等电点,向正极移动速度最快,当移动到正极附近的酸液界面时,pH突然下降,甚至接近或稍低于PI1,这一分子不再向前移动而停留在此区域内。

由于两性电解质具有一定的缓冲能力,使其周围一定的区域内介质的pH保持在它的等电点范围。

pH稍高的第二种两性电解质,其等电点为pI2,也移向正极,由于pI2>pI1,因此定位于第一种两性电解质之后,这样,经过一定时间后,具有不同等电点的两性电解质按各自的等电点依次排列,形成了从正极到负极等电点递增,由低到高的线性pH梯度。

蛋白质核酸沉淀分离技术课件.ppt

蛋白质核酸沉淀分离技术课件.ppt
浓度。
加入硫酸铵固体的量:查表、计算
查表时 注意温

蛋白质核酸沉淀分离技术课件
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(1)加入固体盐法
20℃ 25℃
g :加入固体硫酸铵的质量 S2:所需达到的硫酸铵饱和度 S1:原溶液的硫酸铵饱和度
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(2)加入饱和溶液法
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(1)适用于疏水性强的蛋白质 (2)中性盐浓度增大时,等电点向偏酸方向移动,
分子都是可以被极化的,所以它是普遍存在的。
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§3.4 蛋白质沉淀方法
中性盐盐析法
等电点沉淀法
有机溶剂沉淀法
非离子型聚合物沉淀法
聚电解质沉淀法
金属沉淀法
其他沉淀法
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一、中性盐沉淀法(盐析法)
盐析:在溶液中加入中性盐使生物大分子沉淀析出的过程 。
优点 ①成本低,不需要特别昂贵的设备
或离心; 4)加入硫酸铵时应注意搅拌,避免局部过浓; 5)硫酸铵使用前须用H2S处理,高浓度的硫酸铵溶液使用
前需用氨水或硫酸调节至所需pH。
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二、等电点沉淀法 蛋白质等电点沉淀法是基于不同蛋白
质离子具有不同等电点这一特性,依次改 变溶液pH值的办法,将杂蛋白沉淀除去, 最后获得目标产物。
硫酸铵饱和度%
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方法二
各级均离心分离沉淀物,将沉淀溶于2倍体积的缓冲液中,测 定其中总蛋白和目标蛋白浓度
以饱和度为横坐标,总蛋白和目标蛋白浓度为纵坐标,得到蛋 白质溶解度曲线
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1.3.3细胞中的蛋白质和核酸教案2023-2024学年高一上学期生物苏教版必修1

1.3.3细胞中的蛋白质和核酸教案2023-2024学年高一上学期生物苏教版必修1
二、新课讲授(用时10分钟)
1.理论介绍:首先,我们要了解蛋白质和核酸的基本概念。蛋白质是由氨基酸组成的生物大分子,它在生命活动中起着至关重要的作用,如催化、运输、结构支撑等。核酸是携带遗传信息的生物大分子,包括DNA和RNA,它决定了生物体的遗传特征。
2.案例分析:接下来,我们来看一个具体的案例。这个案例展示了蛋白质在免疫反应中的作用,以及核酸在基因检测中的应用。
3.成果分享:每个小组将选择一名代表来分享他们的讨论成果。这些成果将被记录在黑板上或投影仪上,以便全班都能看到。
五、总结回顾(用时5分钟)
内容:今天的学习,我们了解了蛋白质和核酸的基本概念、重要性和应用。同时,我们也通过实践活动和小组讨论加深了对蛋白质和核酸的理解。我希望大家能够掌握这些知识点,并在日常生活中灵活运用。最后,如果有任何疑问或不明白的地方,请随时向我提问。
最后,我在总结回顾时,是否强调了蛋白质和核酸在生命活动中的重要作用?通过观察学生的反应和提问,我可以评估他们对这些知识点的掌握程度。如果我发现学生在这些知识点上存在不足,我可能需要在未来的教学中进行更多的强调和复习。
通过这些改进措施,我相信我可以在未来的教学中更好地帮助学生理解和掌握蛋白质和核酸的知识,提高他们的实践能力和创新能力。
再次,我在进行实践活动时,是否提供了足够的指导和支持?通过观察学生的实验操作和讨论成果,我可以评估他们的实践能力是否得到了提高。如果我发现学生在实验操作中存在困难,我可能需要在实验前提供更多的讲解和示范。
此外,我在组织学生进行小组讨论时,是否提供了有效的引导和启发?通过倾听学生的讨论和分享,我可以评估他们的思考和沟通能力是否得到了提升。如果我发现学生在讨论中存在问题,我可能需要提供更多的开放性问题来激发他们的思考。

蛋白质及核酸的含量测定方法

蛋白质及核酸的含量测定方法

仪器及试剂
1.实验器材 离心机, 离心管,紫外分光光度计; 2.实验试剂 (1)钼酸氨—高氯酸试剂(沉淀剂):如配 制200ml,可在193ml蒸馏水中加入 7ml高氯酸和0.5g钼酸氨。用的方法有凯氏定氮法、双 缩脲法(Biuret)、紫外吸收法、考马斯 亮蓝法(Bradford)。
凯氏定氮法_原理
蛋白质是含氮的化合物。食品与浓 硫酸和催化剂共同加热消化,使蛋白 质分解,产生的氨与硫酸结合生成硫 酸铵,留在消化液中,然后加碱蒸馏 使氨游离,用硼酸吸收后,再用盐酸 标准溶液滴定,根据酸的消耗量来乘 以蛋白质换算系数,即得蛋白质含量。 因为食品中除蛋白质外,还含有其 它含氮物质,所以此蛋白质称为粗蛋 白。
三、仪器与试剂
(一)试剂 1、硫酸铜(CuSO4· 5H20) 2、硫酸钾 3、硫酸(密度为1.8419g/L) 4、硼酸溶液(20g/L) 5、氢氧化钠溶液(400g/L) 6、0.01mol/L盐酸标准滴 定溶液。 7、混合指示试剂:0.1%甲 基红乙溶液液1份,与0.1% 溴甲酚绿乙醇溶液5份临用 时混合。
【实验原理】
核酸、核苷酸及其衍生物都具有共轭 双键系统,能吸收紫外光,RNA和 DNA的紫外吸收峰在260nm波长处。 一般在260nm波长下,每1ml含1µg RNA溶液的光吸收值为0.022~0.024, 每1m1含1µg DNA溶液的光吸收值约 为0.020,故测定未知浓度RNA或DNA 溶液在260nm的光吸收值即可计算出 其中核酸的含量。
反应机理
(二)仪器 微量定氮蒸馏装置:如图所 示。 1、电炉; 2、水蒸气发生 器(2L平底烧瓶);3、螺 旋夹a; 4、小漏斗及棒状玻璃 塞(样品入口处);5、反 应室;6、反应室外层; 7、橡皮管及螺旋夹b; 8、冷凝管;9、蒸馏液接 收瓶。

核酸与蛋白质的研究方法

核酸与蛋白质的研究方法

PCR指数扩增时循环次数与DNA产物数量的比较。
主要步骤:
将含有待扩增DNA样品的反应混合 物放置在高温(>94℃)环境下加热 1分钟,使双链DNA变性,形成单链 模板DNA。
然后降低反应温度(约50℃), 致冷1分钟,使寡核苷酸引物与两 条单链模板DNA发生退火作用并结 合在靶DNA区段两端的互补序列位 置上。
转化(transformation) 特指以质粒DNA或以它为载体构建的重
组子导入细菌的过程。
转染 (transfection) 是指噬菌体、病毒或以它作为载体构成
的重组子导入细胞的过程。
转导 (transduction) 以噬菌体为媒介,将外源DNA导入细菌
的过程。 上述概念往往容于容易 吸收外源DNA状态叫感受态,用理化方法诱导细 胞进入感受态的操作叫致敏过程。
重组DNA技术史上的主要事件
年份
事件
1869
F Miescher首次从莱茵河鲑鱼精子中分离DNA。
1957
A.Kornberg从大肠杆菌中发现了DNA聚合酶I。
19591960 1961
1964
1965
Ochoa发现RNA聚合酶和信使RNA,并证明mRNA决 定了蛋白质分子中的氨基酸序列。
Nirenberg破译了第一个遗传密码;Jacob和Monod提 出了调节基因表达的操纵子模型。
重组DNA技术回顾
三大成就:
第一,在20世纪40年代确定了遗传信息的携 带者、即基因的分子载体是DNA而不是蛋白 质——解决了遗传的物质基础问题;
第二,50年代提出了DNA分子的双螺旋结构 模型和半保留复制机制——解决了基因的自 我复制和世代交替问题;
第三,50年代末至60年代,相继提出了 “中心法则”和操纵子学说,成功地破译 了遗传密码——阐明了遗传信息的流动 与表达机制。
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(1)原位杂交技术
原位杂交(in situ hybridization, ISH)是将 分子杂交和组织细胞化 学结合而产生的一种实 验手段。细胞中的DNA 或RNA与互补顺序的探 针(probe)结合,通过 探针上的标记物显示其 在组织细胞中的位置分 布。 常用探针标记物:同位 素、荧光素、生物素、 地高辛及酶类。
四、核酸的分析方法
主要内容: 1. 分子杂交(molecular hybridization)技术 2. 聚合酶链式反应(PCR)
3. RT-PCR技术
1. 分子杂交技术
具有互补核苷酸序列的两条 单链核苷酸分子片段,在适 当条件下,通过氢键结合, 形成DNA-DNA,DNA-RNA 或RNA-RNA杂交的双链分子。 这种技术可用来测定单链分 子核苷酸序列间是否具有互 补关系。 常用的技术: 1. 原位杂交 2. Southern blot 3. North blot
定量PCR实验中需要考虑的问题: 1. 溶解曲线:验证有无非特异性扩增,优化引物的退火温度; 2. 扩增效率:标准曲线的斜率2.8~3.5间可以接受,3.3时扩增效率是 100%; 3. 定量的方法可以分为绝对定量和相对定量两大类。绝对定量应用 于病毒、病原菌定量检测,转基因拷贝数分解等领域,相对定量主要 应用于mRNA表达量解析。
6. 核酸、蛋白质相互作
用的分析方法
一、RNA的提取
细胞中的RNA有rRNA(80~85%)、mRNA(1~5%)、tRNA和 小分子RNA(10~15%)组成。其中mRNA和小分子RNA是分子 生物学主要的研究对象。
样 品 来 源
28S 18S 5S
Trizol法或试剂盒提取 总RNA
A260 nm / A280 nm =1.8~2.0可接受
3. 流式细胞术
用荧光标记的抗体标记细胞表面或内部的蛋白质,流式细胞 仪可检测到荧光标记阳性细胞在细胞总体当中所占的比例。 Flow cytometer tells the percentage of positive/negtive cells.
4. 酶联免疫吸附 (ELISA)
酶联免疫吸附 (enzyme-linked immunosorbent assay ,ELISA) 过程包括抗体吸附在固相载体上称为包被,加待测抗原,再加 相应酶标记抗体,生成抗体-抗原-酶标记抗体的复合物,再与 该酶的底物反应生成有色产物。借助光吸收计算抗原的量。待 测抗原的定量与有色产生成正比。
间接标记法
2. Western blot
Western blot是将
蛋白质样品通过聚 丙烯酰胺电泳 (SDS-PAGE)按分子 量大小分离,再转 显影 visualization 电泳 electrophoresis 转膜 transfer
抗体孵育 incubation
移到杂交膜上,通
过抗体-抗原相互 作用进行特异性检 测的方法。
SYBR GREEN法
无需特别设计探针引物,价格便宜,但无法特异区分引物二聚体和产 物,可通过溶解曲线来提高反应产物特异性。
TaqMan探针法
检测特异性强,但需要针对每个基因设计特异的引物探针,且价格相 对较贵。
3. RT-PCR
RT- PCR(Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction)即逆转 录PCR,是将RNA的逆转 录(RT)和cDNA的聚合 酶链式扩增反应(PCR) 相结合的技术。具体步 骤包括: 1. 从细胞或特定组织中 提取总RNA。 2. 逆转录实验。 3.扩增内参和目的基因并 比较基因表达差异。
染色质免疫沉淀技术 (chromatin immunoprecipitation ,ChIP) 的基本 原理是在活细胞状态下固定 蛋白质-DNA复合物,并将其 随机切断为一定长度范围内 的染色质小片段,然后通过 免疫学方法沉淀此复合体, 特异性地富集目的蛋白结合 的DNA片段,通过对目的片断 的纯化与检测,从而获得蛋 白质与DNA相互作用(binding of protein and DNA)的信息。 目前已建立ChIP-chip技术。
proliferation
Stimulation
?
?
Cell
differentiation
apoptosis other changes
Mechanism?
细胞是由蛋白质和核酸为主要功能成分组成的生命复合体系, 因此,蛋白质和核酸是分子细胞生物学主要的研究对象。
主要内容: 1. RNA的提取 2. DNA的提取 3. 蛋白质的提取 4. 核酸的分析方法 5. 蛋白质的分析方法
RNA提取注意事项
一、杜绝外源酶的污染(avoid contamination of exogenous enzyme) 注意一:严格戴好口罩,手套。 注意二:实验所涉及的离心管,Tip 头,移液器杆,电泳槽, 实验台面等要彻底处理。 注意三:实验所涉及的试剂/溶液,尤其是水,必须确保 RNase-Free。 二、阻止内源酶的活性(inhibit activity of endogenous enzyme) 注意四:选择合适的匀浆方法。 注意五:选择合适的裂解液。 注意六:控制好样品的起始量。 三、操作尽量在冰上(on ice)进行。
integrin 1 CD44v6 -actin Control 0.5 h
1.0 h
(OPN: 1.0 g/பைடு நூலகம்l)
2.0 h
4.0 h
6.0 h
内参基因:即内部参照基因,他们在各组 织和细胞中表达相对恒定,在检测基因表 达是常用他们来作为参照物。其作用是校 正上样量,保证结果的准确性。 常用基因包括:β-actin,GAPDH,18S等。
Cell lysis Synpo interacts with 14-3-3β Collect precipitated protein
Western blot
Add Ab against Add beads to a protein bind Ab
六、蛋白质-核酸相互作用的分析方法 1.染色质免疫共沉淀(ChIP)
二、DNA的提取
DNA的提取方法包括:浓盐法、阴离子去污剂法、苯酚抽提法 和水抽提法,也有试剂盒供挑选使用。 主要步骤包括:破碎细胞,去除与核酸结合的蛋白质、多糖、 脂类以及其他不需要的核酸(RNA)等生物大分子。为了获得 完整的DNA,一般用蛋白酶K和去垢剂SDS等温和的方法破碎 细胞。
注意事项: 1. 提取过程应避免剧烈震荡(avoid acute vibration),保证DNA 的完整性; 2.若A260nm / A280nm 接近于1.8,则说明DNA样品的纯度高; 3. 避免酶的污染。
(3)Northern 印迹杂交
Northern 杂交是利用DNA可以与RNA进行分子杂交来检测特异性RNA的技 术,首先将RNA混合物按它们的大小和分子量通过琼脂糖凝胶电泳进行分 离,分离出来的RNA转至尼龙膜或硝酸纤维素膜上,再与放射性标记的探 针杂交,通过杂交结果可以对表达量进行定性或定量。
(2)实时定量PCR
在 PCR 反应中,引入了一种荧光化学物质,随着 PCR 反应的进行,PCR 反应 产物不断累计,荧光信号强度也等比例增加。实时荧光定量 PCR 通过对 PCR 扩增反应中每一个循环产物荧光信号的实时检测实现对起始模板定量分析。
扩增曲线指数增长的某一区,曲线的重复性非常好。如果在适当的区域设置 荧光检出界值(阈值,threshold),就会得到阈值与扩增曲线的交点Ct值 (循环次数)。Ct值与起始模板的对数值成反比线性关系。
(2)Southern 印迹杂交
Southern印迹杂交是进行基因组DNA特定序列定位的通用方法。一般利用琼 脂糖凝胶电泳分离经限制性内切酶消化的DNA片段,将胶上的DNA变性并在 原位将单链DNA片段转移至尼龙膜或其他固相支持物上,再与相对应结构的 标记探针进行杂交,用放射自显影或酶反应显色,从而检测特定DNA分子的 含量、大小。该方法主要用于遗传病诊断、DNA图谱分析、PCR产物分析等。
5. 免疫沉淀(immunoprecipitation )
6. 免疫共沉淀 (co-immunoprecipitation )
用抗体将相应特定分子沉淀的同时,与该分子特异性结合的其 他分子也会被带着一起沉淀出来的技术。这种技术常用于验证 蛋白质之间相互特异性结合(confirm the binding of proteins)。
2. PCR技术
聚合酶链式反应(PCR)是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法,由高温变 性、低温退火(复性)及适温延伸等几步反应组成一个周期,循环进行,使 目的DNA得以迅速扩增,具有特异性强、灵敏度高、操作简便、省时等特点。
(1)半定量PCR
半定量PCR(semi-quantitative PCR)与实时定量PCR(real-time quantitative PCR )相对,是将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳,通过评估溴 化乙锭(EB)染色条带强弱评估基因表达情况的方法。 产物扩增进入平台期后,样品产物量的对比关系不能反映样品中初始模板 的数量关系,因此不能准确定量。
Co-immunoprecipitation
qPCR or sequence
2. RNA结合蛋白免疫共沉淀
(RNA-binding protein immunoprecipitation, RIP)
RIP是研究细胞内RNA与蛋白结合(binding of protein and RNA)情况 的技术。RIP技术下游结合microarray技术被称为RIP-Chip。
三、蛋白质的提取
细胞裂解:加裂解液,超声30s~1min。可用紫外分光光度计 (ultraviolet spectrophotometer) 定量。细胞裂解过程需加入蛋白酶抑 制剂。 裂解液:1.0M Tris-HCl(pH 6.8)1.OmL,10%SDS 6.0mL ,β-巯基乙醇 (beta-mercaptoethanol) 0.2mL,ddH2O 2.8mL。
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