微生物学4-2 病毒和亚病毒-4类病毒及繁殖方式

毒
噬菌体的形态
细菌噬菌体的多形性（源于Richard Robarts 对加 拿大萨斯卡通市盐湖噬菌体研究的照片。）
第 四 章 病
1. 噬菌体的繁殖 噬菌体和一切病毒粒并不存在个体的生长 过程，只有其两种基本成分（核酸和蛋白质）的 合成和装配，即： 核酸复制＋蛋白质合成 病毒粒子
毒
第 四 章 病
新一代病毒开始新的生命旅程
随着时间的推移，细菌的数量变得越来越少， 这是因为它们被细菌病毒杀死了，这种现象也称为 “溶菌”现象。
2. 噬菌体效价的测定
效价（titre， titer）：表示每毫升试样中所含有的
具侵染性的噬菌体粒子数，又称噬菌斑形成单位
数（plaque-forming unit，pfu）或感染中心数
核酸可通过病毒编码的运动蛋白（movement protein） 与胞间连丝的相互作用从受染细胞进入邻近细胞而实现 病毒粒的扩散和传播。
大部分植物病毒的长距离运输是通过植物的韧皮部（phloem） 的，而甲虫传播的病毒可以在木质部（xylem）运输。
（infective centre）。
效价的测定 在涂布有敏感宿主细胞的固体培养基表面，若接 种上相应噬菌体的稀释液，则在菌苔上形成一个具有 一定形状、大小、边缘和透明度的噬菌斑（负菌落）。
噬菌体的鉴定指标， 纯种分离和计数。
较常用且较精确的测定效价的方法称为双层平板法 （two layer plating method）
特异性，不可逆吸附，启动病毒感染的第一阶段
敏感细胞
不同种系的细胞具有不同病毒的
细胞受体，病毒受体的细胞种系特异
性决定了病毒的宿主范围。
吸附于大肠杆菌菌体上的噬菌体
第 四 章 病
②侵入（penetration）
侵入又称病毒内化，病毒吸附宿主细胞后几乎
立即发生，依赖于能量的感染步骤。
毒
有伸缩尾的T偶数噬菌体：注射方式将噬菌体核酸注入细胞
病毒感染敏感宿主细胞后，病毒核酸进入细胞，
然后由这些新合成的病毒组分装配（assembly）成子 代毒粒，并以一定方式释放到细胞外。病毒的这种特 殊繁殖方式称做复制（replication）。
通过其复制与表达产生子代病毒基因组和新的蛋白质，
毒
原料 能量 生物合成场所
毒粒 宿主细胞 有繁殖性的 病毒基因组
植物病毒对宿主的专一性通常较差。 Eg.TMV可侵染十余科、百余种草本和木本植物。
毒
第 四 章 病
植物患病毒病后，主要出现三类症状：
①因叶绿体被破坏或不能合成新的叶绿素，而
引起花叶、黄化或红化等症状；
②植株发生矮化、丛枝或畸形等； ③形成枯斑或坏死等症状。
毒
水 稻 矮 缩 病
黄瓜花叶病毒（CMV）在番茄上引起的蕨叶症
噬菌体的效价如果用电子显微镜测定的，结果
会怎样？
如何测定噬菌体的生长规律呢?
3. 一步生长曲线（one step growth curve）
定量描述烈性噬菌体生长规律的实验曲线，称作 一步生长曲线或一级生长曲线（one-step growth curve）。
噬菌体和一切病毒粒并不存在个体的生长过程，只 有其两种基本成分（核酸和蛋白质）的合成和装配， 为什么会有生长曲线？
尾丝吸附
刺突固着
尾鞘收缩
尾管穿入
DNA注入
通过尾部刺突固着于细胞； 尾部的酶水解细胞壁的肽聚糖，使细胞壁产生小孔； 尾鞘收缩，核酸通过中空的尾管压入胞内，蛋白质外壳留在胞外。
脱壳是病毒侵入后，病毒的包膜和/或壳体除去而释放出
病毒核酸的过程。
脱壳是病毒基因组进行功能表达所必需的感染事件。
T-偶数噬菌体脱壳与侵入是一起发生的，
温和噬菌体的溶源性反应：
在前噬菌体阶段，噬菌体的复制被抑制，宿主细胞 正常地生长繁殖，而噬菌体基因组与宿主细菌染色 溶源性细菌经自发裂解或诱发裂解，进入裂解循环 体同步复制，并随细胞分裂而传递给子代细胞。
细胞中含有以前噬菌体状态存在的温和噬菌体基因组 的细菌称做溶源性细菌（lysogenic bacteria） 整合于细菌染色体或以质粒形成存在的温和噬菌体 基因组称做前噬菌体（prophage）
T4 噬菌体的生命旅程
噢，一只倒霉的大肠杆菌遇了细菌病毒T4噬菌体！
病毒马上抓住猎物不放， 但是大肠杆菌体积是病毒的 1000倍。病毒怎么办呢？
请看：
病毒的蛋白质外壳发挥作用，
将病毒的核酸物质注入大肠杆菌体
内，请注意病毒的外壳最后会被弃 在寄主体外。
左图：病毒核酸链接入到寄主核酸链中 右图：病毒核酸链指挥大量复制自己
（6）溶源菌的识别
少量溶源菌与大量的
敏感性指示菌相混合
与琼脂培养基混匀后倒一
个平板，经培养后溶源菌
就一一长成菌落。 溶源菌自发裂解 形成了一个个中央有溶源菌的 小菌落，四周有透明圈围着的 这种独特噬菌斑。
如果没有溶源菌结果会怎样?
第 四 章 病
（二） 植物病毒
植物病毒大多为ssRNA病毒，基本形态为杆状、 丝状和球状（二十面体），一般无包膜。
④成熟（maturation） 新合成的毒粒结构组分组装成完整的病毒颗粒， 称做病毒的装配，亦称成熟（maturation）或
形态发生（morphogenesis）。
毒
图3-8 T偶数噬菌体装配过程模式图
⑤裂解（lysis） 当宿主细胞内的大量子代噬菌体已成熟后，由于 水解细胞膜的脂肪酶和水解细胞壁的溶菌酶的作用
4. 溶源性（lysogeny） 温和噬菌体侵入相应宿主细胞后，由于前者的基因 组整合到后者的基因组上，并随后者的复制而进行同步 复制，因此，这种温和噬菌体的侵入
并不引起宿主细胞裂解，
此即称溶源性或溶源现象。
（1）溶源噬菌体（lysogenicphage） 凡吸附并侵入细胞后，噬菌体的DNA只整合在
潜伏期又可分两段：
①隐晦期（eclipsephase） 指在潜伏期前期人为地（用氯仿）裂解细胞，裂 解液仍无侵染性的一段时间。
细胞内正处于复制噬菌体核酸和 合成其蛋白质衣壳的阶段
②胞内累积期（intracellularaccumulationphase） 又称潜伏后期，在隐晦期后，如人为地裂解细胞， 其裂解液出现侵染性的一段时间。
碎色
环斑
黄化
畸 形
坏死
植物病毒一般无特殊吸附结构，只能以被动
方式侵入，通过因人为地或自然的机械损伤所形
成的微伤口进入细胞； 或者靠携带有病毒的媒介，主要靠是有刺吸式
口器的昆虫（蚜虫、叶蝉和飞虱等半翅目昆虫）取
食将病毒带入细胞。 植物病毒一旦进入细胞后，增殖产生的子代病毒或病毒
病毒的核酸链（蓝色部分）经过一系列作用，接入寄主的核酸链
（橙色部分）中，进而控制寄主的生命活动。利用寄主本身的营养物质
复制出成千上万的病毒核酸，同时新产生的病毒核酸链（黄色部分）又 指挥寄主的细胞，利用寄主的营养物质大量地生产病毒外壳蛋白质，最 后把外壳与病毒核酸一起装配成完整的新病毒。
最后:
大肠杆菌死亡并破裂，释放出里面的病毒，
数即为裂解量。
一步生长曲线的实验步骤
1、用噬菌体的稀释液感染高浓度的宿主细胞； 2、数分钟后，加入抗噬菌体的抗血清（中和未吸附的噬菌体）； 3、将上述混合物大量稀释，终止抗血清的作用和防止新释放 的噬菌体感染其它细胞；
4、保温培养并定期检测培养物中的噬菌体效价（对噬菌体含量
进行计数）；
5、以感染时间为横坐标，病毒的感染效价为纵坐标，绘制出 病毒特征性的繁殖曲线；
（4）溶源菌（lysogen或lysogenic bacteria） 凡能引起溶源性的噬菌体即称温和噬菌体， 而其宿主就称溶源菌（lysogen或lysogenic bacteria）。 溶源菌是一类能与温和噬菌体长期共存，一般不
会出现有害影响的宿主细胞。
（5）溶源菌的显著特性
① 溶源性是溶源菌的一个极稳定的遗传特性 ② 自发裂解（spontaneous lysis） 和诱发裂解
，从细胞内部促进了细胞的裂解，从而实现了噬菌体
的释放。
如果大量噬菌体在短时间内吸附于同一细胞上，使细胞壁产生 许多小孔，也可引起细胞立即裂解，但并未进行噬菌体的增殖，
称为自外裂解（lysis from without）。
自外裂解是不能产生子代噬菌体的裂解方式。
平均每一个宿主细胞裂解后所产生的子代噬 菌体数称作裂解量（burst size）。
毒
烈性噬菌体所经历的繁殖过程，称为裂解性周期 （lytic cycle）或增殖性周期（productive cycle）。
现以 E. coli 的T偶数噬菌体为代表加以介绍
①吸附（adsorption）
随机碰撞而接触（静电引力或氢键） 可逆吸附，无特异性（非细胞颗粒也可吸附）
病 毒 粒
病毒表面蛋白与细胞受体的结合
宿主的核染色体组上，并可长期随宿主DNA的复制
而进行同步复制，因而在一般情况下不进行增殖和引起
宿主细胞裂解的噬菌体，称
温和噬菌体（temperatephage）
或溶源噬菌体（lysogenicphage）。
（2）前噬菌体（prophage） 当温和噬菌体侵入其敏感宿主的细胞后，前者的核 酸可整合到后者的核基因组（genome，即核染色体）
仅有核酸病毒及结合蛋白进入细胞，壳体留在细胞外。
病毒的毒粒消失，失去原有的感染性，进入潜隐期。
③增殖（replication） 病毒基因组进入胞内 宿主细胞的代谢发生改变
病毒利用宿主的生物合成机构和场所，使病毒核酸 表达和复制，产生大量的病毒蛋白质和核酸。
病毒基因组的表达与复制存在着强烈的时序性
第 四 章 病
具有感染性的毒粒消失
病毒核酸和蛋白质
释放至细胞外
装配形成具有感染性的毒粒
病毒基因组复制、表达
第 四 章 病
噬菌体的繁殖一般分为5个阶段，即 ①吸附 ②侵入 ③增殖（复制与生物合成）
④成熟（装配）
⑤裂解（释放）
毒
第 四 章 病
凡在短时间内能连续完成以上5个阶段而实 现其繁殖的噬菌体，称为烈性噬菌体 （virulent phage）； 反之，进入菌体后并不进行增殖或引起溶菌 的则称之为温和噬菌体（temperate phage）。
上，这种处于整合态的噬菌体核酸，称作前噬菌
体（prophage）。
（3）温和噬菌体有三种存在形式 ①游离态 指成熟后被释放并有侵染性的游离噬菌体粒子； ②整合态 指已整合在宿主基因组上的前噬菌体（prophage）状态； ③营养态 指前噬菌体经外界理化因子诱导后，脱离宿主核基因组而 处于积极复制、合成和装配的状态。
噬菌体开始装配的时期， 在电镜下可观察到已初步装配好的噬菌体粒子。
（2）裂解期（risephase） 紧接在潜伏期后的一段宿主细胞迅速裂解、 溶液中噬菌体粒子急剧增多的一段时间。
（3）平稳期（plateau） 指感染后的宿主已全部裂解，溶液中噬菌体 效价达到最高点后的时期。 本期中每一宿主细胞释放的平均噬菌体粒子
双
层
平
底层平板（2％琼脂培养基10mL）
上层培养基（1％琼脂培养Байду номын сангаас5mL）
板
法
混 上层平板 宿主菌悬液（对数期菌液0.2mL）
噬菌体试样（合适稀释液0.1mL） 计数噬菌斑 37℃ 10余h 匀
双层平板法主要有以下几个优点：
①加了底层培养基后，可使原来底面不平的玻璃皿的缺
陷得到了弥补； ②所形成全部噬菌体斑都接近处于同一平面上，因此不 仅每一噬菌斑的大小接近、边缘清晰，而且不致发生上 下噬菌斑的重叠现象； ③因上层培养基中琼脂较稀，故形成的噬菌斑较大，更 有利于计数。
反映噬菌体生长规律的三个最重要的特性参数
潜伏期（latentphase）
裂解期（risephase）
平稳期的裂解量（burstsize）
（1）潜伏期（latentphase） 指噬菌体的核酸侵入宿主细胞后至第一个噬菌 体粒子释放前的一段时间。
整段潜伏期中没有一个成熟的噬菌体粒子 从细胞中释放出来
病毒的繁殖
病毒的增殖是指病毒侵染宿主细胞开始到产生子代病 毒重新释放到细胞外结束这一全过程，也称病毒的生 活周期。由于其基本要素（核酸）是通过复制的方式
增殖的，故又称病毒的复制。
第 四 章 病
第一节——病毒
七、4类病毒及其繁殖方式
（一） 原核生物的病毒——噬菌体
噬菌体：是病毒中的一种，一般把侵染细菌、放线 菌的病毒叫噬菌体。（把侵染真菌的病毒叫噬真菌 体） 噬菌体在自然界广泛存在，在1995年发表的 ICTV的病毒分类与命名第六次报告中共报道了 4000余种，分别划归为49个病毒科。 据Bradley(1967)归纳，噬菌体共有六类形态。