微生物生化鉴定
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常用生化试验
一.糖、醇发酵试验
1、糖、醇发酵试验
原理:各种细菌因含有发酵不同糖、醇的酶,所以分解糖、醇的能力个不相同。有的能分解某些糖、醇类,有的则不能分解。有的分解某些糖、醇类发酵产酸产气,有的仅产酸,而不产气。根据这些特点,可鉴别细菌。
培养基:糖发酵试验应用的培养基种类很多,大致可分为液体,半固体,固体(高层、斜面)等几类。可根据试验的要求与细菌的特性来选择。
2.乙酰甲基甲醇试验(V-P试验)
原理:某些细菌如产气杆菌,分解葡萄糖产生丙酮酸,并将丙酮酸脱羧,变为乙酰甲基甲醇,乙酰甲基甲醇在碱性环境下,被空气中的氧氧化成二乙酰,二乙酰与培养基内蛋白胨中精氨酸所含的胍基起作用,生成红色的化合物。故在培养基中加入少量含胍基的化合物,如肌酸、肌酐可增加胍基含量。试验中加入的α-萘酚为催化剂,可加速此反应,使反应颜色增加,提高反应的敏感性。大肠埃希菌不能将丙酮酸脱羧,故V-P试验呈阴性。
培养基:磷酸盐葡萄糖蛋白胨水培养基
3.甲基红试验(MR试验)
原理:许多细菌如大肠埃希菌等,分解葡萄糖产生丙酮酸,丙酮酸再次被分解,产生甲酸、乙酸、乳酸等,这样使培养基的PH降至4、5以下。这时加入甲基红指示剂呈红色。若细菌分解葡萄糖产酸量少,或产生的酸进一步转化为其她物质(如醇、酮、醛、气体与水等),则培养基的酸度仍在PH6、2以上,故加入甲基红指示剂呈黄色,为阴性反应。
培养基:磷酸盐葡萄糖蛋白胨水培养基
MUG葡萄糖醛酸苷酶试验
原理:细菌的葡萄糖醛酸苷酶在碱性条件下,作用于4-甲基伞形酮-β-D葡萄糖醛酸甘(4-Methylumbelliferyl-β-D-glucuronide简称MUG)的β葡萄糖醛酸甘键,使其水解,释放的4-甲基伞形酮在366nm紫外灯下产生蓝白色荧光。
培养基:MUG培养基
4.β-半乳糖苷酶试验
原理:肠杆菌科细菌发酵乳糖,依靠半乳糖苷渗透酶与β-半乳糖苷酶两种不同的酶作用,能水解邻硝酸酚-β-D半乳糖苷(O-nitrophenyl-β-D-galactopyranoside,ONPG),而释放出黄色的邻硝
酸酚。发酵乳糖的细菌具有上述两种酶,可迅速分解乳糖。迟缓发酵乳糖的细菌只有β-半乳糖苷酶,而缺少半乳糖苷渗透酶或就是其活性很弱,不能将乳糖很快运送到菌细胞内,通常需要延长培养时间数天,乳糖才被分解。本实验主要鉴别肠道细菌,乳糖发酵及乳糖迟缓发酵菌为阳性反应,非乳糖发酵酶为阴性。本试验可作为迟缓发酵乳糖的细菌的快速鉴定方法。5.葡萄糖氧化-发酵(O/F)试验
原理:细菌对糖的代谢分为氧化型与发酵型两种。在有氧环境下氧化完全,生成二氧化碳与水。在无氧环境下,进行不完全的分解(发酵),生成酸类、醇类与气体。氧化型的细菌在无氧环境中,不能分解糖。发酵型的细菌无论在有氧或就是无氧的环境中均可分解糖。葡萄糖氧化-发酵试验有助于假单胞菌、硝酸盐阴性杆菌、粪产碱杆菌的鉴别。
培养基:氧化发酵试验培养基
6.石蕊牛乳试验
原理:牛乳中含有大量的乳糖与酪蛋白,营养丰富,一般细菌均能在其生长,但各种细菌对这些物质的分解能力不同,可观察的反应也不同,在培养基中加入石蕊就是作为酸碱指示剂与氧化还原指示剂,可观察到不同的反应结果。
产气荚膜梭菌对牛乳具有强烈的发酵反应,产酸、产气、凝固、胨化几乎同时发生。所产生的气体,可将培养基表层的凡士林冲至管口,牛乳可全被胨化变清,这种“暴风雨”样的发酵现象称为“汹涌发酵”,为该菌所特有。乳链球菌可使牛乳培养基产酸、凝固,并可使石蕊还原。
培养基:石蕊牛乳培养基
二.氨基酸与蛋白质代谢试验
1、靛基质试验
原理:某些细菌,如大肠埃希菌、变形杆菌等,能分解培养基蛋白胨中的色氨酸,形成靛基质(吲哚)。靛基质无色,与试剂对二甲氨基苯甲醛作用后,形成红色化合物-玫瑰靛基质。本试验常用于肠杆菌科种属鉴别,大肠埃希菌98%为阳性反应,肺炎克雷伯菌、沙门菌为阴性反应。
培养基:胰蛋白胨水培养基
2.硫化氢产生试验
原理:检查肠杆菌科娥硫化氢试验,就是利用细菌对于培养基中硫代硫酸钠或硫酸钠、亚硫酸钠的还原作用,生成硫化氢。硫化氢就是无色气体,遇硫酸亚铁或枸橼酸铁铵,产生不溶性黑色沉淀物硫化亚铁。
按此原理设计的硫化氢试验,适用于肠杆菌科细菌的鉴定。沙门菌,弗劳地枸橼酸杆菌,缓慢爱
德华菌,莱克勒菌属与变形杆菌属为阳性反应,其她细菌均为阴性反应。在沙门菌属中,亦有硫化氢阴性的菌型,如甲型副伤寒、仙台、猪霍乱沙门菌等,伤寒沙门菌中亦有部分菌株为硫化氢阴性。
培养基:三糖铁琼脂或克氏双糖铁琼脂培养基。
3.尿素酶试验
原理:某些细菌,如变形杆菌具有尿素酶,能分解培养基中的尿素而产生大量的氨,使培养基成碱性,培养基中的酚红指示剂呈红色。
本试验常用语鉴别变形杆菌属。变形杆菌属能分解尿素呈阳性反应,其她肠道细菌的尿素酶试验多数为阴性反应。
培养基:尿素培养基
4.明胶液化试验
原理:明胶就是一种胶原蛋白,不具有一般蛋白质加热凝固的特性,其水溶液在24摄氏度以下为凝胶状态。明胶可被细菌的胶原酶分解为氨基酸,分解后的明胶,凝固力降低,低于20摄氏度不再凝固,呈液化状态。
本试验为细菌鉴定的常规实验法。铜绿假单胞菌,荧光假单胞菌,腐败假单胞菌等为阳性反应,肠杆菌科细菌很少液化明胶。
培养基:明胶培养基。
5、氨基酸脱羧酶试验
原理:细菌分解氨基酸使其脱羧,生成胺与二氧化碳,此为脱羧反应,需要细菌所产生的脱羧酶完成反应。各种细菌产生的脱羧酶不同,对各种氨基酸底物所产生的胺亦不相同,但均可使培养基变碱,由培养基中的指示剂显示出来。
培养基:氨基酸脱羧酶培养基
6、精氨酸双水解酶试验
原理:细菌分解精氨酸产碱不限于精氨酸脱羧酶。精氨酸可通过精氨酸脱酰胺酶及瓜氨酸酶,经两次水解,先生成瓜氨酸与氨,后形成鸟氨酸、氨及二氧化碳。鸟氨酸又在鸟氨酸脱羧酶的作用下生成腐胺及二氧化碳。
氨与腐氨均为碱性,由培养基中的指示剂显示出来。
培养基:含精氨酸的氨基酸脱羧酶培养基或用Thomley精氨酸培养基,后者常用于假单胞菌属鉴定。
7、苯丙氨酸脱氨酶试验