生物化学王镜岩版上-课件

1. 加高浓度盐类（盐析）：加盐使蛋白质沉淀 析出。
2. 分段盐析：调节盐浓度，可使混合蛋白质 溶液中的几种蛋白质分段析出。血清球蛋白 （50%(NH4)2SO4饱和度），清蛋白（饱和 (NH4)2SO4)。
2. 加有机溶剂
3. 加重金属盐
4. 加生物碱试剂
单宁酸、苦味酸、钼酸、钨酸、三氯乙酸能沉 淀生物碱，称生物碱试剂。
NaOH、CuSO2
AgNO3
、
Hg(NO3)2 及
HNO3混合物
浓HNO3及NH3
乙醛酸试剂及浓 H2SO4
α-萘酚、NaClO
碱性CuSO4及磷 钨酸-钼酸 茚三酮
紫色或粉 红色 红色
黄色、橘 色 紫色
红色
蓝色
蓝色
二个以上肽键
—OH
N
胍基 酚基、吲哚基 自由氨基及羧基
有此反应的 蛋白质或氨 基酸 所有蛋白质
蛋白质的变性
变性蛋白质通常都是固体状态物质，不溶于水 和其它溶剂，也不可能恢复原有蛋白质所具有 的性质。所以，蛋白质的变性通常都伴随着不 可逆沉淀。引起变性的主要因素是热、紫外光、 激烈的搅拌以及强酸和强碱等。
变性蛋白质主要标志是生物学功能的丧失。 溶解度降低，易形成沉淀析出，结晶能力 丧失，分子形状改变，肽链松散，反应基 团增加，易被酶消化。
加热使蛋白质变性并凝聚成块状称为 凝固。因此，凡凝固的蛋白质一定发 生变性。
4、蛋白质的颜色反应
反应名称
试剂
颜色
反应有关基团
双缩脲反应
米伦反应
黄色反应
乙醛酸反应 (Hopking-Cole 反 应) 坂口反应 (Sakaguchi反应)
酚试剂反应 (Folin-Cioculteu 反应) 茚三酮反应
精品
生物化学王镜岩版上
1、蛋白质的理化性质：
酸碱性质、胶体性质与沉淀、颜色反应、 变性
2、分离纯化的方法：
盐析、电泳、等电聚焦、层析等
1、酸碱性质
蛋白质与多肽一样，能够发生两性离解， 也有等电点。在等电点时，蛋白质的溶解 度最小，在电场中不移动。
在不同的pH环境下，蛋白质的电学性质 不同。在等电点偏酸性溶液中，蛋白质粒 子带正电荷，在电场中向负极移动；在等 电点偏碱性溶液中，蛋白质粒子带负电荷， 在电场中向正极移动。这种现象称为蛋白 质电泳
（一）盐析与有机溶剂沉淀： 1. 盐析：
在蛋白质溶液中加入大量中性盐， 以破坏蛋白质的胶体性质，使蛋白 质从溶液中沉淀析出，称为盐析。
常用的中性盐有：硫酸铵、氯化钠、硫 酸钠等。
盐析时，溶液的pH在蛋白质的等电点 处效果最好。
盐析沉淀蛋白质时，通常不会引起蛋白 质的变性。
蛋白质变性的可逆性：
a)蛋白质在体外变性后，绝大多数情 况下是不能复性的；
b)如变性程度浅，蛋白质分子的构象 未被严重破坏；或者蛋白质具有特 殊的分子结构，并经特殊处理则可 以复性。
核 糖 核 酸 酶 的 变 性 与 复 性
蛋白质分子相互聚集而从溶液中析出 的现象称为沉淀。
变性后的蛋白质由于疏水基团的暴露 而易于沉淀，但沉淀的蛋白质不一定 都是变性后的蛋白质。
蛋白质的胶体性质
布郎运动、丁道尔现象、电泳现象，不能透过半 透膜，具有吸附能力
蛋白质溶液稳定的原因： 1）表面形成水膜（水化层） 2）带相同电荷。
蛋白质的沉淀作用
蛋白质胶体溶液的稳定性与它的分子量大小、 所带的电荷和水化作用有关。
改变溶液的条件，将影响蛋白质的溶解性质
在适当的条件下，蛋白质能够从溶液中沉淀 出来。
• 蛋白质的性质与它们的结构密切相关。 某些物理或化学因素，能够破坏蛋白质 的结构状态，引起蛋白质理化性质改变 并导致其生理活性丧失。这种现象称为 蛋白质的变性(denaturation)。
在某些物理或化学因素的作用下，蛋白 质严格的空间结构被破坏（不包括肽键 的断裂），从而引起蛋白质若干理化性 质和生物学性质的改变
阳离子 PH<PI
兼性离子 PH=PI
阴离子 PH>PI
没有盐类 干扰时的 等电点叫 等离子点
可解离基团有末端和侧链 故pI与酸性、碱有些球蛋白的可解离基团只有变性后才能完全滴定
2、蛋白质的胶体性质：
蛋白质分子的颗粒直径已达1-100nm，处于胶体 颗粒的范围。因此，蛋白质具有亲水溶胶的性质。 由于胶体溶液中的蛋白质不能通过半透膜，因此 可以应用透析法将非蛋白的小分子杂质除去。
变性蛋白质分子互相凝集为固体的现象称 凝固。
有些蛋白质的变性作用是可逆的，其变性 如不超过一定限度，经适当处理后，可重 新变为天然蛋白质。
引起蛋白质变性的因素有：
① 物理因素：高温、高压、紫外线、 电离辐射、超声波等； ② 化学因素：强酸、强碱、有机溶剂、 重金属盐等。
变性蛋白质的性质改变：
① 物理性质：旋光性改变，溶解度下 降，沉降率升高，粘度升高，光吸收度 增加等； ② 化学性质：官能团反应性增加，易 被蛋白酶水解。 ③ 生物学性质：原有生物学活性丧失， 抗原性改变。
可逆沉淀
在温和条件下，通过改变溶液的pH或电荷状 况，使蛋白质从胶体溶液中沉淀分离。
在沉淀过程中，结构和性质都没有发生变化， 在适当的条件下，可以重新溶解形成溶液，所 以这种沉淀又称为非变性沉淀。
可逆沉淀是分离和纯化蛋白质的基本方法，如 等电点沉淀法、盐析法和有机溶剂沉淀法等。
不可逆沉淀
在强烈沉淀条件下，不仅破坏了蛋白质胶 体溶液的稳定性，而且也破坏了蛋白质的 结构和性质，产生的蛋白质沉淀不可能再 重新溶解于水。
由于沉淀过程发生了蛋白质的结构和性质 的变化，所以又称为变性沉淀。
如加热沉淀、强酸碱沉淀、重金属盐沉淀 和生物碱沉淀等都属于不可逆沉淀。
3、蛋白质的变性
一、蛋白质在某些理化因素的作用下，其空间 结构受到破坏，从而改变其理化性质，并失去 其生物活性，称为蛋白质的变性。
二、变性的实质是 破坏了蛋白质的空 间结构，并不引起 一级结构的改变。
Tyr
Tyr、Phe Trp
Arg
Tyr
α-氨基酸
5、蛋白质的紫外吸收
• 大部分蛋白质均含有带芳香环的苯丙氨 酸、酪氨酸和色氨酸。
• 这三种氨基酸的在280nm 附近有最大吸 收。因此，大多数蛋白质在280nm 附近 显示强的吸收。
• 利用这个性质，可以对蛋白质进行定性 鉴定。
蛋白质的分离与纯化方法