药物的生殖毒性作用

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二、生殖毒性的评价
➢ 是检查外源化学物对动物生育繁殖机能有无 损害作用的试验。
➢ 评定的主要依据是交配后母体受孕情况（受 孕率）、妊娠过程情况（正常妊娠率）、子 代动物分娩出生情况（出生存活率）、授乳 哺育（哺育成活率）以及断奶后发育情况等。
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三段生殖毒性试验
主要是根据发育阶段的区别来设计的，每一段试验 大致相当于上述两个阶段。
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外源化学物对生殖发育的影响
➢ 干扰生殖发育的任何环节，并造成损害作用。 ➢ 可以通过对内分泌系统，特别是对性腺的作用，
发生间接的影响。 ➢ 神经系统对内分泌功能也有调节作用，通过下
丘脑-垂体-睾丸轴(下丘脑-垂体-卵巢轴)两条 途径作用于生殖发育过程 。
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外源化学物对生殖发育损害作用的特点
➢ 生殖发育过程较机体其他系统更为敏感； ➢ 外源化学物对生殖发育过程影响的范围较为广
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4. 母体毒性作用 母体毒性作用是指外源化学物在一定剂量下，对受孕母
体产生的损害作用。具体表现包括体重减轻、出现某些临床 症伏、直至死亡。 ➢ 母体毒性作用与致畸作用关系 ❖ 具有致畸作用，但无母体毒性出现。 ❖ 出现致畸作用的同时也表现母体毒性。 ❖ 不具有特定致畸作用机理，但可破坏母体正常生理稳态。 ❖ 仅具有母体毒性，但不具有致畸作用。 ❖ 在一定剂量下，既不呈现母体毒性，也未见致畸作用。
一般最高剂量不超过LD50的1/5～1/3，低剂量可为 1／100～1／30。
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❖ 给药期：
在胚胎器官形成期连续给药（由胚胎着床到硬腭闭 合），大鼠孕后6～15天，家兔6～18天。
由于致畸作用有极为明确的敏感期，应精确掌握动物 接触受试物的时间，必须在器官发生期。
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❖ 动物交配处理：
每组动物大鼠或小鼠为12～20只，家兔8～12只，狗等 大动物3～4只。
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一、生殖毒性表现
外源化学物对生殖的过程的损害作用可以 表现为性淡漠，性无能或各种形式的性功能减 退。雌性可出现排卵规律改变，月经失调或失 经，卵巢萎缩，受孕减少，胚胎死亡，生殖能 力的降低不孕或不育等。雄性可表现为睾丸萎 缩或坏死，精子数目减少。
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对雄性生殖系统的毒作用
直接损伤睾丸中的细胞群
对精子发生的有害作用
不能完全丧失生育能力。相当于1/10LD50。 低剂量组则不应产生任何可观察到的损害效应。相当于高
剂量组的1/30。 中剂量组应仅能出现极为轻微的中毒症状。 如果1000mg/kg体重剂量对生育力无损害作用，或最高剂
量可引起亲代动物表现一般毒性作用，但对生育力无不利 影响，则可不进行其他剂量实验。
畸胎率与剂量成正比，当高到一定水平引起胚胎死亡而 掩盖了致畸作用，畸胎率反而会下降。
❖ 致畸作用的剂量效应曲线较为陡峭，斜率很大。 致畸带：从无作用剂量到胚胎死亡剂量的范围
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致畸作用的毒理学特点
➢ 种属差异以及个体差异在致畸作用中较为明显 ❖ 在不同动物并不一定都具有致畸作用，引起畸
形的类型也不一致。 ❖ 种间差异即同一物种中不同品系之间存在的差
第八讲 生殖发育毒性及其 试验与评价方法
第一节 概 述
➢ 哺乳动物的生育繁殖过程 ➢ 外源化学物对生殖发育的影响 ➢ 外源化学物对生殖发育损害作用的特点
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哺乳动物的生育繁殖过程
生殖发育是哺乳动物繁衍种族的生理过程， 其中包含生殖细胞发生（即精子发生和卵细胞 发生）、配子的释放、性周期和性行为、卵细 胞受精、受精卵的卵裂、胚泡的形成、植入或 着床、胚胎形成、胚胎发育、器官发生（或称 器官形成）、胎仔发育、分娩和哺乳过程。
Ⅰ段：生育力和早期胚胎发育毒性试验（一般生殖毒性试验） 主要反映妊娠前及妊娠初期的情况
Ⅱ段：肧体-胎体毒性试验（致畸试验） Ⅲ段：出生前后发育毒性试验（围生期毒性试验）
反映外源化合物对胚胎发育后期、母代分娩过程、 哺乳期的影响。
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Ⅰ段：生育力和早期胚胎发育毒性试验 （一般生殖毒性试验）
目的：评价受试物对配子成熟、交配行为、生育力、胚 胎着床的影响（前述生殖周期的A和B阶段）。
及其他化学物的生殖发育毒性。 3. 改进的大鼠发育神经毒性的试验程序。
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❖ 动物选择:
致畸试验的动物选择，除参照毒性试验中选择动物 的一般原则，即食性和对受试物代谢过程与人类接近， 体型小，驯服，容易饲养和繁殖及价廉外，还应特别注 意妊娠过程较短、每窝产仔数较多和胎盘构造及厚度与 人类接近等特点。
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2. 雌性生殖毒性评价
➢ 三代两窝
F０ （断奶或出生8 周）
第一次交配 给予受试物 8 到12 周 第二次交配
F１a
观察三个月，喂饲普通饲料，
观察其生长发育情况
F１b
21 天 断 乳 后 给 予 受 试物8到12周
F２a
观察三个月，喂饲普通饲料， 观察其生长发育情况
F２b
21 天 断 乳后 给予 受 试 物8 到12 周
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Wilson发育毒理学基本原理
（一）对致畸的易感性取决于孕体的基因型及其与有害环境 因子相互作用的方式。 （二）对致畸的易感性随着对有害因素暴露的发育时期的不 同而变化。 （三）致畸物以特异的方式（作用机制）作用于发育的细胞 和组织，启动一系列的异常发育事件（细胞病理机制）。 （四）有害影响能否接近发育中的组织取决于有害影响本身 的性质。 （五）异常发育的四种表型是：死亡、畸形、生长迟缓和功 能缺陷。 （六）随着剂量的增加，异常发育表型的频率和程度也随之 增加，从无毒作用到全部致死。
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Ⅱ段：胚体-胎体毒性试验（致畸试验）
生殖是对亲代动物而言，从配子生成、受精到胎 体分娩是一生殖过程。
发育主要是对子代而言，从受精卵到性成熟的青 春期甚至一直到衰老都属于发育过程。发育毒性也称 为胚胎毒性。
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基本概念
1.发育毒性(developmental toxicity) 指出生前经父体和(或)母体接触外源性理化因素引起的
泛和深远。不仅直接涉及雌雄两性个体，同时 还对其第二代甚至以后世代的个体产生影响。
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第二节 生殖毒性及其评价
➢ 生殖毒性的表现 ➢ 生殖毒性的评价方法
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➢ 1950年美国霍普金斯大学医院发现，怀孕期间服用黄 体酮，先后有600多名女婴出现生殖器男性化畸形 。 ➢ 1956年用于治疗妊娠反应的反应停，1961年后出现近 万例短肢畸形儿(海豹畸形)。 ➢ 二恶英(TCDD)造成的大面积污染及其与人群生殖危害 的关系至今仍不清楚 。 ➢ 过去半个世纪震惊全球的系列中毒或灾难事件的发生， 在世界范围内提高了人们对用药的安全意识，高度关注 新的化学物对生殖内分泌系统或妊娠结局的不良影响， 促进了与生殖内分泌系统安全相关法律的产生和研究方 法指南的问世。
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2. 畸形、畸胎和致畸物 ❖ 畸形:器官形态的异常。 ❖ 致畸物或致畸原:凡在一定剂量下，能通过母体对胚胎 或胎儿正常发育过程造成干扰，使子代出生后具有畸形的 化合物。 ❖ 畸胎:具有畸形的胚胎或胎仔。 ❖ 致畸试验:评定外源化学物是否具有致畸作用的试验。 3. 胚胎毒性作用
外源化学物引起的胎仔生长发育迟缓和功能缺陷不全 的损害作用，对母体无显著的毒效应。
给药期：雄性从交配前4周开始染毒，并持续至交配成功 ；雌性交配前2周开始染毒（以覆盖3～4个动情周期）， 至妊娠第6天受精卵着床。
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一般生殖毒性试验方法原则
❖ 受试动物：多用性成熟大鼠，也可用小鼠或家兔 ❖ 剂量分组：一般设立三个剂量组和两个对照组 高剂量组产生轻微毒性症状，但其死亡率不大于10%，也
正常分娩率: 反映雌性动物妊娠过程是否受到影响 幼子出生存活率＝正常分娩雌性动物数／妊娠动物数×100％
幼仔出生存活率: 反映雌性动物分娩过程是否正常 幼子出生存活率＝出生后4天存活幼子数／分娩时出生幼子数 ×100％
幼仔哺育成活率: 反映雌性动物授乳哺育幼仔的能力 幼子哺乳成活率＝21天断乳幼子存活数／出生后4天幼子存活 数×100％
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❖ 染毒途径:动物接触受试物的方法应参照人类实际接触途径。 交配前雄性动物应染毒4-10周，雌性动物2周 一般可混入饲料或饮水中，也可采用灌胃或胶囊法。
❖ 动物:至少采用一种动物，推荐用大鼠；每组雌雄各20只； 雌性动物妊娠13-15天处死，雄性交配成功处死。
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评价方法
1. 雄性生殖毒性评价（动物试验） 精子生成分析（精子计数、形态学及其活率） 精子功能检测 睾丸标志酶活性检测 交配实验 显性致死试验
在子代到达成体之前出现的有害作用，也称为胚胎毒性。具 体表现可分为: ❖ 生长迟缓: 即胚胎与胎仔的发育过程在外源化学物影响下， 较正常的发育过程缓慢。 ❖ 畸形: 由于外源化学物干扰，活产胎仔胎儿出生时，某种 器官表现形态结构异常。 ❖ 功能不全: 即胎仔的生化、生理、代谢、免疫、神经活动 及行为的缺陷或异常。 ❖ 胚胎死亡: 某些外源化学物在一定剂量范围内，可在胚胎 或胎仔发育期间对胚胎或胎仔具有损害作用，并使其死亡。
通常采用两种动物：一种啮齿类，首选大鼠；另一 种非啮齿类推荐家兔。
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❖ 剂量分组：
一般应先进行预试，目的是找出引起母体中毒的剂量。 最少设3个剂量组，另设对照组。原则上最高剂量组，可以 引起母体轻度中毒，即进食量减少、体重减轻、死亡不超 过10%。最低剂量组为无母体和胚胎毒性反应；中间剂量组 可以允许母体出现某些极轻微中毒症状。其剂量与高剂量 和低剂量成等比级数关系。
致畸作用机制
➢ 基因突变引起胚胎发育异常 ➢ 细胞死亡和增致速度减慢 ➢ 细胞间通讯抑制 ➢ 胚胎中间代谢障碍 ➢ 胚胎组织发育过程的不协调
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外源化学物发育毒性的评价
➢ 传统常规致畸试验
主要试验方案：由美国环境保护局（EPA）首先提出。 1. 三段生殖毒性试验主要用于评价药物的生殖发育毒性。 2. 一代和多代生殖毒性试验主要用于评价食品添加剂、农药
F３a
F３b
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➢ 两代一窝(和一代一窝)生殖试验
出生第８周给予受试物（F０） 第１６-１９周 雌雄交配 F１（每窝选留幼仔８只，雌雄各半）
断奶，给予受试物 F１交配
F２出生，每窝留８只幼仔 F２断奶，检查发育情况
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观察指标：
受孕率: 反映雌性动物生育能力以及雌性动物受孕情况 受孕率＝妊娠雌性动物数／交配雌性动ຫໍສະໝຸດ Baidu数×100％
将性成熟雌雄动物按雌雄l：1或2：1比例同笼交配。 每日将已确定受孕雌鼠随机分入各剂量组和对照组。出现 阴栓或精子之日即为受孕0日，也有人作为第1日。
异，在致畸作用中也极明显。
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致畸作用机理
Wilsom(1977)提出了畸形发生的9种机制，包括 突变、染色体断裂、有丝分裂改变、改变核酸完整性或功 能、减少前体或底物的补给、减少能源支持、改变膜特性、 渗透压不平衡和酶抑制作用。近年来在分子水平的研究有 很大的进展，虽然胚胎有代偿机制弥补外源性化学物的影 响，但是，是否产生畸形依赖于在致病过程中的每个步骤 在损伤和修复之间的平衡。
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5. 畸形与变异 ❖ 在胚胎或胎儿出现器官形态结构异常称为畸形。 ❖ 机体的形态结构或生理功能，在同一物种的子代与亲代 之间或子代的个体之间，有时出现不完全相同的现象，即 为变异。
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致畸作用的毒理学特点
➢ 器官发生期的胚胎对致畸物最为敏感 ➢ 剂量与效应关系较为复杂 ❖ 剂量效应关系复杂的表现及原因：在一定范围内，
生殖发育也可称繁殖过程。
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连续、完整的生殖发育过程的六个阶段
A.从交配前到受孕：检查成年雄性和雌性生殖功能、配子的发 育与成熟、交配行为、受精。 B.从受孕到着床：检查成年雌性生殖功能、胚胎着床前发育、 着床。 C.从着床到硬腭闭合：检查成年雌性生殖功能、肧体发育、主 要器官形成。 D.从硬腭闭合到妊娠结束：检查成年雌性生殖功能、胎体的发 育与生长、器官的发育与生长。 E.从出生到断乳：检查成年雌性生殖功能、新生仔对宫外生活 的适应性、断乳前的发育与生长。 F.从断乳到性成熟：检查断乳后的发育与生长、对独立生活的 适应、达到完全的性功能。
继发性的影响精子发生 改变下丘脑-垂体功能
直接影响睾丸细胞功能
• 精子生成障碍 • 性欲异常，丧失生育能力 • 引起生殖细胞突变，造成可遗传损害
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对雌性生殖系统的毒作用
对卵巢的损害：卵母细胞数下降/突变；
生长卵泡和成熟卵泡降低，排卵抑制，受孕力下降； 干扰卵巢内分泌，影响受精/着床/胚胎发育
生殖道的损害：影响运送卵子/受精/受精卵发育 对下丘脑-垂体系统的损害：闭经，受孕力降低。