酶分析法

第一节 概述
（2）指示酶偶联定量法原理
某些酶促反应中，由于底物和产物的物理化学性质不易区分，因而仅用单酶
反应难以定量，必须借助另一种酶及其辅酶偶联反应来测定最终产物含量。此时，
偶联的酶及辅酶的改变，可作为酶反应完成的定量指示剂，故又称指示酶。
酶法分析中常用的指示酶有辅酶Ⅰ和辅酶Ⅱ，二者还原后在340nm处均有特
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第八章 酶分析法
酶是具有催化功能的生物大分子，在一定条件下，酶可催 化各种生化反应，并且酶的催化作用具有专一性强、催化效率 高和作用温和等特点，因此酶的应用非常广泛。
酶分析法包括两种类型：一种是以酶作为分析工具或分析 试剂，用来测定样品中用一般化学方法难于检测的物质，称为 “酶法分析”；另一种是以酶作为分析对象，根据需要对样品 进行酶含量或活力测定，称为“酶活力测定法”。
四、酶含量测定原理 1.终点法的原理 终点法又称总变量法，先借助酶反应（单独的反应或几种酶构成的偶数酶 反应）使被测物质定量地进行转变，然后在转化完成后，测定底物、产物或辅 酶物质（第二底物）等的变化量，因此称为终点测定法。 （1） 单酶反应定量法的原理 在单底物的情况下，酶促反应方程可写为：
（8-1） 式中，S为底物，E为酶，P为产物。根据酶促反应动力学推导，若底物浓 度大大小于米氏常数Km时，其速度方程式应为一级反应方程式，即：
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—适用于制药类专业
第一章 绪论 第二章 药物分析基本知识 第三章 生物药物的检查法 第四章 生物检定法 第五章 免疫分析法 第六章 电泳分析法 第七章 色谱法 第八章 酶分析法
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第九章 氨基酸、肽类、蛋白质类药物的分析 第十章 抗生素类药物的分析 第十一章 维生素类药物的分析 第十二章 核酸类药物的分析 第十三章 甾体激素类药物的分析 第十四章 药物制剂及工艺用水的分析 第十五章 基因工程药物分析 第十六章 体内药物分析常用方法与应用
（8-2） 式中，V为测定时的反应速度，VMAX为最大反应速度，[S]为底物浓度。按 反应速度定义：
（8-3） 式中，t为反应时间，k为正反应的速度常数。
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将上式进行积分得：
（8-4）
（8-5）
式中 为初始底物浓度，在半对数坐标纸上， 与t之间呈直线关系，已知t与 ， 即可求得 ，并可计算速度常数k。 酶促反应接近完全反应所需时间为：
（8-6）
一般酶促反应的时间较快，2~10min即可完成。设反应完全时间为5min，则： （8-7）
由式（8-2）与（8-3），得 （8-8）
（8-9） 通过式（8-8）（8-9）可计算出该项酶促反应所必须使用的酶活力单位，酶 活性单位的数值等于 。例如，己糖激酶对葡萄糖催化作用的Km为 0.1mmol/L,按（8-9）式，必须使用的己糖激酶活性应达到0.092单位。
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三、酶活力的检测方法 1.取样测定法 取样测定法是在酶反应开始后不同的时间，从反应系统中 取出一定量的反应液，并用适当的方法终止反应，再选用适当 的检测方法进行定量分析，求得酶促反应的平均速度。 在该方法中停止酶促反应通常采用添加酶的变性剂来实现， 另一种停止反应的方法是加热使酶失效。
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2.连续测定法 连续测定法是指每隔一定时间（2~60s），连续多次测定 酶反应过程中某一反应产物或底物量随时间变化的数据，求出 酶反应初速度，间接计算酶活性浓度的方法。 3.检测方法 无论是取样测定法还是连续测定法，酶促反应速度都要通 过测定底物或产物来实现。常用的检测方法有紫外-可见分光光 度法、荧光分析法、旋光度法等。
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（1）紫外-可见分光光度法 根据产物和底物在某一波长或波段上有明显的特征吸收差别而建 立起来的连续检测方法。 吸光度测定法的特点是灵敏度高，简便易行，测定一般可在较短 的时间内完成。
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（2）荧光分析法 它的原理是如果酶反应的底物与产物之一具有荧光，那么荧光变 化的速度可代表酶反应速度。 应用此法测定的酶反应有两类： 一是脱氢酶等的反应。 另一类是利用荧光源底物的酶反应。 主要缺点是荧光读数与浓度间没有确切的比例关系，而且常因测 定条件如温度、散射、仪器等而不同。 优点是灵敏度高。
殊的吸光度变化。
指示酶偶联反应过程可表述如下：
S
E1 ES
E2
P（8-10）
k1
k2
中间产物ES由于在指示酶E2的作用下进一步反应，故其浓度较小，因而指示Байду номын сангаас
酶反应亦可近似应用一级反应速度方程，其S 、S 0、k1、k2计算均类似单酶反应定
量法，必须加入的指示酶活性单位可按下式计算：
（8-11） 式中的系数1.84是按 必须大于2计算的。
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（3）旋光度法 某些酶反应过程常伴随着旋光度变化，在没有其他更好 的方法可用时，可以考虑用旋光度测定法。 （4）酶偶联测定法 酶偶联法是应用过量、高度专一的“偶联工具酶”，使 被测酶反应能继续进行到某一可直接、连续、简便、准确测 定阶段的方法。是目前在酶活性测定中应用最多最广的方法。
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2.反应速度法的原理 借助酶进行定量分析时，通常都采用上面介绍的终点测定法。 但是如果很难得到专一地作用于被测物的酶或偶联指示酶时，或 被测物极其微量时，终点测定法往往不能适用，而反应速度法则 可以采用。 反应速度法的原理是通过条件控制，分别使底物、辅酶活化剂 或抑制剂的浓度在酶反应中对反应速度起主导作用，这时酶反应 速度和上述相应因素的浓度间将具有确定的比例关系，这样测定 酶反应的速度就可求出它们的浓度。酶分析法采用的条件和酶活 力测定法的条件基本相同，但其所用的酶量必须一定，被测物以 外的其他反应成分均须保证处于恒定和最适条件。
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一、基本概念
酶活力是指在一定条件下，酶所催化的反应初速度。酶催化反应的速 度，可以用单位时间内反应底物的减少量或产物的增加量来表示。
酶活力的大小，可用酶活力单位来表示。1961年国际生物化学与分 子生物学联合会规定：在特定条件下（温度可采用25℃，pH值诸条件均 采用最适条件），1min催化1μmol的底物转化产物的酶量定义为1个酶 活力单位，这个单位称为国际单位（IU）。
酶的比活力也称比活性，代表酶制剂的纯度，是指每毫克酶蛋白所具 有的活力单位数。对同一种酶来说，酶的比活力越高，纯度越高。
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二、酶促反应条件 选择酶反应条件的基本要求是：所有待测定的酶分子都应 该能够正常发挥它的作用。这就是说，反应系统中除了待测定 的酶浓度是影响速度的唯一因素外，其他因素都处于最适于酶 发挥作用的水平。确定反应条件时应该考虑以下因素： 1.底物 2.pH 3.温度 4.辅助因子 5.空白和对照