斑马鱼整体原位杂交详细步骤

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(标准)斑马鱼胚胎原位杂交material&protocol

器（Ｉ６１、Ｈ－－）进针器（Ｎ１）支架（Ｊ１，本ＮｒｓｉＭ－５、１Ｇ－）日ａｉｇｈｅ
公司产品；
１显微注射用针，由Ｄｕｍｎ公司１毛细玻璃管拉制而成；３．ｒｍｏｄ０川
１．４拉针仪（ＥＡＰ）ＨＫＰ５，日本ＨＫ公司产品；ＩＥＡ１．５荧光解剖镜（Ｘ－２，日本ＯＹＰＳＳＺ１）ＬＭＵ公司产品；１．６数码相机（９５，本ＮＫＮＥ９）ＦＩＩＯ公司产品；主要试剂、试剂盒、酶、载体和菌株
１．各种限制性内切酶、４ＤＡＴ－Ｎ连接酶、ｌｏ片段均为Ｎｗｇａｄｌｂ公司ＫｅｗｎｅＥｌｎＢｏａｓｎｉ
产品；
２ＰＲ应试剂，．反Ｃ包括：ａ酶、应缓冲液、ＮＰＴｑ反ｄＴ等均购自上海申能博彩生物公司：３位杂交试剂：Ｓ６．原ＰＲＡ聚合（５反应缓冲液和ｌｍＤＮ酶含ｘ０Ｍ０ＴＴ溶液）ＴＲ、７ＮＡ
ＳＡＴｇｎｃｏｄ部分序列５ＡＧＡＴＧＡＣＡＧＡＡＴ３ＭＲＯｉｕｌｔｅｌｏｅｉ＇ＡＣＧＧＴＴＡＣＣＧＧ－’ －作为５＇端
ＰＲ引物，进行ＰＲ扩增ｃＮＣＣＤＡ．ＰＲ反应体系：ＣＦｒ－ｔｎｃＡｄＮｉｔｒｓＳａＤ１１４１ＸＲｅｂｆｒ０ＣｕＰ５１４５ＸＴＭｉＰｘ０Ｎｄ１１４
斑马鱼平滑肌特异性基因Ｓ２的克隆、表达和功能研究Ｍ２ａ
Ｌｎ，９７０ｏｇ１９）ＰＲ产物克隆到ＴｅａｖｃｏＣ－ｓｙｔｒ上，通过连接、转化、小量抽提、限制性内切酶ｅ酶切、电泳鉴定出正确克隆，具体步骤参考《子克隆实验指南（分第三版），并通过测序验证其正确性。大量抽提ＧＴ－ｃＮＴ质粒，分别采用限制性内切酶ＳｌＡＡ１Ａ－Ｄａｌ

斑马鱼的原位杂交技术

斑马鱼的原位杂交技术整理人邵明:将特定时期的斑马鱼胚胎在多聚甲醛中C4%4o固定过夜第一天：、洗1PBST2x5min、剥膜2、洗3PBST5min可选步骤蛋白酶处理前的胚胎不处理(: K: 24hpf, 24hpf-的胚胎蛋白酶处理分钟以后的胚胎处理半小时48hpf10ug/ml K15, 48hpf,然后洗PBST3x5min)、C5min4hyb- 65o孵育、C4h（可选步骤: 可将胚胎置于hyb+中-20oC长期储存）5hyb+ 65o孵育、加探针(探针孵育置于冰上65oC10min, 5min, 655oC-孵育过夜65oC先将然后使用).第二天：、回收探针, I2x30min1（探针可以重复使用10次以上）洗液孵育探针的温度、洗液孵育探针的温度2II 1x15min、洗液孵育探针的温度3III 2x30min、室温4MABT 3x5min、封闭液孵育室温5 4h、AP, 4oC (-20oC, 61:2500 Anti DIG-稀释于封闭液中孵育过夜稀释好的抗体保存于可重复使用3次以上。

)第三天、回收抗体1、2MABT 2x30min3、PBST 2x30min、平衡缓冲液左旋咪唑4+0.5mg/ml （60mg/ml左旋咪唑储液稀释120倍）孵育10min、显色液中孵育直到信号足够强为止。

5试剂配方固定液: 4% 多聚甲醛（paraformaldehyde）in 1XPBSWeigh 2 g PFA and dissolve it in 50 ml 1XPBS. (PFA is hard to dissolve.) Incubate the mixture at 65oC for around 2 hours. Shake the mixture during the incubation). After dissolved, the solution is stored at 4oC.10XPBS stock solution: mix 76 g NaCl, 9.9 g Na2HPO4, 3.6g NaH2PO4. Dissolve them in less than 1 liter nanopure water, adjust to pH7.0 and a final volume of 1 liter. Autoclave for 35 minutes to sterilize.130 mM NaCl = 10 X 0.13 X 58.44=76 g NaCl7 mM Na2HPO4 = 10 X 0.007 X 142 = 9.9 g Na2HPO43 mM NaH2PO4 = 10 X 0.003 X 120 = 3.6 g NaH2PO4Paraformaldehyde (PFA) (Mallinckrodt 2621).（注意所用的试剂有没有结晶水）Proteinase K (Sigma P-2308); Stock solution (10 mg/ml = 10 ug/ul): weigh 10 mg proteinase K and dissolve in 1 ml nanopure water. Aliquot 50 ul each and store at -20oC. Thaw at room temperature before usage. Long storage may appear to see white precipitate after thawing. V ortex the tube and make sure the precipitate be mixed evenly.20XSSCFor 1 liter: 1 X 3 mol = 3 X 58.44 =175.3 g NaCl1X 0.3 mol = 0.3 X 294.1 = 88.2 g Na3.Citrate.2H20adjust pH=7 using HCl. autoclave 35 minutes for sterilizeization.（注意所用的试剂有没有结晶水）Yeast RNA: dissolve 50 mg RNA in 1 ml nanopure water (50 mg/ml); store at -20oC肝素（Heparin） (Sigma H3393): dissolve 50 mg heparin in 1 ml nanopure water (50 mg/ml); store at -20oCMAB X 2 liters pH7.5100 mM Maleic acid (Sigma M-0375) = 23.2 g (2 X 0.1 X116.1)150 mM NaCl = 17.5g (2 X 0.15 X 58.44)add solid (? g) to adjust pH=7.5, autoclave for 35 minutes to sterlize.Blocking regent (1096 176, Boehringer Mannheim, now Roche?). 10% stock solution. Weigh 10 g blocking regent and dissolve it in 100 ml MAB, shaking and heating in a microwave oven for 1 minutes (?), autoclave for 25 minutes and then aliquot into 14 ml and store at -20oC.50mg/ml 酵母RNA：称取2g酵母RNA干粉（生工），加入40ml去离子水，超声振荡溶解，-20oC保存。

斑马鱼相关实验操作

斑马鱼人工繁殖、受精和胚胎发育一、实验目的了解斑马鱼的生活和繁殖习性，掌握斑马鱼人工繁殖技术，了解斑马鱼受精、胚胎发育过程和形态模式形成的特点。

二、斑马鱼的生活和繁殖习性斑马鱼（Danio rerio）为热带鱼类，可在一年内多次产卵。

在合适的养殖条件下，4月龄的斑马鱼即性成熟；性成熟后每1-2周可以产卵一次，一条雌鱼一次可以产出数百颗卵子。

斑马鱼产卵受温度和光照长度的调节。

最适产卵水温为28.5℃，产卵的光调节周期为光照14小时，黑暗10小时。

为防止自然产卵，性成熟的雌、雄斑马鱼必须分开养殖。

斑马鱼具有下列特点：1、繁殖周期短，不受季节限制，容易获得所需要的精子、卵子和胚胎材料。

2、小型鱼类，可在实验室高密度养殖，饲养成本低。

3、是脊椎动物，具有和人类相似的器官和组织。

4、体外受精、体外发育，胚胎培养条件简单。

5、胚胎透明，可以在活体上直接观察器官的发育。

6、发育周期短，在28.5℃温度下培养，受精后24小时即可以形成个体的基本结构。

因此，斑马鱼现在选择作为发育生物学研究的模式动物。

三、实验器材和材料斑马鱼养殖系统，大塑料盆（直径约58cm）两个，塑料筛框（直径约36cm）一个，中号塑料盆（直径约36cm）1个，加热棒，加气泵，12cm培养皿若干，9cm培养皿若干，数个胶头滴管。

曝气水10L。

性成熟雌、雄性斑马鱼。

四、实验内容和程序实验前一天的准备：1、在实验前一天的早上向2个大塑料盆中放大半盆干净的自来水，放入气泵和加热棒，将加热棒温度调整至28℃（每个加热棒都有差异，需要放入温度计，根据温度计指示的实际温度调节和校准温度计），以供斑马鱼催产繁殖时使用。

2、曝气水将干净的自来水烧开后冷却，将气泵放入其中进行曝气，以为培养胚胎之用。

3、斑马鱼的选取和催产雌雄鱼的鉴别：性成熟的雄鱼体型修长，腹部较小，而雌鱼腹部较大。

选鱼的时间在实验前一天的晚上，在选取斑马鱼之前需要喂食红虫，喂食后1小时才开始选鱼。

斑马鱼产子全过程

斑马鱼产子全过程斑马鱼，学名丹尼奥鱼，也称剑尾斑马鱼，是热带淡水鱼类中的一种。

它们的繁殖过程相对独特，下面将详细介绍斑马鱼的产子全过程。

斑马鱼的产卵过程包括交配、卵的产出和受精、卵的孵化。

首先是交配过程。

斑马鱼一般在雌鱼8个月大、雄鱼10个月大时性成熟。

成熟的雄鱼拥有鲜艳的颜色和长尾巴，而雌鱼则较为沉闷。

斑马鱼是颗粒卵，雄鱼通过颜色和尾巴晃动来吸引雌鱼的注意。

在发现对方后，雄鱼会追逐雌鱼，然后两条鱼靠近并同时向上突然弯曲身体，交配就发生在这个瞬间。

交配一般持续几秒到几分钟不等。

完成交配后，雌鱼将会开始下卵，此时雄鱼会紧紧地跟着雌鱼。

雌鱼挤压体内的卵巢，将一片片成熟的卵直接释放到水中。

由于斑马鱼卵一般较小，直径在1-2毫米之间，所以每次产出的卵大约有几十枚到几百枚不等。

卵的颜色一般为无色或者浅黄色。

在产卵期间，雄鱼会继续追逐雌鱼，并冲向雌鱼的尾部，激起雌鱼尽量释放更多的卵。

整个产卵过程大约持续几分钟到几小时不等。

完成产卵后，卵需要受精才能继续孵化成小鱼。

雄鱼会释放精子，它会通过水流迅速到达卵子旁边，进行受精作用。

斑马鱼的受精方式是在水中受精，而不是体内受精。

精子直接游到卵子表面与之结合，形成受精卵。

受精完成后，卵子表面会有一层黏液保护受精卵不受伤害。

经过受精后，卵开始孵化。

卵的孵化时间与水温有关，一般在24-36小时之间。

斑马鱼的卵孵化过程相对简短。

在孵化期间，卵会逐渐变成灰色，并且会有卵黄充当营养源供小鱼孵化后使用。

当卵孵化后，幼鱼会开始出壳，它们会成群地挤在卵壳下面。

很快，小鱼身体上的鳞片就会开始展开，并且迅速游动。

幼鱼身体上的颜色会比较淡。

综上所述，斑马鱼的产子全过程大致包括交配、卵的产出和受精、卵的孵化。

斑马鱼的繁殖过程相对快速，需要适应合适的水温和环境才能保证卵的顺利孵化。

斑马鱼胚胎整体原位杂交_6.22

斑马鱼胚胎整体原位杂交(Whole-mount in situ hybridizations in zebrafish embryos)北京大学遗传与发育生物学实验室整理者：肖安版本：V6.22 Build 2006-8-17说明：小号宋体文字为操作提示，其中下划线标记者为以下数步均需注意的内容；小号楷体文字为影响结果的重要步骤提示，注意控制记录其操作处理的条件和时间，以在重复实验探索最适条件时进行适当调整。

在整个实验中应当注意：(1) 由于环境中存在大量RNA酶，RNA在常温下极易降解。

因此，涉及RNA的操作，在探针去除之前，以及探针的合成与纯化过程，必须严格防止污染。

操作需要要戴乳胶手套进行，使用专用枪头、离心管、电泳槽等，尽量缩短RNA 在常温或37℃放置时间，电泳使用高电压短时间的程序，每次必须更换新电泳液。

实验间隙中RNA放置在-20℃，过夜或更长时间保存在-80℃。

(2)如同时对多管进行吸去溶液和加入溶液工作，应当按照同样的顺序依次操作，以保证其处理时间基本一致。

避免漏加溶液。

(3)注意所加溶液与胚胎温度的差异，应当先预热再使用。

一般溶液加入量为1mL左右，管平放以使胚胎分散与溶液充分接触，但探针杂交一步溶液过少可竖直放置。

(4)吸取胚胎的枪头应剪去尖端以扩大开口。

吸时动作要轻。

任何时候都要防止丢失胚胎，可在换前一管溶液时将后一管竖直放置让胚胎沉降一会以免吸走。

(5)注意保护标签，并且易混淆标签必须设法分辨(如6和9)。

第一天以下操作需戴乳胶手套。

1 水溶液体系重新处理 (Rehydration)。

1.1吸去恢复到室温的胚胎中的甲醇(MeOH)，用70%, 50%, 30%的 MeOH的PBST溶液依次处理5分钟。

梯度稀释的目的是防止胚胎收缩，可适当多添加几个浓度梯度。

稀释时间宁长勿短。

特别注意保护标签，MeOH为有机溶剂，易腐蚀油性笔书写的标签。

1.2 PBST处理5分钟，两次。

2 蛋白酶消化和随后的固定(Proteinase digestion and post fixation)。

Le 斑马鱼nanos1基因在配子发生中的原位杂交研究

遗!传!"#"$%&’(!)*+,+-."!"!#"#$%&!$&#$!’’$研究报告收稿日期!!’’#(((’"修回日期!!’’$’(!’基金项目!国家%)*计划!国家高技术研究发展计划项目"!编号#!’’(++!!!’"("和国家自然科学基金项目!编号#*’!"’)"$"资助%,-../01234567892:2;<18/9<=>0/?0<@:A /0B 8?7C 2D 79/=/?5E 2:2<0D 7<93F 2G 2=/.@291!;/H !’’(++!!!’"("$;<18/9<=;<1-0<=,D 829D 2I /-93<18/9/A 6789<!;/H *’!"’)"$"&作者简介!陈云贵!(&""’"$男$硕士研究生$研究方向#鱼类分子遗传学通讯作者!宋!平$J K @<8=#.89?:/9?.:"5<7//H D /@H D 9!"斑马鱼#$#%&’基因在配子发生中的原位杂交研究陈云贵(!宋!平(!吕道远(!周!伟(!桂建芳!!(H 武汉大学生命科学院发育生物学教育部重点实验室$武汉#*’’"!(!H中国科学院水生生物研究所淡水生态与生物技术国家重点实验室$武汉#*’’"!"摘!要!利用组织原位杂交技术$以地高辛标记的反义E ;+为探针$检测了斑马鱼!$/-+01*1+0"-/-02(基因在卵子发生及精子发生中的表达分布特点$初步探讨了该基因在斑马鱼配子发生中可能的功能)结果表明#在斑马鱼卵子发生中$-/-02(@E ;+均匀分布于卵原细胞和各时期卵母细胞的胞质中(在卵原细胞和#*$期卵母细胞中$-/-02(@E ;+的杂交信号十分强烈$而较晚期卵母细胞中信号明显减弱)在斑马鱼精子发生中$-/-02(@E ;+可在精原细胞和初级精母细胞中检测到)-/-02(@E ;+的阳性信号在精原细胞中极为强烈$在初级精母细胞中较为微弱$而精子细胞中没有阳性信号)结果初步表明$斑马鱼-/-02(基因对生殖干细胞K 卵原细胞和精原细胞的维持和正常功能可能起着重要作用)关键词!原位杂交(斑马鱼(-/-02((卵子发生(精子发生(生殖干细胞中图分类号!L &$*!!!文献标识码!+!!!文章编号!’!$*M &""!!!’’$"’#M ’$%&M 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:12@D2=="的功能和存活而并非调控其形成%!$&)最近的研究发现$;<9/:蛋白在果蝇幼虫卵巢的>O6:及成虫卵巢中的生殖干细胞中高表达$在分裂增殖中的胞囊细胞也有表达(并证实$;<9/:蛋白在卵子发生中通过阻止生殖干细胞过早分化$来维持其干%"#遗!传!"#"$%&’(!)*+,+-."!’’$!!!!!!!!!!!!!!!!!"卷!细胞自我更新的属性$而不为生殖干细胞之后的卵子发生事件所需%!)&)在斑马鱼中$母源-/-02(E;+也是生殖质组分$在早期胚胎中的表达模式与另一生殖质组分’’’</2/E;+一致$即在>O6:中特异表达)反义吗啡啉实验证明$斑马鱼>O6:的形成并不需要-/-02(基因$但它是>O6:正常迁移*存活及发育必需的%)&)在线虫和小鼠中的研究结果与之一致%#$%&)但至今未见对-/-02基因在鱼类配子发生中的表达和功能研究的报道)本研究结果显示$在斑马鱼卵子发生中$-/-02(@E;+在卵原细胞及#*$期卵母细胞中表达极高(在&*’期卵母细胞中也能检测到其存在(-/-02(@E;+在各时期卵母细胞中都是均匀分布的!图($_*6*F")-/-02( @E;+在卵原细胞中的高表达提示$-/-02(基因在斑马鱼卵巢中可能起着与其在果蝇中相同的作用$即维持生殖干细胞’卵原细胞的自我更新和正常功能)在爪蟾中$-/-02同源物H4/=G!E;+在#期卵母细胞中定位于线粒体云!@81/D7/9308<=D=/-3"%!"&)在卵子发生中$H4/=G!E;+连同生殖质一起迁移至成熟卵母细胞的植物极皮层%(%$!%&$但它在卵子发生中并不翻译%(%&$提示其对卵子发生可能并无直接作用$而是作为母源物质储存在卵母细胞中$在未来胚胎>O6:的发育中起着作用)斑马鱼-/-02(@E;+在#*$期卵母细胞中也有较高表达$较晚期的卵母细胞中也能检测到!图($6*F")斑马鱼卵母细胞中的-/-02(E;+可能同样仅仅作为母源物质$留作调控胚胎>O6:迁移与发育之用$而对卵原细胞之后的卵子发生可能并无调控作用)是否果真如此$还有待研究)精子发生也是一个典型的干细胞系统$-/-02基因在该过程中同样有着重要作用)在-02基因突变雄蝇精巢中$精子束极少甚至没有$在精巢前部积累了比野生型多得多的初级精母细胞$表明这类细胞的分化延迟或受阻(同时-02基因突变雄蝇大多表现出致育缺陷$说明-02基因突变雄蝇的精子发生确实受到影响%!$&)在小鼠中$-02!基因主要在雄性生殖细胞中表达$-02*基因在迁移中的>O6:中表达)-02!基因敲除雄鼠和-02*基因敲除雄鼠的精巢发育不良$重量只有野生型的(+*$#周龄精巢中完全没有生殖细胞%%&)在人类成体组织中$-02(基因只在精巢中表达(在成熟精巢中$ -02(基因在生殖干细胞’精原细胞中表达最高$减数分裂中的初级精母细胞中也有表达$但在减数分裂后的生殖细胞中不表达%&&)本研究结果表明$在斑马鱼精子发生中$-/-02(基因在精原细胞中表达极高$在初级精母细胞中表达较低$在次级精母细胞*精子细胞及精子中不表达!图!$+*F")据此推测$-/-02(基因不仅对于维持生殖干细胞’精原细胞的存活与功能有重要作用$并且在随后的减数分裂中也可能起着调控作用)总之$斑马鱼-/-02(基因在生殖干细胞’卵原细胞和精原细胞中有极为活跃的表达$表明该基因应该对于生殖干细胞的维持与功能有着重要作用)在斑马鱼中$-/-02(基因如何维持生殖干细胞并维持的自我更新与功能还有待继续研究)参考文献#D"3"1"#="&$!%(&!U<9?6$Q27@<99E H;<9/:8:172=/D<=8X23./:1208/032120@8K 9<9189F0/:/.78=<H?*66$(&&($))#)*"!)#"3%!&!>8=/9^$U28:4=<1F+H+9<9/:7/@/=/?89=22D7H$*<*60F G E*-=$(&&"$(!#$(""(!("%’3%*&!^/D78X-[8f$,<9/B$f/4<5<:78,$;8:78@85<K I-g8:<Y<$6$ I-g8:<Y<C H J Z.02::8/9<932G/=-18/9<05D/9:20G<18/9/A9<9/:K 02=<123?292:89B530<H$*<M*-*2"<06$!’’’$!(’$$&(!)’!3 %#&!,-40<@<98<@$f$,253/-ZO H9/:K(<939/:K!$1Y/?292:02=<1K 231/F0/:/.78=<9<9/:$02?-=<12.08@/038<=?20@D2==32G2=/.K @291<93:-0G8G<=89?/*-015/A D+=+2*6*./-23$*<*60F E*-=$ (&&&$(!)$#%)(!#%"(3%$&!Q-8:^/:h-20<$6<05=I/008:1<==$N8S7/-$^<05Q/-f89?H+ @E;+=/D<=8X231/172G2?21<=D/012Z/A H*-0F:2//D512:29K D/32:<.0/1289Y817<-/-02G=8[2X89D A89?203/@<89H$*<*60F G E*-=$(&&*$(("$*""!*%)3%)&!f/.0-9920^$C78::26$C78::2_$E<X J H+X240<A8:79<9/:02K =<123?2928:2::2918<=A/017232G2=/.@291/A.08@/038<=?20@D2==:H M*-*2$*<$!’’($($$!%""!!%%$3%"&!,28[8B<0<?-D78<$^<:<5-[8C:-3<4$,<1/:78f81<g8@<3$N-@8[/ ,<:</[<4$+5<;/@-0<K f81<4<5<:783$f85/:78f-0/[<Y<2$N-K @8[/,<?<H9<9/:(#<@/-:29<9/:?2922Z.02::2389172D29K 10<=920G/-::5:12@8:38:.29:<4=2A/09/0@<=32G2=/.@2913 I*45/-+2E207$*<*60F E*-=$!’’($(!’$"!(!"*(3%%&!^<:<5-[8C:-3<$N-@8[/,<:</[<$^<[/1/f8:/$f-985<+42$ ,28[8B<0<?-D78$,<1/0-f/4<5<:78$N-@8[/,<?<H6/9:20G23 0/=2/A9<9/:.0/1289:89?20@D2==32G2=/.@291H(4+*-4*$ !’’*$*’($(!*&!(!#(3%&&!W<0-X2=:[<W$f/12D[8^$f-:Xf$,.8[+$I80./^$E2922+ E28g/>20<H6/9:20G<18/9/A<>-@8=8/K;<9/:D/@.=2Z A0/@F0/:K&"#!#期!!!!!!!!!!!!陈云贵等#Q2斑马鱼-/-02(基因在配子发生中的原位杂交研究/.78=<?20@.=<:@1/7-@<9?20@D 2==:H $*<M *-*2"<06$!’’*$!(*#(!’!(!)3%(’&6-018:F $C 028420F f $C </I $S <@/02>F $U 8==8<@:/9WE $Q 27@<99E H +66B 6@21<=K 489389?3/@<8989;<9/:8:2::2918<=A /010<9:=<18/9<=02?-=<18/9H "I )NO 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*-=/6)+060.>$!’’’$!("$!!(!!!&"""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""3欢迎订阅%动物学杂志&!!,动物学杂志-是由中国科学院动物研究所*中国动物学会主办的科技期刊$亦是中国自然科学核心期刊)主要报道动物学领域的最新研究成果$介绍有创见的新思想*新学说*新技术*新方法)报道范围既有宏观生态研究$又有微观实验技术)报道层次既有科学前沿性*资料性的$也有技术性*知识性的)稿件内容涉及范围广$实用性强$主要栏目有#研究报告*珍稀濒危动物*技术与方法*研究简报和快讯*科技动态等等)读者对象为动物科学领域的研究*教学*技术*管理人员及广大业余爱好者)根据中国科技信息所信息研究中心!’’#年发表的数据$,动物学杂志-各项统计指标有了很大的提高$除了被国内各大数据库收录外$已分别被国外著名数据库英国,动物学记录-*美国,化学文摘-*俄罗斯,文摘杂志-收录),动物学杂志-双月刊$()开$((!页$每册定价!$元$全年($’元$国内外公开发行)国内邮发代号#!M #!!(国外发行代号!6/32;/H "#_^$%)全国各地邮局均可订阅)如未能在当地邮局订到$可与编辑部直接联系)本刊对在校学生及个人订户"折优惠!直接与编辑部联系订阅")地址#北京市北四环西路!$号,动物学杂志-编辑部!!邮编#(’’’%’(电话#!’(’")!$%(#"$(J K @<8=#g /-09<="8/X H <D H D 9)网址#4803H D 789<g /-09<=H 921H D 9)欢迎投稿*欢迎订阅*欢迎刊登广告)’"#遗!传!"#"$%&’(!)*+,+-."!’’$!!!!!!!!!!!!!!!!!"卷!。

斑马鱼原位杂交实验方案

斑马鱼全胚胎原位杂交技术Form Dr. Kevin第一节原位杂交技术的历史Joseph G. Gall被誉为现代细胞生物学的一位奠基人，他在染色体结构和功能领域作出了杰出贡献，并发明了原位杂交技术（in situ hybridization，ISH）。

自Gall同他的研究生Mary Lou Paudue和Susan Gerbi在1969年利用放射性标记DNA在爪蟾组织切片中检测基因表达后，原位杂交技术逐渐发展为一种能使研究人员在一个染色体上定位并确定出基因和特殊的DNA序列的强大方法，推动了分子生物学的巨大进步。

Kathleen H. Cox于1984年发明了用单链RNA探针进行原位杂交的技术。

ISH技术在斑马鱼中的应用始于Westerfield等利用该技术在斑马鱼切片中检测基因的表达。

同年, Nusslein-Volhard 等将Cox 建立的RNA 原位杂交技术进行了改进, 用地高辛（digoxin）标记的RNA 在斑马鱼胚胎中检测基因表达。

2008 年, Bernard Thisse 等将该技术进一步优化, 使之更敏感, 也提高了基因表达检测的分辨率，我们在这里介绍的整胚原位杂交技术主要参照Thisse实验室2008年版本（Thisse, C. and Thisse, B., 2008, High resolution in situ hybridization on whole-mount zebrafish embryo. Nat. protoc. 3 : 59 –69）。

第二节原位杂交技术的原理原位杂交能在成分复杂的组织中进行单一细胞的研究而不受同一组织中其他成分的影响，因此对于那些细胞数量少且散在于其他组织中的细胞内DNA或RNA研究更为方便；同时由于原位杂交不需要从组织中提取核酸，对于组织中含量极低的靶序列有极高的敏感性，并可完整地保持组织与细胞的形态，更能准确地反映出组织细胞的相互关系及功能状态。

斑马鱼整体原位杂交protocal

整体原位杂交（WISH）（此实验需要全程在摇床上进行）1）胚胎准备，需确定胚胎地具体时间。

2）固定：将收取胚胎用4％PFA室温固定2h（或者4℃过夜）3）PBST漂洗胚胎，2次，5min/次4）分别用50％、100％甲醇溶液胚胎脱水，各1次，5min/次5）更换新鲜100％甲醇，并将胚胎储存在－20℃固定2小时(或过夜)6）复水：分别用甲醇：PBST为3：1，1：1，1：3溶液漂洗胚胎，各1次，5min/次7）用PBST漂洗胚胎2次，5min/次。

8）增加胚胎的通透性：proteinase K（10μg/ml，用PBST稀释）处理胚胎，24hpf胚胎5min，胚胎8min，3dpf胚胎15min，5dpf胚胎27min。

处理过后用，PBST漂洗，然后4％后固定，室温30-40min。

9）用PBST漂洗胚胎2次，5 min/次，同时HB 60℃预热10）预杂交：吸除PBST，加入HB，60℃，5min；更换新鲜HB溶液，60℃，3-4小时，68℃ 10分钟。

11）加探针：取出探针，取出迅速置于冰上；回收HB溶液，加入探针，60℃，过夜12）回收探针（可以重复使用3-5次），储存在－20℃，将50％甲酰胺/2×SSCT及0.2×SSCT 68℃预热，漂洗2次，20min/次13）分别用2×SSCT和0.2×SSCT溶液在68℃漂洗胚胎，各2次，20min/次14）PBST漂洗胚胎，2次，5min/次。

15）封闭：现配2％羊羔血清（PBST稀释）用做封闭，室温至少1h16）抗体：用2％羊羔血清稀释抗体（anti-dig-AP），1：5000，4℃，过夜（或1：2000,RT,2h）17）回收抗体（可以重复3次），用PBST室温下漂洗胚胎，2次，10min/次18）用buffer9.5T溶液孵育胚胎，2次，10min/次，目的是提供碱性条件19）加入NBT/BCIP染液，染色适当时间（20-60min），待信号显现，加PBST终止反应，3次，10min/次20）用4％PFA固定胚胎，室温固定1h后，PBST漂洗2次，10min/次21）将胚胎储存在70％甘油中，4℃保存，备用。

fish原位杂交操作流程

fish原位杂交操作流程下载温馨提示:该文档是我店铺精心编制而成，希望大家下载以后，能够帮助大家解决实际的问题。

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实验模式鱼—斑马鱼的繁殖技术

实验模式鱼—斑马鱼的繁殖技术●陆德祥　(江苏南通农业职业技术学院　226007) 斑马鱼(B rachydanio rerio )原产于印度、孟加拉等国,属鲤科。

是一种亚热带淡水观赏经济鱼类,成鱼体长大约5cm ,呈黄褐色,体表从头到尾覆盖着水平方向的蓝紫色条纹,故又称蓝条鱼。

雄性皮肤偏柠檬色,雌性皮肤偏银灰色,鳍条宽大,发达,外观十分美丽。

繁殖特性:4月龄性成熟,5月龄体成熟,繁殖周期短,一般7天左右,一年四季都可产卵,产卵可达300～1000粒,成活率高。

40日龄即可上市,市场价每条1元左右,成本低,养殖效益较显著,是一种短、平、快的淡水观赏经济鱼类。

斑马鱼除了具有经济、观赏价值外,由于体小、卵大、卵径1～1.5mm ,繁殖周转快,目前已成为研究脊椎动物(包括灵长类)胚胎发育及对外界环境变化,如紫外线、重金属盐类、农药、工业污水、放射性物质等对人类影响的良好研究材料;是一种极好的实验模式鱼;是取代青蛙、果蝇、小白鼠等作为研究对象的优良试验材料;其发展前景十分广阔。

作者通过对斑马鱼两年多的饲养,获得了第一手资料,现将人工繁殖方法介绍如下:1　亲鱼培育饲喂亲鱼的目的是为了获得高质量的受精卵。

饲喂亲鱼用的饲料有活性饲料和配合饲料两种,所饲配合饲料蛋白质应大于40%,粗脂肪大于3.5%,水分低于4%,钙0.9%～1.6%,磷0.8%～1.4%,并添加适量对性腺发育有作用的物质,如V E 、V A 、V D 、微量元素锌等,每天饲喂1～2次。

繁殖季节,每周可增加投喂2～3次枝角类、桡足类,丰年虫或开水烫过并研碎的小鱼、小虾等鲜活饲料。

在饲喂时应注意:①自来水预先存放2～3天。

②水质p H 调到6.5～7.5。

③水的p H7～8。

2　性别鉴定首先看皮肤,偏银灰色的为雌性,偏柠檬色的为雄性。

其次性成熟的雌鱼体形丰满,腹部膨大、松软,仰腹可见有明显的卵巢轮廓,手摸富有弹性。

雄性斑马鱼腹部扁平,身材显得修长。

斑马鱼整体原位杂交的技术改良

Ｏ，ｔｆｐｏｅｎｓｉｅｔｎａｄｓｂｔｔｏｏｒｔｎＳｉｍｅｏｒｔｉａｅＫｄｇｓｉｎｕｓｒｅｃｌｕａｉ．ＴｅｉｒｖｄｈｂｄｚｔｎｒｓｌｈｗｅＳｈｇｐｃｆｉｏａｏｈｍｐｏｅｙｒｉａｉｅｕｔｓｏｄＵｉｈｓｅｉｃ— ｉｏｓｉｔ，ｄｓｉｃｏｏａｉｎａｄｌｗｂｃｇｏｎｎｎｉａｅｒｃｉｌｍｅｈｄｏｅｒｆｈｅｒｏｗｈｌ — ｕｔｉｉｙｙｉｔｔｃｌｒｔｎｏａｋｒｕｄａｄｉｄｃｔｄａｐａｔｔｏｆｚｂａｓｍｂｏｅｍｏｎｎｓｔｈ — ｎｏａｉｙｕ
摘要：斑马鱼整体原位杂交技术广泛应用于基因表达谱、基因间相互关系和突变体筛选等方面，是研究斑马
鱼发育相关基因功能的重要技术。本文从杂交探针的制备、度的选择和洗脱以及胚胎的脱色、白酶Ｋ消浓蛋
化、底物显色等方面进行了摸索、进及简化，得了背景低、色清晰、改获着特异性高的实验结果，预示了简单实
ＦＡＮｎ－ｅＨｏｇｙ，ＰＥＮＧＺｏｇｌ，ＸＥＨｕ－ｉｇ，ＹＡＷｕｚｏｈｎ —ｕＩａｐｎＵＮ —ｈｕ，ＷＡｕ — ｕＮＧＹｅｑｎ，ＤＥＮＧｒｎ，ＷＡｏｇｑ，ＭＯＸｉｏｙｎｕＮＧＹｎ－ｉａ — ａｇ，Ｌｏｇ— ｉｇ，ＩＹｎｑｎＸｉ —ｈｈｕｓａ

斑马鱼相关实验操作

二、斑马鱼的生活和繁殖习性斑马鱼（Danio rerio）为热带鱼类，可在一年内多次产卵。

在合适的养殖条件下，4月龄的斑马鱼即性成熟；性成熟后每1-2周可以产卵一次，一条雌鱼一次可以产出数百颗卵子。

斑马鱼产卵受温度和光照长度的调节。

最适产卵水温为28.5℃，产卵的光调节周期为光照14小时，黑暗10小时。

为防止自然产卵，性成熟的雌、雄斑马鱼必须分开养殖。

斑马鱼具有下列特点：1、繁殖周期短，不受季节限制，容易获得所需要的精子、卵子和胚胎材料。

2、小型鱼类，可在实验室高密度养殖，饲养成本低。

3、是脊椎动物，具有和人类相似的器官和组织。

4、体外受精、体外发育，胚胎培养条件简单。

5、胚胎透明，可以在活体上直接观察器官的发育。

6、发育周期短，在28.5℃温度下培养，受精后24小时即可以形成个体的基本结构。

因此，斑马鱼现在选择作为发育生物学研究的模式动物。

曝气水10L。

性成熟雌、雄性斑马鱼。

2、曝气水将干净的自来水烧开后冷却，将气泵放入其中进行曝气，以为培养胚胎之用。

3、斑马鱼的选取和催产雌雄鱼的鉴别：性成熟的雄鱼体型修长，腹部较小，而雌鱼腹部较大。

选鱼的时间在实验前一天的晚上，在选取斑马鱼之前需要喂食红虫，喂食后1小时才开始选鱼。

斑马鱼整体原位杂交详细步骤

收集斑马鱼的胚胎，在Holfretor水中培养，到达所需要的发育时期时，用蛋白酶去除卵膜，用4%多聚甲醛固定，在4℃保存，二十四小时后用50%甲醇2%多聚甲醛溶液洗，然后换成甲醇，在-20C 保存，待用(两天和两天以上的胚胎需要用双氧水处理，去除色素。

或者使用苯锍脲稀溶液培养，可阻断色素的形成)一. 原位杂交第一天1. 重新水化和固定1）吸取固定好的胚胎，加入50%甲醇的PBST溶液，放置5分钟。

2）置换成30%甲醇的PBST溶液，放置5分钟3）置换成PBST溶液，放置5分钟，重复一次4）置换成4%多聚甲醛的PBS溶液固定20分钟5）用PBST洗两次，每次放置五分钟，室温。

蛋白酶处理与后固定（本实验不做此步）1）用10ul/ml的蛋白酶K在室温下处理胚胎。

5体节以下的胚胎不处理，5体节到24小时的胚胎处理3分钟，24小时以上的胚胎处理5分钟或者更长。

发育时间越短的胚胎越嫩，可以不用或者少用蛋白酶处理，发育时间长的胚胎就需要用蛋白酶来疏松组织，以便于杂交。

2）用PBST溶液轻洗，在PBST中放置5分钟。

3）用4%多聚甲醛的PBS溶液固定20分钟，室温。

4）用PBST洗两次，每次放置五分钟，室温。

2. 预杂交1）每个管中置换成大约300ulHYB－溶液，60℃水浴5分钟，避免振荡。

2）用等体积的HYB+取代HYB－。

3）60℃水浴，预杂交4小时以上。

3. 杂交1）吸去预杂交的HYB+，加上100ul已加入探针的HYB+溶液（探针浓度约为1ng/ul）..2）60℃ 温浴过夜。

注：杂交与预杂交的温度可以是55到60度不等，温度越低，探针结合越好，温度越高，背景越小。

二. 原位杂交第二天1.1）将探针回收，放于－20C保存(通常探针可重复使用十次左右)。

2）加入50%甲酰胺/2XSSCT溶液1毫升，60℃，放置30分钟，重复一次。

3）置换2XSSCT1ml，60℃，放置15分钟。

4）置换0.2XSSCT1ml，60℃，放置30分钟，重复一次。

整胚原位杂交

组织学与病理学技术实验报告实验名称：使用整胚原位杂交方法定位观察斑马鱼胚her4 基因的表达使用整胚原位杂交方法定位观察斑马鱼胚胎her4 基因的表达一、实验目的：1）通过本实验掌握原位杂交的基本原理及方法。

2）观察her4基因在斑马鱼胚胎的表达位置。

二、实验原理：原位杂交是在分子生物学领域应用极为广泛的实验技术之一，是在研究生物体发育过程中的一种极为重要的分子遗传学的研究方法。

字面的意思理解就是说在其原来的天然的位置处杂交。

原位杂交主要是基于以下这个主要原理：单链的DNA或者RNA只要他们的序列是互补的，即符合AT，CG的碱基配对原则，那么这样的两条核酸链之间（DNA-DNA，DNA-RNA，RNA-RNA）就可以形成一个稳定的杂交复合体。

这一原理对于检测一个特异的mRNA在某一种生物体，或者某些组织切片、单个细胞里具体表达位置非常有用。

整胚原位杂交，不同于一般的在载片上对细胞和组织切片进行探针杂交及检测的原位杂交，而是对完整的斑马鱼胚胎进行探针杂交及检测，从整体上把握探针的结合部位，然后对胚胎进行切片，以确定探针结合的具体位置。

整胚原位杂交在斑马鱼分子生物学研究中是一种非常重要的实验方法，原位杂交的探针可以是同位素的探针，用放射自显影来检测；也可以是非同位素的探针，通过荧光或酶法予以检测。

我们这儿所介绍的一种原位杂交的方法是通过后者，以地高辛标记探针，然后用酶联抗体的方法进行检测。

三、实验试剂及仪器1、实验试剂：系统水、4%聚甲醛、PBS溶液、甲醇（70%、50％、30％）、蛋白酶K的PBST溶液（在管中原有的约1mlPBST中加入1 μl 10mg|ml的蛋白酶K，终浓度10 μg|ml）、H2O2（3%H2O2；0.5M NaOH）、PBST溶液、HYB 溶液、RNA探针、50%甲酰胺、2×SSCT溶液、0.2×SSCT溶液、MABT、阻断溶液、羔羊清:MABT=1:9的溶液、AP底物染色缓冲液。

整体原位杂交法初步研究MMP11b在斑马鱼胚胎发育过程中的表达

已经形成，于观察和操作，年来作为整体模式动物已易近引起了广泛的关注Ｊ。目前，ｏｎＹｏｇ和Ｚａｇ等报道ＭＭ９和ＭＭ２在斑马鱼ｈｎＰＰ早期胚胎发育中有重要作用－，Ｍ１ｓ］ＭＰ３在斑马鱼胚胎发育过程中也有相关的文献报道。Ｍ１ｂ能降解细胞ＭＰｌ外基质，肿瘤的血管生成中起促进作用，是有关ＭＭＰ１在但１ｂ在斑马鱼胚胎发育中的表达还没有人报道，文通过斑马鱼本整体原位杂交法初步发现ＭＭＰ１１ｂ在斑马鱼早期胚胎中表达时期和部位，以后深入研究Ｍ１ｂ基因功能和血管新为ＭＰ１
第２第３期７卷２１００年６月
生物学杂志
ＪＯＵＲＮＡＬＯＦＢＩＯＧＹ ห้องสมุดไป่ตู้ ＯＬ
ＶｏＮｏ３Ｌ２７．
Ｊｎ００ｕ，２１
ｄｉ０３６／．ｓｎ１０ｏ：．９９ｊｉｓ．０８—９３．０００．５１６２２１．３０３
基质金属蛋白酶（ａｉｍｔｌｐｏｉａｅＭｔｘｅｌｒｔｎｓ，ＭＭ）一个ｒａｏｅＰ是大家族，因其需要锌等金属离子作为辅助因子而得名。基质
金属蛋白酶来源于多种类型的细胞，可以清除胶原分子、它
关键词：马鱼；质金属蛋白酶１ｂ原位杂交斑基ｌ；

繁殖斑马鱼后代流程

繁殖斑马鱼后代流程1.配鱼：头一天晚上将鱼配上，每个配种盒里放1条雄鱼，1～2条雌鱼。

同品系的鱼自交至少需要配10对，这样保证至少有5对产卵，以保证后代的基因库。

不同品系的鱼（比如与野生型交配）配5对以上，保证至少有3对产卵。

2.收集胚胎：当天早上收集胚胎，挑去其中异物，再用embryomedia 清洗2-3次，放入培养箱。

3.挑选胚胎：胚胎发育4-5小时，移去未受精的卵及死胚。

第二天早上观察，若胚胎发育异常（不是突变体）比率较高（>10%），则丢弃整盘胚胎。

正常的胚胎中每盘取10～20枚左右，混成一盘，再分装成若干盘，每盘20～25枚（这样以后每缸鱼里面都有不同亲本的后代，以保证基因库的大小）。

以后的四天内每日检查胚胎一次，去掉死胚。

4.培养鱼苗：第5天的小鱼放入鱼房烧杯中，加入约200ml 鱼缸水（system water）, 放在标记为（5～12天）架子上。

鱼苗进食有3个阶段：第一阶段草履虫，第二阶段丰年虫+草履虫，第三阶段丰年虫，每一阶段都放在不同的架层上。

放进去后头两天观察一下鱼是否正常进食（可从鱼的肚子来观察），并且注意食物是否过多过少。

在完全换成丰年虫之前要确认小鱼是否已经能吞食丰年虫（肚子是否变红），确认大部分都能吞食丰年虫之后再放到相应的架层上，否则应相应地增加或缩减第二阶段。

经常检查（尤其是刚开始喂食阶段和不同阶段转换的时候一定要检查），用吸管吸除垃圾及死鱼。

5.转入系统：满20天并且绝大多数小鱼能够吃丰年虫3～5天之后，将小鱼转到鱼缸中。

鱼缸上贴上标签，并贴红标签（红标签是提醒阿姨少喂食）。

用深蓝色细网孔后背板，确认后背板与鱼缸之间紧密接触，小鱼不会轻易跑到后背板后面。

转入系统头两天关闭水流，2～3天之后水流成连续滴状为宜，以防小鱼被冲走。

一周之后（此时鱼一个月大），水流进一步增加，但仍要比较小，水流基本垂直落下为宜。

去红标签。

6.分缸：当鱼满1.5个月，视其生长情况可以分缸，分成每缸10条鱼为宜。

荧光原位杂交（FISH）实验步骤

荧光原位杂交（FISH）实验步骤仪器设备1、医用微波炉；2、水浴锅；3、 OLYMPUS BX51荧光显微镜；4、 OLYMPUS DP11数字显微照相机。

FISH试剂（1）1×PBS：由10×PBS溶液稀释而成，储存于4℃；（2）20×SSC（pH7.0）；（3）2×SSC，由20×SSC溶液稀释而成；（4）25mg/ml蛋白酶K消化液。

（5）变性液(70％甲酰胺+2×SSC，pH7.0)：4ml 20×SSC；8ml 蒸馏水；28ml甲酰胺。

每次新鲜配制。

（6）杂交后洗涤液：20×SSC 4ml；蒸馏水16ml；甲酰胺20ml。

每次新鲜配制。

调节pH 前升至室温。

实验步骤1、脱蜡：1）二甲苯脱蜡3次，每次5min；2）100％酒精两次，每次2min；3）移出酒精，斜置切片，标记末段向下，空气干燥。

2、蛋白酶处理:1）每个染色缸40ml蛋白酶K消化溶液，配制方法如下：2×SSC 40ml倒人Facal管，在水浴槽中预热。

将消化酶液加入管内，摇动直到酶溶解。

2）37℃水浴槽中预热染色缸和蛋白酶K溶液。

37℃孵育20min。

3）×SSC在室温下漂洗切片3次，每次1min。

4）梯度酒精脱水（-20℃预冷）。

3、变性：1）每一个立式染色缸配制40ml变性溶液；2）78℃水浴槽中平衡预热混合液染色缸；3）78℃孵育8min；4）即移入-20℃预冷70%酒精的染色缸内2min，再依次移入80%、90%和100%的-20℃预冷酒精内，每缸2min；5）空气干燥。

4、杂交：1）准备探针；2）取一个较大的湿盒，交叉放置切片；3）滴10μl探针在切片的组织上，加盖玻片；4）盖上湿盒盖，37℃孵育12h～16h。

杂交后的水洗：5）镊子小心去除盖玻片；6）43℃预热杂交后水洗溶液40ml水洗切片15min；7）2×SSC(37℃)洗两次，每次10min；8）切片放人染色缸的1×PBS内待检测，勿使切片干燥。

斑马鱼原位杂交实验方案

Kathleen H. Cox于1984年发明了用单链RNA探针进行原位杂交的技术。

ISH技术在斑马鱼中的应用始于Westerfield等利用该技术在斑马鱼切片中检测基因的表达。

同年, Nusslein-Volhard 等将Cox 建立的RNA 原位杂交技术进行了改进, 用地高辛（digoxin）标记的RNA 在斑马鱼胚胎中检测基因表达。