基因工程知识点全

基因工程知识点全

第一章基因工程概述

1.什么是基因工程，基因工程的基本流程？

基因工程（Genetic engineering）原称遗传工程。从狭义上讲，基因工程是指将一种或多种生物体（供体）的基因与载体在体外进行拼接重组，然后转入另一种生物体（受体）内，使之按照人

们的意愿遗传并表达出新的性状。因此，供体、受体和载体称为基因工程的三大要素。

1.分离目的基因

2.限制酶切目的基因与载体

3.目的基因和载体DNA在体外连接

4.将重组DNA分子转入合适的宿主细胞,进行扩增培养

5.选择、筛选含目的基因的克隆

6.培养、观察目的基因的表达

第二章基因工程的载体和工具酶

1.基因工程载体必须满足哪些基本条件？

具有对受体细胞的可转移性或亲和性。

具有与特定受体细胞相适应的复制位点或整合位点。

具有多种单一的核酸内切酶识别切割位点。

具有合适的筛选标记。

分子量小，拷贝数多。

具有安全性。

2.质粒载体有什么特征，有哪些主要类型？

1、自主复制性

2、可扩增性

3、可转移性

4、不相容性

主要类型有 1.克隆质粒 2.测序质粒 3.整合质粒 4.穿梭质粒 5.探针质粒 6.表达质粒 3.质粒的构建

（1）删除不必要的DNA区域，尽量缩小质粒的分子量，以提高外源DNA片段的装载量。一般来说，大于20Kb的质粒很难导入受体细胞，而且极不稳定。

（2）灭活某些质粒的编码基因，如促进质粒在细菌种间转移的

mob基因，杜绝重组质粒扩散污染环境，保证DNA重组实验的安全，同时灭活那些对质粒复制产生负调控效应的基因，提高质粒的拷贝数

（3）加入易于识别的选择标记基因，最好是双重或多重标记，

便于检测含有重组质粒的受体细胞。

（4）在选择性标记基因内引入具有多种限制性内切酶识别及切

割位点的DNA序列，即多克隆接头（Polylinker），便于多种外源基因的重组，同时删除重复的酶切位点，使其单一化，以便环状质粒分子经酶处理后，只在一处断裂，保证外源基因的准确插入。

（5）根据外源基因克隆的不同要求，分别加装特殊的基因表达

调控元件。

4.什么是人工染色体载体？

将细菌接合因子、酵母或人类染色体上的复制区、分配区、稳定区与质粒组装在一起，即可构成染色体载体

5.什么是穿梭载体？

人工构建的、具有两种不同复制起点和选择标记、可以在两种不同的寄主细胞中存活和复制的载体。

6.入-噬菌体载体及构建

-DNA为线状双链DNA分子，长度为48.5kb，在分子两端各有12个碱基的单链互补粘性末端。

1缩短长度提高外源DNA片段的有效装载量删除重复的酶切位

点

引入单一的多酶切位点接头序列，增加外源DNA片段克隆的可操作性

灭活某些与裂解周期有关基因。

使λ-DNA载体只能在特殊的实验条件下感染裂解宿主细菌，以

避免可能出现的污染

现象的发生。

加装选择标记，便于重组体的检测

7.M13单链噬菌体DNA载体

过定点诱变技术封闭重复的重要限制性酶切口。

引入合适的选择性标记基因，如含有启动子、操作子和半乳糖苷

酶氨基端编码序列（lacZ’）的乳糖操纵子片段（lac）、组氨酸操纵子片段（his）以及抗生素抗性基因等。

将人工合成的多克隆位点接头片段插在lacZ’标记基因内部，使得含有重组子的噬菌斑呈白色，而只含有载体DNA的混浊噬菌斑呈蓝色。

（4）在多克隆位点接头片段的两侧区域改为统一的DNA测序引物序列，使得重组DNA分子的单链形式经分离纯化后，可直接

进行测序反应。

8.II类限制性内切核酸酶的特点

限制性核酸内切酶（Restriction endonucleases）是一类能在特异位点上催化双链DNA分子的断裂，产生相应的限制性片段的核酸水解酶。

识别位点的特异性：每种酶都有其特定的DNA识别位点，通常是由4、５或6核苷酸组成的特定序列（靶序列）。

识别序列的对称性：靶序列通常具有双重旋转对称的结构，即双链的核苷酸顺序呈回文结构。

切割位点的规范性：双链DNA被酶切后，分布在两条链上的切割位点旋转对称（可形成粘性末端或平末端的DNA分子）。

同位酶：一部分酶识别相同的序列，但切点不同，这些酶称为同位酶。

同裂酶：识别位点与切割位点均相同的不同来源的酶称为同裂酶

同尾酶（Isocandamers）：识别位点不同，但切出的DNA片段

具有相同的末端序列，这些酶称为同尾酶。

9.甲基化酶

Ⅱ类限制性内切酶有相应甲基化酶伙伴，甲基化酶的识别位点与

限制性内切酶相同，并在识别序列内使某位碱基甲基化，从而封闭该酶切口。甲基化酶在封闭一个限制性内切酶切口的同时，却产生出另一种酶的切口

甲基化酶可修饰限制性核酸内切酶识别序列，从而使DNA免受相应的限制性核酸内切酶的切割。

甲基化酶的用途就是在必要时可以封闭某一限制性核酸内切酶

的酶切位点。

10.DNA连接酶连接作用的特点：

①DNA连接酶需要一条DNA链的3’末端有一个游离的羟基（-OH），另一条DNA链的5’末端有一个磷酸基（-P）的情况下，只有在

这种情况下，才能发挥连接DNA分子的作用。

②只有当3’－OH和5’－Ｐ彼此相邻，并且各自位于与互补链

上的互补碱基配对的两个脱氧核苷酸末端时，DNA连接酶才能将它们连接成磷酸二酯键。

③DNA连接酶不能连接两条单链的DNA分子或环化的单链DNA分子，被连接的DNA链必须是双螺旋DNA分子的一部分。

④DNA连接酶只能封闭双螺旋DNA上失去一个磷酸二酯键所出现

的单链缺口（nick），而不能封闭双链DNA的某一条链上失去一

个或数个核苷酸所形成的单链裂口（gap）。