微生物实验
酵母菌的分离、纯化和酒精发酵
（综合性实验,6学时）
〔目的要求〕
1．掌握倒平板的方法。
2．掌握分离微生物的基本操作技术。
3．测定酵母菌的发酵能力，检验生成的酒精（和CO2）
4．镜检发酵的微生物。
〔基本原理〕
环境中微生物数量多，种类复杂，为了获得某种微生物（酵母菌）的纯培养，可根据该微生物对营养、酸碱度、O2等条件的不同，而供给它适宜的培养条件，或加入某种抑制剂造成只利用此菌生长，而抑制其它菌生长的环境，再通过稀释涂布等方法分离，直至得到纯菌株（酵母菌）。
酒精发酵作用是在厌氧的条件下，主要由酵母菌推动，在酿造过程工业中，酒精发酵是生产酒精及各种酒类的基础。已糖经微生物代谢分解形成酒精并放出CO2的作用，称为酒精发酵。将分离得到的酵母菌进行酒精发酵，测定其酒精发酵力，观察酵母菌形态。
〔实验材料〕
1、培养基：（1）酵母菌的分离：马铃薯培养基或葡萄糖酵母汁蛋白胨培养基（配方见教材）；（2）酒精发酵：酒精发酵培养基。
2、试剂：10%的氢氧化钠、10%硫酸，1%重铬酸钾等。
3、器皿：盛90mL无菌水三角烧瓶、盛9mL无菌水试管、无菌吸管、培养皿、玻璃涂棒、接种环等,艾氏发酵管等。
4、其它：显微镜，接种环，染色液，冲洗瓶、酒精灯、标签等。
5、葡萄。
〔操作步骤〕
一、酵母菌的分离和纯化
（一）酵母菌的富集（教师准备）
1、样品采集：市售葡萄，装入灭菌纸袋，注明编号、时间及来源。
2、增殖培养：用清水将葡萄洗干净，压榨葡萄汁，加10％的葡萄糖置密封瓶25-28℃
培养（发酵）72h。
（二）稀释液的制备及分离、纯化方法
1.倒平板。
2.取发酵液进行10倍洗系列稀释，用划线法和涂布法分离酵母菌。
3.镜检确认为酵母菌后，挑菌置斜面培养基纯化培养（30℃，24－48h）备用。
样品10-110-210-310-410-510-6
30℃24－48h
涂布法
划线法
（纯化）
备土壤制稀释液
稀释涂布平板法平板划线分离法
倒平板（标签）倒平板，待凝固
吸-3、10-4、10-5各0.2mL，10-1中取）
放在相对应的平板中
涂布均匀培养（24h，30℃）
培养（24h，30℃）
挑菌（镜检确认是酵母菌）挑菌（镜检确认是酵母菌）
二、酒精发酵
1、酒精发酵
以无菌操作接种少许啤酒酵母到发酵液中，28～30℃培养24～28h后观察结果。
2、CO2生成检验
（1）观察盲管有无气体，并划上记号，标记其体积；
（2）拔去棉塞，吸5mL发酵液于另一试管备用；
（3）加入10%NaOH，使液面恰达管口，以拇指将管口塞紧，反复倒置摇动，勿使外界空气进入；
（4）NaOH吸收管内CO2，所余气体导入盲管中，拇指慢慢移动，此时育管中液面上升，其上升的空间为CO2所占的空间。
反应式：CO2+NaOH——NaHCO3
3、酒精生成的检验
（1）打开管，嗅闻有无酒精气味；
（2）于2、（2）取出的发酵液中，加入10%H2SO42mL；
（3）加1%重硌酸钾10～20滴，若由橙黄色变为黄绿色，则证明有酒精生成，反应式：
2K2Cr2O7+8H2SO4+3CH3CH2OH→3CH3COOH+2K2SO4＋2Cr2（SO4）3＋11H2O
(重铬酸钾) （乙醇）（乙酸）（硫酸铬）
〔实验报告〕
1、实验结果
（1）在你选用的培养基平板上，描述所分离的酵母菌的菌落特征。
大多数酵母菌的菌落特征与细菌相似，但比细菌菌落大而厚，菌落表面光滑、湿润、粘稠，容易挑起，菌落质地均匀，正反面和边缘、中央部位的颜色都很均一，菌落多为乳白色
（2）纪录酒精发酵的结果。
CO2：
酒精：
2、思考题：
（1）、为什么要将培养皿倒置培养？
1.培养基由液态到固态过程中会产生较多的水蒸气，水蒸气在皿盖上凝结会产生水滴，如果培养皿正置水滴滴下会将菌落冲散不利于细菌的培养和计数。
2.在37度下恒温培养，培养基中的水分易挥发若不将培养皿倒置培养基中的水分散失不利于细菌的生长。
3.平板倒置可减少操作过程中落入培养皿内的灰尘细菌植入培养基发生污染。
（2）在平行划线中，为什么每划完一组平行线都须将接种环上的剩余物烧掉？
因为接种完后，接种环上已经沾染了上一次接种时的细菌，如果不灼烧，下一次接种将会被上一次所沾染的细菌污染
（3）如何证实你分离的微生物是酵母菌？
大多数酵母菌的菌落特征与细菌相似，但比细菌菌落大而厚，菌落表面光滑、湿润、粘稠，容易挑起，菌落质地均匀，正反面和边缘、中央部位的颜色都很均一，菌落多为乳白色
检验co2和酒精
微生物实验专题
正面 侧面 计数室（2个） 每个小格的面积 盖玻片下液体高度 微生物实验专题 一、探究酵母菌的呼吸方式【C 】 （一）、实验原理： 1. 酵母菌是兼性厌氧型生物，无氧和有氧呼吸都产生CO 2，无氧呼吸还能产生酒精。 2. 检测产生CO 2：→可使用澄清石灰水；或溴麝香草酚蓝溶液（现象：蓝→变绿→变黄）。 3．检测酒精产生：→用酸化的重铬酸钾。实验现象：溶液由橙色变为灰绿色。 （二）、实验设计（及方法步骤）：→设计如下图装置进行对照实验： 1. 设计成有氧条件（甲组）与无氧 条件（乙组）进行对照实验。 2. NaOH 溶液的作用是： →除去空气中CO 2，排除对实验干扰。 3. 培养液要进行灭菌，灭菌后的培养液 要冷却后才能接种酵母菌。 4. 进行乙组实验时，必须让B 瓶密封放置反应一段时间，才能将导管连通到澄清石灰水瓶中。 ★其目的是：→消耗掉瓶氧气，防止酵母菌进行有氧呼吸对实验结果的干扰。 5. 实验中要观察甲、乙组澄清石灰水的变化，并检测A 和B 瓶中有无酒精产生。 ★检测酒精时，要将重铬酸钾溶于浓硫酸溶液中进行酸化处理，再加入到被检测溶液中。 （三）、实验结果（现象）及其分析： 1. 甲、乙两组的澄清石灰水都变浑浊，甲组变浑浊快和程度大；说明酵母菌有氧和无氧条件下 都产生CO 2，有氧条件下比无氧条件下产生的CO 2多。注意：据该实验现象不能确定呼吸方式。 2. 检测酒精时，若A 瓶中无酒精产生（检测时不变灰绿），则说明A 瓶酵母菌只进行有氧呼吸； 若B 瓶中有酒精产生（检测时变灰绿）；则说明B 瓶中酵母菌进行了无氧呼吸。 二、探究培养液中酵母菌种群数量的动态变化【C 】 （一）、实验原理： 1. 液体培养酵母菌时，种群的增长受培养液营养成分、空间（含氧量）、温度和pH 等因素的影响。 2. 在理想条件下，酵母菌种群的增长呈“J ”型曲线；在各种资源有限或者存在环境阻力的情况下， 酵母菌种群增长呈“S ”型曲线。◆酵母菌种群数量变化表现为：增长→保持稳定→衰减。 3. 对酵母菌进行观察计数，需要用到血球计数板和显微镜。★血球计数板构造如下图： （二）、实验设计（方法和步骤）： 1. 将10mL 无菌的5%的葡萄糖溶液加入试管。 2. 将酵母菌（干酵母）接种到试管培养液中， 将试管在 28℃条件下连续培养7天。 3. 采用抽样检测法，每天取样测定酵母菌数目， 每天抽测3次，取平均值。 【取样计数的操作方法】 （1）先将盖玻片盖在血球计数板计数室上，再用吸管吸取培养液滴于盖玻片边缘。 ★特别提醒：→吸取培养液前，要振荡几下试管，摇匀培养液（否则数据会偏差较大）。
微生物实验操作
油镜的使用和维护 目的：掌握油镜的使用与维护，熟悉油镜的使用原理。材料：显微镜，拭镜纸，液体石蜡油，二甲苯 原理：油镜的透镜极小，工作焦距最短，光线通过玻璃和空气，由于介质密度不同发生折射，射入镜筒的光线极少，视野暗，物象不清晰。如在玻片与镜头（透镜）之间加上折光率和玻片（n=1.52）相近的香柏油（n=1.515）就可减少光线的折射，加强视野的亮度，获得清晰的物象。 步骤：显微镜油镜的使用和维护 1.将显微镜平稳地安放在实验台适宜处。识别油镜头：标有100×、OIL、HI等字样。 2. 打开电源，用低倍镜对光，打开光圈，调节聚光镜的位置，使视野光线充足。 3. 标本上加镜油一滴，转动粗螺旋，使油镜头缓缓下降，用眼从侧面观察，直到油镜头浸入油中接近玻片为止。 4. 从目镜观察，同时徐徐转动粗螺旋提升，见模糊物象后再用细螺旋调节，直到见到清晰物象为止。 5. 观察完毕，粗螺旋提高镜头，取下标本片，油镜头使用后立即用擦镜纸擦净镜头上的油。如油已干，可在擦镜纸上滴少许二甲苯擦拭，并立即用另一擦镜纸
擦去二甲苯，因二甲苯能溶解镜头上的固定胶以致使镜头脱落。 6.将镜头转呈“八”字，调低聚光器，对号送入柜子内存放。 革兰染色 目的：掌握革兰染色的原理及操作。 材料：干净玻片，接种环，葡萄球菌和大肠杆菌18-24h 培养后的混合菌液，酒精灯，一套革兰染液 原理：主要为细胞壁结构的差异。G+三维肽聚糖结构的交联度大，通透性低，脂质少或无，酒精作用使孔径缩小；而G-肽聚糖为二维疏松结构，薄，外膜含大量脂质，易被酒精溶解，使细胞壁通透性增高，结晶紫-碘复合物被酒精溶解而脱色。 步骤： 1. 细菌标本的制作 （1）涂片：无菌操作。取一接种环混合细菌悬液，涂布成直径约1cm的涂片，涂片应薄而均匀。 （2）干燥：涂片最好在室温中自然干燥。必要时可将标本面向上，放在酒精灯上方微火处干燥。 （3）固定：标本面向上，在酒精灯火焰外焰按钟摆的速度来回通过3次，放置待冷后染色。固定的目的是
完整版防腐挑战实验
第一部分防腐挑战实验调研结果1实验样品 样本要求新鲜，没有被微生物污染，一般每个样本为300go 2微生物挑战性实验 2.1实验菌株 不同国家、组织、企业对挑战实验选择的测试菌种有一定差异（如表 国化妆品、香精和洗涤剂协会（CTFA）推荐的菌种（因其较具代表性，如表更为恰当。（注意菌株来源问题：同属一个种的细菌来源不同，菌株不同，表1 某些国家、组织、企业用于化妆品微生物挑战试验的测试菌株 美国美国英国德国菌株 （药典）（ISP公司）（药典）（Henkel公司）白假丝酵母V V V V 黑曲霉V V V V 红色青霉V 绿色木霉V 绳状青霉 大肠埃希氏菌V V V 镉绿假单胞菌V V V 金黄色葡萄球菌V V V V 粪肠球菌V 产气肠杆菌V 表皮葡萄球菌1）,国内参照美2所示），所以MIC值不同） 德国 （S&M公
日勾维肠杆菌洋葱假单胞菌
肺炎克雷伯氏菌 恶臭假单胞菌 荧光假单胞菌 表2 CTFA化妆品微生物挑战试验的菌株选择 种类菌株数量 革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌 至少选一种 发酵革兰氏阴性杆菌表皮葡萄球菌肺炎克雷伯氏菌 阴沟肠杆菌 大肠埃希氏菌 至少选两种 非发酵革兰氏阴性杆菌 变形菌属 日勾维肠杆菌铜绿假单胞菌洋 葱假单胞菌荧光假单胞菌 至少选一种 酵母 恶臭假单胞菌 黄杆菌属不动杆菌属白假丝酵母 至少选一种 霉菌近平滑假丝酵母 黑曲霉 至少选一种 产芽砲菌 黄绿青霉 枯草芽砲杆菌 供选用 生产现场分离菌适当菌株—*种以上2.2培养基 牛肉膏蛋白月东培养基、琼脂培养基
2.3试验用菌液的配置 （1）标准悬液的配制 1%硫酸9.9ml与1%氯化锁0.1ml,混合后配制成的悬液浓度为3X108clu/ml , 此悬液再做3倍稀释。 （2）细菌菌悬液的配制 实验前将菌株接种到各个培养基斜面上，36摄氏度恒温培养48小时。将己培养好的活性菌种，用灭菌生理盐水清洗到灭菌锥形瓶中，充分振荡摇匀。用移液枪从锥形瓶中吸取菌液作稀释，浊度和标准悬液的浊度（ 3X 108cfu/ml）相同为止； 此时的稀释菌液再做3倍稀释，即为所需的1 X108cfu/ml的菌悬液，做细菌总数确定细菌数。 （3）霉菌菌悬液的配制 将已培养好的活性菌种，用灭菌的生理盐水清洗到灭菌锥形瓶中，充分振荡 摇匀；用移液枪从锥形瓶中吸取菌液作依次的10倍稀释，每次的稀释用血球计 数板计数，必须5个中格的霉菌总数在190?210,落在此范围内的菌悬液为我们所需的1 X 108cfo/ml的霉菌菌悬液，做霉菌总数确定霉菌数。 2.4接种 2.4.1接种方式 （1）单菌接种：每种测试菌株单独做一个挑战试验。这种方法的优点是容易了解每种微生物对防腐体系的敏感性，在筛选产品的防腐体系时有较好的参考价值，但工作量大、费时、费工，和产品的实际污染菌情况也有差距（因来自自然界的微生物常常不是单一的种类）。 （2）混合菌接种：西欧、德国等的许多国家和企业多采用这种方式，除了
简单生物实验设计方案
简单生物实验设计方案 简单生物实验设计方案范文 1 土壤中分离产生-淀粉酶的菌种 一.实验目的 1、学习从土壤中分离、纯化微生物的原理与方法。 2、学习、掌握微生物的鉴定方法。 3、对提取的土样进行微生物的分离、纯化培养，并进行简单的形态鉴定 二.实验原理 -淀粉酶是一种液化型淀粉酶，它的产生菌芽孢杆菌，广泛分布于自然界，尤其是在含有淀粉类物质的土壤等样品中。 从自然界筛选菌种的具体做法，大致可以分成以下四个步骤：采样、增殖培养、纯种分离和性能测定。 1、采样：即采集含菌的样品 采集含菌样品前应调查研究一下自己打算筛选的微生物在哪些地方分布最多，然后才可着手做各项具体工作。在土壤中几乎各种微生物都可以找到，因而土壤可说是微生物的大本营。在土壤中，数量最多的当推细菌，其次是放线菌，第三霉菌，酵母菌最少。除土壤以外，其他各类物体上都有相应的占优势生长的微生物。例如枯枝、烂叶、腐土和朽木中纤维素分解菌较多，厨房土壤、面粉加工厂和菜园土壤中淀粉的分解菌较多，果实、蜜饯表面酵母菌较多;蔬菜牛奶
中乳酸菌较多，油田、炼油厂附近的土壤中石油分解菌较多等。 2、增殖培养(又称丰富培养) 增殖培养就是在所采集的土壤等含菌样品中加入某些物质，并创造一些有利于待分离微生物生长的其他条件，使能分解利用这类物质的微生物大量繁殖，从而便于我们从其中分离到这类微生物。因此，增殖培养事实上是选择性培养基的一种实际应用。 3、纯种分离 在生产实践中，一般都应用纯种微生物进行生产。通过上述的增殖培养只能说我们要分离的微生物从数量上的劣势转变为优势，从而提高了筛选的效率，但是要得到纯种微生物就必须进行纯种分离。纯种分离的方法很多，主要有：平板划线分离法、稀释分离法、单孢子或单细胞分离法、菌丝尖端切割法等。 三.实验材料 1、器材： 小铁铲和无菌纸或袋(可省)、培养皿8个、载玻片、盖玻片、普通光学显微镜、量筒、滴管、吸水纸、无菌水试管5支(每支4.5mL水)、烧杯3个、三角瓶5个、电炉、玻璃棒、接种环、镊子、恒温培养箱、高温灭菌锅、移液枪(枪头10个)、天平、滤纸、pH试纸等。 2、试剂： 配制牛肉膏蛋白胨培养基的原料(牛肉膏0.9g、
(完整word版)微生物挑战性实验方法
微生物挑战性实验方法 1.0目的 新产品防腐效果的测试 2.0 范围 公司新产品 3.0参考： 4 材料与方法 4. 1化妆品中常用的防腐体系[ 6] 营养琼脂培养基、改良马丁琼脂培养基、营养肉汤培养基、 0.9%氯化钠溶液、平皿、接种环、培养箱等 4. 2微生物挑战性实验 4. 2. 1受试用微生物 测试用细菌和霉菌均由浙江省食品和药品检验所提供。细菌包括: 大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草杆菌、巨大芽胞杆菌、绿脓杆菌。霉菌包括: 黑曲霉、黄曲霉、变色曲霉、桔青霉、拟青霉、腊叶芽枝霉、球毛壳霉、绿色木霉。 实验前，将各菌种接种于合适的培养基中, 于37℃( 细菌) 或28℃( 霉菌) 下培养。细菌培养在2天后, 霉菌培养在3-5 天后，挑选适量菌落于灭菌的生理盐水中，制成一定浓度的混合细菌( 1×108个/ ml) 或混合霉菌悬液( 1×107个/ ml) , 置于4℃贮放备用。 4. 2. 2一次加菌的28 天微生物挑战试验 此方法参照美国药典( 第2 1 版) 上微生物挑战性 试验检测防腐剂效果的方法。称取各受试样品30g, 加入混合细菌或混合霉菌悬液, 每克受检膏霜最终含菌量分别为5×106个细菌和3 ×105个霉菌。然后
充分混匀, 置于28℃下。在接菌的0、7、14、2 1 和28天取样分析: 准确称取3g样品, 加到含有玻璃小珠的灭菌锥形瓶内, 加入27ml灭菌生理盐水, 充分震荡混匀, 此悬液为1∶10稀释液；然后再用灭菌生理盐水按10倍依次稀释。按平板倾注法计数受试品中含菌量, 细菌培养是37 ℃下24h～48h，霉菌培养为28℃下3～5 天。此实验用以评判防腐剂的有效与否。评判标准为: 当每克样品中一次接菌( 1×106细菌和1×105霉菌) 后, 在第14天存活菌量减少至不高于起始浓度的0. 1%, 以后逐渐减少, 在28 天为0 。符合标准为防腐剂有效( 通过测试) , 不符合为防腐剂无效(不通过测试)。 分析与检测 4. 2. 3重复3 次加菌的微生物挑战试验此方法参照国际CT FA（国际化妆品、香精和洗涤剂协会）推荐的微生物挑战性试验。称取受试样品30g , 每隔2 周加菌一次( 即实验的第1、3 和5 周) , 每次加细菌量为1 ×106 ～1 ×107个/ g 样品和霉菌1×105个/ g～1×106 个/ g 样品。在加菌后的0 天、7 天和14 天( 后一次加菌前) 采样分析样品中含菌量, 方法同前。此方法可将受检样品分为三类: ( 1)防腐效果优良( W) , 即三次加菌后, 在每次加菌后的第7 天或14 天时, 存活菌量减少至不高于起始浓度的0. 01% ( 即≤100 个/ g或ml）样品, 通过测试) 。 ( 2)防腐效果尚可( M ) , 即三次加菌后, 在每次加菌后的第7 天或14 天时, 存活菌量减少至不高于起始浓度的0. 1%, ( 即≤1000 个/ g 或mL 样品, 通过测试) 。 ( 3)防腐效果差( P) , 即三次加菌后, 在每次加菌后的第7天或14 天时, 存活菌量>mL样品(不通过测试) 。 5、结果判断 受试样品一次加菌和3 次加菌后, 在检测时间内细菌和霉菌的抗腐能力见表1～4。根据两种方法评判标准, 将8 种防腐体系的防腐效果评判列于表5 。从结果看, 两种加菌方法对防腐体系的评判结果基本一致, 三次加菌还可对有效的防腐体系作出程度之区别: 防腐优良( W: We pr eser vative) 和防腐尚可( M :M ar gina preserv ative) 。此外, 在一次加菌后1～2 周内能将样品中含菌量降低至加入菌量的0. 1%, 可通过3 次加菌实验, 如防腐体系5 和8 对细菌
微生物实验室安全操作规范
微生物实验室安全操作规范 微生物实验室的布局和设计应考虑良好的微生物操作和安全。本质是最大程度的减少微生物菌种的交叉污染，微生物样本的处理环境也是重要，因为环境也能引起也污染的可能。规范微生物实验室内仪器、设备的安全操作及染菌的微生物培养物处理程序，保证微生物实验室安全操作意义重大。 一、员工安全操作规范 1、实验室主任（对实验室直接负责的人员）负责制订和采用生物安全管理计划以及安全或操作手册。 2、实验室安全主管（向实验室主任汇报）提供常规的实验室安全培训。 3、接触微生物或含有微生物的物品后，脱掉手套后和离开实验室前要洗手。 4、禁止在工作区饮食、吸烟、处理隐形眼镜、化妆及储存食物。 5、只有经批准的人员方可进入实验室工作区域。实验室的门应保持关闭。 6、实验过程中，严格按有关操作规程操作，降低溅出和气溶胶的产生。 7、每天至少消毒一次工作台面，活性物质溅出后要随时用75%乙醇或巴氏消毒液消毒。
二、高压灭菌锅的安全使用操作规范： 1、堆放：将需灭菌的物品予以妥善包扎，依次堆放在灭菌锅。需灭菌物品外需黏上高压指示胶带以检验灭菌温度是否达到要求。 2、加水：在锅体内注入生活用水，水位一定要超过电热管2厘米以上（不宜过多）；连续使用时，每次操作前，必须补足上述水位，以免烧坏电热管和意外发生。 3、密封：在每次使用高压锅前，都必须认真检查高压锅的出气伐和安全阀，确保其状态完好，如有故障，在故障排除之前不得使用高压灭菌锅。把堆放好物品的灭菌桶放在锅体内，盖上锅盖并锁紧。 4、加热灭菌：将灭菌器接通电源，指示灯亮，表示电源已正常输入，按下开始按纽电热管开始加热工作；灭菌期间工作人员需监视高压锅指示面板上的压力、温度和时间等。 5、开盖：灭菌结束后，切勿立即将灭菌锅内的蒸汽排出，应待压力表指针归零位后，方可开启锅盖。 三、电炉使用操作程序及注意事项： 1、将盛有液体的玻璃容器（应垫石棉网）或不锈钢器皿置于电炉上，方可打开电炉加热。
化妆品微生物挑战试验
化妆品微生物挑战试验 刘树葆臧跃扬桂菊 （天津化妆品科学技术研究皖有强公司） 摘要：本文参照美国化妆品、盥洗用品和香精协会（ＣＴＦＡ）推荐的防腐体系效能评价方法，研究了不同产品在相同防腐条件下，微生物挑战试验结果的差异性。 关键词：防腐体系，微生物挑战试验，膏霜，乳液，水剂。 目前，化妆品琳琅满目，产品配方复杂多样，通常包含多种成分，尤其许多化妆品中的营养成分非常适合微生物的生长，而微生物存在于我们生活着的世界的每一个角落，从而为化妆品的生产和保存带来困难。微生物污染将导致产品在气味、颜色、粘度、性能上都会发生改变。因此化妆品微生物污染对产品质量、正常使用以及使用者健康来说是一个极大的冒险“’。为防止微生物污染，就对产品的防腐提出了挑战，所以必须建立很好的防腐体系，以保证产品的安全、稳定性“’，为消费者提供安全和高品质的产品。 评价化妆品质量的～个重要指标就是微生物是否达到化妆品卫生规范的要求，本实验参照美国化妆品、盥洗用品和香精协会（ＣＴＦＡ）推荐的防腐体系效能评价方法。’，对相同防腐体系不同功能的膏霜、乳液及水剂产品进行微生物挑战试验，以指导配方师合理添加防腐剂。 １．实验方法 ｉ．Ｉ．ＣＴＦＡ推荐的防腐单次挑战试验 ＣＴＦＡ推荐的经典的为期２８天的防腐单次挑战实验，是将防腐剂混入配方基质中，然后～次性接入若干种类、～定数量的微生物进行挑战，将样品存放于适当的温度下，定期抽样检测其中残存的微生物，并根据微生物的数量变化情况评价样品的抗菌效果。 １．２试验仪器 恒温培养箱：霉菌培养箱：显微镜：灭菌平皿：直径为９ｃｍ；ｐＨ计；高压灭菌锅；酒精灯：锥形烧瓶；量筒：灭菌刻度吸管：ｌＯｍｌ、２ｍｌ、ｉｍｌ；试管。 Ｉ．３．培养基和试剂 生理盐水：ＳＣＤＬＰ液体培养基：卵磷脂、吐温８０一营养培养基：乳糖胆盐培养基：蛋白胨水：靛基质试剂：十六烷三甲基溴化铵培养基；绿脓菌素测定用培养基：硝酸盐蛋白胨水培养基：普通琼脂斜面培养基：血琼脂培养基；甘露醇发酵培养基：血浆：孟加拉红培养基。 ｌ＿４挑战用微生物 测试用菌种由天津市卫生防病中心提供，霉菌和杂菌由实验室从污染产品中分离到的菌珠。 菌种包括：金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、肺炎克雷伯氏菌、大肠埃希氏菌。 实验前，将各菌种接种于合适的培养基中，于３７。Ｃ（细菌）和２８℃（霉菌）培养箱中培养。细菌培养４８小时，霉菌培养７２小时后，挑选典型的菌落于灭菌的液体培养基中制成～定浓度的细菌和霉菌混合悬液，置于冰箱冷藏备用。 １．５待测样品 选择了８种化妆品基质，其中膏霜２种、乳液２种、水剂２种。按相同的防腐体系常规方法加入基质中，在进行微生物挑战性实验前预先进行细菌总数及霉菌和酵母菌的测定，试验样品的菌落数均应小于１０，作为待测样品。 １．６接种的方式和数量 接种的方式：采用混合接种。因为自然界的微生物有混生杂居的特点，所以混合接种符合实际污染的情况。 接种的数量：将各菌种接种于合适的培养基中，于３７。Ｃ（细菌）和２８。Ｃ（霉菌培养箱中培养。
微生物学实验
微生物学实验 实验一常用培养基的制备、灭菌与消毒 一、实验目的 了解培养基的配制原理；掌握配制培养基的一般方法和步骤；了解常见灭菌、清毒基本原理及方法；掌握干热天菌、高压蒸汽灭菌及过滤除菌的操作方法。 二、实验原理 培养基是人工按一定比例配制的供微生物生长繁殖和合成代谢产物所需要的营养物质的混合物。培养基的原材料可分为碳源、氮源、无机盐、生长因素和水。根据微生物的种类和实验目的不同，培养基也有不同的种类和配制方法。 牛肉膏蛋白胨培养基是一种应用最广泛和最普通的细菌基础培养基，有时又称为普通培养基。由于这种培养基中含有一般细胞生长繁殖所需要的最基本的营养物质，所以可供微生物生长繁殖之用。 干热天菌、高压蒸汽灭菌方法主要是通过升温使蛋白质变性从而达到杀死微生物的效果。 三、试剂与器材 1.器材试管、三角瓶、烧杯、量筒、玻璃棒、培养基、分装器、天 平、牛角匙、高压蒸汽灭菌锅、pH度纸、棉花、牛皮纸、记号笔、麻绳、纱布、吸管、培养皿、电烘箱、注射器、微孔滤膜过滤器、镊子等。 2.试剂牛肉膏、蛋白胨、NaCl、琼脂 四、实验内容 1.称量→溶化→调pH→过滤→分装→加塞→包扎→灭菌→无菌检查 2.干热灭菌：装入待灭菌物品→升温→恒温→降温→开箱取物 3.高压蒸汽灭菌：加水→装物品→加盖→加热→排冷空气→加压→恒 压→降压回零→排汽→取物→无菌检查 4.过滤除菌：组装灭菌→连接→压滤→无菌检查→清洗灭菌 五、关键步骤及注意事项 1.要严格按配方配制。 2.调pH不要过头。
3.干热灭菌要注意物品不要堆放过紧，注意温度的时间控制，70oC 以下放物、取物。 4.高压灭菌要注意物品不要过多，加热后排除冷空气，到时降压回零 取物。 5.过滤除菌要注意各部件灭菌，压滤时，压力要适当，不可太猛太快， 滤膜要注意清洗保存。 六、思考题 1.培养基配好后，为什么必须立即灭菌?如何检查灭菌后的培养基是 无菌的? 2.在配制培养基的操作过程中应注意些什么问题?为什么? 3.培养微生物的培养基应具备哪些条件?为什么? 4.培养基的配制原则是什么? 实验二土壤中微生物分离纯化培养 一、实验目的 掌握倒平板的方法和几种常用的分离纯化微生物的基本操作技术；了解不同的微生物菌落在斜面上、半固体培养基和液体培养基中的生长特征；进一步熟练和掌握微生物无菌操作技术；掌握微生物培养方法。 二、实验原理 从混杂的微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物的分离与纯化。常用的分离、纯化方法：单细胞挑取法，稀释涂布平板法，稀释混合平板法，平板划线法稀释涂布平板法步骤：倒平板－制备土壤污水稀释液－涂布－培养－挑菌落；平板划线法步骤：倒平板－标记培养基名称－划线。 三、试剂与器材 1.器材盛9m1无菌水的试管、盛90m1无菌水并带有玻璃珠的三角 烧瓶、无菌玻璃涂棒、无菌吸管、接种环、酒精灯、无菌培养皿、显微镜、血细胞计数板等。 2.试剂牛肉膏蛋白胨培养基，高氏1号培养基，查氏培养基 四、实验内容
微生物试验设计
微生物实验设计 一.设计一分离纤维素分解菌的培养基，并说明各营养物质的主要功能（写明成分，不要求定量） 分析：土壤中能分解纤维素的微生物既有细菌，又有真菌，以纤维素分解的细菌为例说明： 1.考虑到碳素营养要求，可以选纤维素为唯一碳源。一是为纤维素分解菌做碳源和能源，二是只能使纤维素分解菌生长，而其它菌不生长，起到选择培养基的作用。 2.根据一般为微生物的要求，除碳源和能源外，还需氮源及其它矿物质营养物，生长因子。氮源可用（NH4）2SO4,生长因子可用酵母膏，矿物质可用K2HPO4,MgSO4,NaCl等。 3.为了维持培养基的pH恒定，可在培养基中加入CaCO3。 所以按以上分析并结合培养基配制经验，我们设计出分离纤维素分解菌培养基配方如下： 纤维素、（NH4）2SO4、K2HPO4,MgSO4,NaCl,CaCO3,酵母膏，水，pH中性。 二.如何从土壤中分离得到一个微生物的纯培养体。 分析：首先要根据分离对象选择适重的培养基，若要分离真菌应选用马丁.孟加拉红选择培养基，若要分离细菌应选择牛肉膏蛋白胨培养基，若要分离放线菌应选用高氏培养基。 土壤取回来之后，用常用的十倍稀释分离法进行稀释分离。若分离细菌一般稀释至10－8，若分离放线菌一般分离至10－4，取最后几个稀释度倒平板，获得单个菌落。 将平板上出现的单菌落转接斜面培养，同时镜检菌体的浓度，若不纯应将培养的
斜面再次进行稀释分离。倒平板获得单菌落。转接斜面培养，同时镜检菌体的浓度，反复几次直到得到菌体单一的菌落放可认为氏某一微生物的纯培养物。 三.采取什么方法可以分离到并利用苯作为碳源和能源物质的细菌纯培养物？ 分析：程序如下： 1.查资料：看是否有人分离该菌的报道从中获得分菌的经验；查苯的化学性质并建立其标准的测量方法，否则无法确定分菌过程中菌的降解效果。 2.采样：一般采集被苯污染的土壤并从中分离目的菌。 3.富集培养:将采到的土样在富集柱上驯化，不断提高土样中苯的浓度，使降解菌在数量上占优势。 4.取适量富集土样在以苯为唯一碳源和能源的无机盐培养基中培养，设对照，生长后测富集液的降解效果，如果好，再适量转接到另一瓶以苯为唯一碳源和能源的无机盐培养基中培养，不断重复直至获得高效的富集液。要注意富集过程中出现的现象变化，关键是苯含量的测定要准确。 5.纯种分离和性能测定：将高效富集液进行稀释涂布，从中挑取单菌落并验证功能，方法是用以苯为唯一碳源和能源的无机盐培养基培养测定其降解效果，找到高效降解菌。 6.进一步验证，并进行传代试验，至少连续30代功能不丧失。 四.如果希望从环境中分离到厌氧固氮菌，该如何设计实验。 用缺乏氮源的选择培养基可用来分离固氮微生物。 1.查资料。看是否有人分离该菌的报道，从中获得分菌的实验。 2.采样
微生物实验操作步骤
微生物试验操作步骤 1.前期准备工作（红色字体需要购买） 10ml离心管（80管）、培养皿（预实验36板，正式试验648板，共计684板）、EP管（预实验36管，正式试验108管，144管）、枪头（5ml、1ml、200ul）、生理盐水现配现用（0.85）2.，灭菌处理 将离心管、枪头、生理盐水、培养基放入高压灭菌锅中灭菌处理后待用。 3.制备不同梯度的样品溶液 预实验 a.梯度稀释试验前一天晚上取置于-80℃盲肠食糜样品于4℃冰箱融化，将需要用到的离心管和EP管分别编号待用。试验期间取盲肠食糜0.5~1g于灭菌后的10ml离心管中，按1：10比例加入生理盐水，制成10-1浓度的样品溶液。然后取0.5ml10-1浓度的样品溶液于下一离心管，按1：10比例加入生理盐水，制成10-2浓度的样品溶液。然后然后取0.1ml10-2浓度的样品溶液于EP管中，按1：1010-3比例加入生理盐水，制成10-3浓度的样品溶液。然后依次如上分别配制10-4、10-5、10-6、10-7、10-8样品溶液。每一次取样前离心管和EP管都要在微型振荡器上震荡混匀。 b.接种和培养：按照平板涂布法进行。分别取各稀释管溶液100μl接种到选择性培养基，大肠杆菌选择性培养基置普通培养箱，37℃培养24h。乳酸菌选择性培养基置5%CO2培养箱，37℃培养48h。双歧杆菌选择性培养基置厌氧发酵罐内，37℃培养48h。沙门氏菌选择性培养基置普通培养箱，37℃培养24h。 c. 微生物计数与鉴定：采用常规微生物平板菌落计数法，选择长有30-300个菌落的平板较为合适，用每克肠道内容物中细菌个数的对数表示( 1gCFU /g) 正式试验 按照预实验操作步骤及适宜梯度进行试验。 4.培养基 总需氧菌营养琼脂（NA）34567 乳酸菌MRS琼脂碱性厌氧234567 双歧杆菌BL琼脂厌氧234567产气袋 大肠杆菌麦康凯需氧234567 沙门氏菌XLD 需氧2345
细菌截留验证指导程序
细菌截留验证程序和方案形成 应使用标准方法确证膜过滤器的微生物截留能力。然而，对于某种产品来说，仅证明缺陷假单胞菌在水溶液中被截留，而不是在特定产品中，不足以验证此产品的除菌过滤工艺。 为了确定正确的挑战测试方法，应将测试微生物直接接种在承载流体（产品或替代品）中以证明其生存性。微生物应以与挑战实验中使用的同等方式培养，以保留其生物形态特征和生理特征。用于生存性研究的测试暴露时间应该等于或超过实际工艺过滤时间。 当测试微生物在产品中的生存性已经完成测试，就应该形成挑战方法和方案了。细菌挑战实验的条件应模拟实际生产工艺。既然细菌挑战实验通常都在实验室里进行，那么方法的规模也应相应调整。通量应调整到每单位面积的流速，表示为基于滤芯表面积的形式(ml/min)/cm2。如果过滤过程按压差控制，则挑战实验压差至少等同于最大工艺压差。如果制订方案过程中遇到关于测试方法可接受性的问题，则建议联系相关管理机构以获取指导。图1列出了在为特定过滤器和产品/工艺组合选择合适的验证策略时需要考虑的关键步骤。 （1）非杀菌性的工艺和流体 直接在产品中接种测试微生物是测试除菌级过滤器微生物截留能力的首 选方法。当产品和工艺流体被证明在产品和工艺条件下没有杀菌效力的时候，这样是可行的。在这些工艺中，应使用足够浓度的挑战微生物在产品中接种，而且要在实际工艺条件下，包括时间、压差、流速和其它关键变量（例如温度），应尽量减少稀释，以避免不必要的产品改变。 （2）抑菌的/杀菌的/非分散的挑战流体 在杀菌性的产品中进行细菌截留测试，使得与验证相关的一些问题更难回答，例如：产品对过滤器有什么影响，产品对其中的生物菌落有什么影响。在杀菌性产品中或是在不利于微生物活性的条件（例如，温度上升）下进行的细菌截留测试不一定能得到正确的结果。 为了评估产品/工艺对过滤器的潜在影响，可以使用产品和实际的工艺条件，包括流速、压差、温度和时间，对过滤器进行预处理。这种预处理可在一个闭路系统中将产品循环通过测试过滤器或者单路通过测试过滤器，接着对滤
微生物实验室要求
微生物检验实验室操作技术要求 第一节实验室管理制度 一、实验室管理制度 1．实验室应制定仪器配备管理、使用制度，药品管理、使用制度，玻璃器皿管理，使用制度，并根据安全制度和环境条件的要求，本室工作人员应严格掌握，认真执行。 2．进入实验室必须穿工作服，进入无菌室换无菌衣、帽、鞋，戴好口罩，非实验室人员不得进入实验室，严格执行安全操作规程。 3．实验室内物品摆放整齐，试剂定期检查并有明晰标签，仪器定期检查、保养、检修, 严禁在冰箱内存放和加工私人食品。 4．各种器材应建立请领消耗记录，贵重仪器有使用记录，破损遗失应填写报告；药品、器材、菌种不经批准不得擅自外借和转让，更不得私自拿出，应严格执行《菌种保管制度》。 5．禁止在实验室内吸烟、进餐、会客、喧哗，实验室内不得带入私人物品，离开实验室前认真检查水、电、暖气、门窗，对于有毒、有害、易燃、污染、腐蚀的物品和废弃物品应按有关要求执行。 6．科、室负责人督促本制度严格执行，根据情况给于奖惩，出现问题立即报告，造成病原扩散等责任事故者，应视情节直至追究法律责任。 二、仪器配备、管理使用制度 1．食品微生物实验室应具备下列仪器：培养箱、高压锅、普通冰箱、低温冰箱、厌氧培养设备、显微镜、离心机、超净台、振荡器、
普通天平、千分之一天平、烤箱、冷冻干燥设备、匀质器、恒温水浴箱、菌落计数器、生化培养箱，电位pH计、高速离心机。 2．实验室所使用的仪器、容器应符合标准要求，保证准确可靠，凡计量器具须经计量部门检定合格方能使用。 3．实验室仪器安放合理，贵重仪器有专人保管，建立仪器档案，并备有操作方法，保养、维修、说明书及使用登记本，做到经常维护、保养和检查，精密仪器不得随意移动，若有损坏需要修理时，不得私自拆动、应写出报告、通知管理人员，经科室负责人同意填报修理申请、送仪器维修部门。 4．各种仪器（冰箱、温箱除外），使用完毕后要立即切断电源，旋钮复原归位，待仔细检查后，方可离去。 5．一切仪器设备未经设备管理人员同意，不得外借，使用后按登记本的内容进行登记。 6．仪器设备应保持清洁，一般应有仪器套罩。 7．使用仪器时，应严格按操作规程进行，对违反操作规程的因管理不善致使仪器械损坏，要追究当事者责任。 三、药品管理、使用制度 1．依据本室检测任务，制定各种药品试剂采购计划，写清品名、单位、数量、纯度、包装规格，出厂日期等，领回后建立帐目，专人管理，每半年做出消耗表，并清点剩余药品。 2．药品试剂陈列整齐，放置有序、避光、防潮、通风干燥，瓶签完整，剧毒药品加锁存放、易燃、挥发、腐蚀品种单独贮存。
微生物方法学验证范本
编码：VP-C01-MM-01 XXXX软膏微生物限度检查 方法学验证方案 起草人：年月日 审核人：年月日 年月日 年月日 批准人：年月日 目录 1.验证立项表 2.验证内容 2.1验证目的 2.2验证范围 2.3 验证要求 2.4 验证方法 2.4.1.试验原料、稀释剂和标准微生物 2.4.2细菌、霉菌及酵母菌验证内容 2.4.3 金黄色葡萄球菌验证内容 2.4.4铜绿假单胞菌验证内容 3. 验证报告 验证立项表（REC） 立项题目 立项部门申请人
申请日期要求完成日期 验证类别负责部门 参与部门及人员 验证原因 质量部审核意见审核人：日期： 验证领导小组 审批人：日期：审批意见 备注 XXXX软膏微生物限度检查方法学验证方案 编码：VP-C01-MM-01品名验证依据2005版药典 规格验证日期年月日数量报告日期年月日验证项目细菌、霉菌及酵母菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌 1.验证目的XXXX软膏配方中含水杨酸、硼酸，该两种物质具有一定的抑菌性。根据《中国药典》（2005年版）微生物限度检查标准规定，对XXXX软膏进行细菌、霉菌及酵母菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌检查方法的验证试验，以确认供试品的抑菌活性及测定方法的可靠性。 2.验证范围本公司XXXX软膏的微生物限度检测。
3.判定标准 3.1验证小组成员 姓名职务职责 组长负责验证方案、报告的批准 项目负责人负责验证方案、报告的起草与具体实施 验证小组成员负责验证试验及填写记录 3.2细菌、霉菌及酵母菌在3次平行试验中，稀释剂对照组的菌回收率（稀释剂对照组的平均菌落数占菌液组的平均菌落数的百分率）应均不低于70%，试验组的菌回收率（试验组的平均菌落数减去供试品对照组的平均菌落数的值占菌液组的平均菌落数的百分率）均不低于70%；产品的试验组与阳性菌组的菌落数差异不超过30%，假定产品试验组的平均值与阳性菌组的平均值之比为Q，则0.7≤Q≤1.3。 3.3金黄色葡萄球菌在3次平行试验中，供试品组：结果应为阴性，未检出金黄色葡萄球菌；试验组：结果应为阳性，检出金黄色葡萄球菌；阴性对照组：结果应为阴性，未检出阴性对照菌；阳性对照组：结果应为阳性，检出金黄色葡萄球菌。 3.4铜绿假单胞菌在3次平行试验中，供试品组：结果应为阴性，未检出铜绿假单胞菌；试验组：结果应为阳性，检出铜绿假单胞菌；阴性对照组：结果应为阴性，未检出阴性对照菌；阳性对照组：结果应为阳性，检出铜绿假单胞菌。 4.验证方法 4.1.试验原料、稀释剂和标准微生物 4.1.1试验样品：XXXX软膏三批，批号为、、。4.1.2稀释剂：PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液。配法：照（05版药典附录XIII C）配制； 0.9%无菌氯化钠溶液的配制：取氯化钠9.0g，加1000ml使完全溶解，分装，灭菌。 4.1.3实验仪器：无菌培养皿（直径9.0cm）、净化室、灭菌锅、无菌刻度吸管（10ml、1ml）,水浴锅，试管（18×180）,具塞三角瓶。 4.1.4验证用培养基营养琼脂培养基、甘露醇氯化钠琼脂培养基、胆盐乳糖培养基、溴化十六烷基三甲铵培养基、玫瑰红钠培养基。 4.1.5验证用微生物名称及编号 菌珠名称传代次数 大肠埃希菌MCC(B)44102 金黄色葡萄球菌CMCC(B)26003 枯草芽孢杆菌CMCC(B)63501
微生物学实验复习题及其答案
微生物学实验复习题 一、选择题 1.革兰氏染色的关键操作步骤是： A. 结晶紫染色 B. 碘液固定 C. 酒精脱色 D. 复染 2.放线菌印片染色的关键操作是： A. 印片时不能移动 B. 染色 C. 染色后不能吸干 D. A和C 3.高氏培养基用来培养： A. 细菌 B. 真菌 C. 放线菌 4.肉汤培养基用来培养: A. 酵母菌 B. 霉菌 C. 细菌 5.无氮培养基用来培养: A. 自生固氮菌。 B. 硅酸盐细菌 C. 根瘤菌 D. A、B 均可培养 E. A、B、C 均可培养 6.在使用显微镜油镜时，为了提高分辨力，通常在镜头和盖玻片之间滴加: A. 二甲苯 B. 水 C. 香柏油 7.常用的消毒酒精浓度为: A. 75% B. 50% C. 90% 8.用甲醛进行空气熏蒸消毒的用量是: A. 20ml/M3 B. 6ml/M3 C. 1ml/M3 9.实验室培养基高压蒸汽灭菌的工艺条件是: A. 121℃/30min B. 115℃/30min C. 130℃/30min
10.巴氏消毒的工艺条件是: A. 62-63℃/30min B. 71-72℃/15min C. A.B. 均可 11.半固体培养基的主要用途是: A. 检查细菌的运动性 B. 检查细菌的好氧性 C. A.B. 两项 12.半固体培养基的琼脂加入量通常是: A. 1% B. 0.5% C. 0.1% 13.使用手提式灭菌锅灭菌的关键操作是: A. 排冷气彻底 B. 保温时间适当 C. 灭菌完后排气不能太快 D. A-C 14.目镜头上的“K”字母表示: A. 广视野目镜 B. 惠更斯目镜 C. 补偿目镜 15.目镜头上的“P”字母表示: A. 平场目镜 B. 广视野目镜 C. 平场补偿目镜 16.物镜头上的“PL”字母表示: A.正低相差物镜 B.正高相差物镜 C.负高相差物镜 17.物镜头上的“UVFL”字母表示。 A. 无荧光物镜 B. 照相物镜 C. 相差物镜 18.镜头上标有“TC”字母的镜头是: A. 相差调整望远镜 B. 摄影目镜 C. 相差目镜 19. “PA”表示: A. 马铃薯培养基 B. 高氏培养基 C. 肉汤培养基 20.无菌室空气灭菌常用方法是: A. 甲醛熏蒸 B. 紫外灯照射
微生物实验设计
麻黄中生物碱的鉴定及其抑菌作用 前言 麻黄（herba ephedrae）为麻黄科草麻黄(Ephedra sinica Stapf.)、中麻黄(Ephedra intermedia Schrenk et C.A.Mey.)或木贼麻黄(Ephedra equisetina Bge.)的干燥草质茎。具有发汗解表、宣肺平喘、利水消肿的作用。麻黄中含有多种生物碱,因产地和品种的不同有一定的差异,一般以麻黄碱和伪麻黄碱为主,此外还含少量甲基麻黄碱、甲基伪麻黄碱和去甲基麻黄碱、去甲基伪麻黄碱。 一、实验目的 1. 掌握培养基的制备，无菌接种等基本手段； 2. 掌握麻黄中生物碱类化学成分的的提取、分离及鉴定技术； 3. 研究及鉴定麻黄体生物碱外抑菌作用。 二、实验原理 根据中药化学成分与溶剂间“极性相似相溶”的原理，依据各类成分溶解度的差异，选择对所提成分溶解度大、对杂质溶解度小的溶剂，依据“浓度差”原理，将所提成分从药材中溶解出来的方法。 离子交换树脂法：利用生物碱盐能够交换到强酸型阳离子树脂柱上，将麻黄
草的酸性水提液通过离子交换柱，用酸性液洗脱，由于麻黄碱的碱性比伪麻黄弱，可先从树脂柱上洗脱下来，从而使两者达到分离。 三、实验仪器与材料 1. 材料：麻黄、阳离子交换树脂、平皿、接种环、恒温干燥箱、定性滤纸、 试管、镊子、棉拭子蘸、移液管、高压锅、生化培养箱等 2. 菌种：金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、绿脓杆菌、志贺氏痢疾杆菌 3. 所需培养基：营养肉汤培养基、营养琼脂培养基及牛肉膏汤琼脂培养基。 四、实验步骤 1. 麻黄中生物碱的提取、分离、鉴定 1.1麻黄中生物碱提取、分离 2.1麻黄中生物碱鉴定 （l）氯化汞沉淀反应麻黄中生物碱在氯化汞的乙醇溶液中发生反应生成黄色沉淀，加热后沉淀变为红色。在同样条件下，与氯化汞反应生成白色沉淀。这是因为甲基麻黄碱的碱性较强，加热时能使氯化汞转变成氧化汞（砖红色），而去甲基麻黄碱生物的碱性较弱，与氯化汞反应只能生成白色的分子复盐沉淀。 （2）Vitali反应麻黄中生物碱以甲基麻黄碱和去甲基麻黄碱生物碱分子结构为主，当用发烟硝酸处理时，发生硝基化反应，生成三硝基衍生物（黄色），若再与醇钠溶液反应，发生分子内双键重排，生成醌型结构的衍生物而呈深紫色，渐转暗红色，最后颜色消失。 2. 麻黄生物碱外抑菌作用 2.1 抑菌环直径大小的测定（琼脂扩散法） 2.1.1 麻黄溶液配制称取麻黄10 g，加注射用生理盐水至20 mL
微生物实验室技术操作规范
实验室技术操作规范 一、无菌操作要求 食品微生物实验室工作人员，必须有严格的无菌观念，许多试验要求在无菌条件下进行，主要原因：一是防止试验操作中人为污染样品，二是保证工作人员安全，防止检出的致病菌由于操作不当造成个人污染。 1.接种细菌时必须穿工作服、戴工作帽。 2. 进行接种食品样品时，必须穿专用的工作服、帽及拖鞋，应放在无菌室缓冲间，工作前经紫外线消毒后使用。 3. 接种食品样品时，应在进无菌室前用肥皂洗手，然后用75％酒精棉球将手擦干净。 4. 进行接种所用的吸管，平皿及培养基等必须经消毒灭菌，打开包装未使用完的器皿，不能放置后再使用，金属用具应高压灭菌或用95%酒精点燃烧灼三次后使用。 5. 从包装中取出吸管时，吸管尖部不能触及外露部位，使用吸管接种于试管或平皿时，吸管尖不得触及试管或平皿边。 6. 接种样品、转种细菌必须在酒精灯前操作，接种细菌或样品时，吸管从包装中取出后及打开试管塞都要通过火焰消毒。 7. 接种环和针在接种细菌前应经火焰烧灼全部金属丝，必要时还要烧到环和针与杆的连接处，接种结核菌和烈性菌的接种环应在沸水中煮沸5min，再经火焰烧灼。 8. 吸管吸取菌液或样品时，应用相应的橡皮头吸取，不得直接用口吸。 二、无菌间使用要求 1. 无菌间通向外面的窗户应为双层玻璃，并要密封，不得随意打开，并设有与无菌间大小相应的缓冲间及推拉门，另设有0.5-0.7m2的小窗，以备进入无菌间后传递物品。 2. 无菌间内应保持清洁，工作后用2%-3%煤酚皂溶液消毒，擦拭工作台面，不得存放与实验无关的物品。 3. 无菌间使用前后应将门关紧，打开紫外灯，如采用室内悬吊紫外灯消毒时，需30W紫外灯，距离在1.0m处，照射时间不少于30min，使用紫外灯，应注意不得直接在紫外线下操作，以免引起损伤，灯管每隔两周需用酒精棉球轻轻擦拭，除去上面灰尘和油垢，以减少紫外线穿透的影响。 4. 处理和接种食品标本时，进入无菌间操作，不得随意出入，如需要传递物品，可通过小窗传递。 5. 在无菌间内如需要安装空调时，则应有过滤装置。 三、消毒灭菌要求 微生物检测用的玻璃器皿、金属用具及培养基、被污染和接种的培养物等，必须经灭菌后方能使用。 1．灭菌前准备 （1）所有需要灭菌的物品首先应清洗晾干，玻璃器皿如吸管、平皿用纸包装严密，如用金属筒应将上面通气孔打开。 （2）装培养基的三角瓶塞，用纸包好，试管盖好盖，注射器须将管芯抽出，用纱布包好。
(完整版)防腐挑战实验.doc
第一部分防腐挑战实验调研结果 1实验样品 样本要求新鲜，没有被微生物污染，一般每个样本为300g。 2微生物挑战性实验 2.1 实验菌株 不同国家、组织、企业对挑战实验选择的测试菌种有一定差异（如表1），国内参照美国化妆品、香精和洗涤剂协会（CTFA ）推荐的菌种（因其较具代表性，如表 2 所示），所以更为恰当。（注意菌株来源问题：同属一个种的细菌来源不同，菌株不同，MIC 值不同）表 1 某些国家、组织、企业用于化妆品微生物挑战试验的测试菌株 美国美国英国德国德国菌株 (药典 ) (ISP 公司 ) (药典 ) (Henkel 公司 ) (S&M 公司 ) 白假丝酵母√√√√√ 黑曲霉√√√√√ 红色青霉√ 绿色木霉√ 绳状青霉√ 大肠埃希氏菌√√√√ 镉绿假单胞菌√√√√ 金黄色葡萄球菌√√√√√粪肠球菌√ 产气肠杆菌√ 表皮葡萄球菌√ 日勾维肠杆菌√ 洋葱假单胞菌√√
肺炎克雷伯氏菌√恶臭假单胞菌√荧光假单胞菌√ 表 2 CTFA 化妆品微生物挑战试验的菌株选择 种类菌株数量 金黄色葡萄球菌 革兰氏阳性菌至少选一种 表皮葡萄球菌 肺炎克雷伯氏菌 阴沟肠杆菌 发酵革兰氏阴性杆菌大肠埃希氏菌至少选两种 变形菌属 日勾维肠杆菌 铜绿假单胞菌 洋葱假单胞菌 荧光假单胞菌 非发酵革兰氏阴性杆菌至少选一种 恶臭假单胞菌 黄杆菌属 不动杆菌属 白假丝酵母 酵母至少选一种 近平滑假丝酵母 黑曲霉 霉菌至少选一种 黄绿青霉 产芽孢菌枯草芽孢杆菌供选用生产现场分离菌适当菌株一种以上
2.2 培养基 牛肉膏蛋白胨培养基、琼脂培养基 2.3 试验用菌液的配置 （1）标准悬液的配制 1%硫酸 9.9ml 与 1%氯化钡 0.1ml，混合后配制成的悬液浓度为3×108cfu/ml ，此悬液再做 3 倍稀释。 （2）细菌菌悬液的配制 实验前将菌株接种到各个培养基斜面上，36 摄氏度恒温培养48 小时。将已培养好的活性菌种，用灭菌生理盐水清洗到灭菌锥形瓶中，充分振荡摇匀。用移液枪从锥形瓶中吸取菌液作稀释，浊度和标准悬液的浊度（3× 108cfu/ml ）相同为止； 此时的稀释菌液再做 3 倍稀释，即为所需的 1×108cfu/ml 的菌悬液，做细菌 总数确定细菌数。 （3）霉菌菌悬液的配制 将已培养好的活性菌种，用灭菌的生理盐水清洗到灭菌锥形瓶中，充分振荡摇匀；用移液枪从锥形瓶中吸取菌液作依次的10 倍稀释，每次的稀释用血球计 数板计数，必须 5 个中格的霉菌总数在190～ 210，落在此范围内的菌悬液为我 们所需的 1×108cfu/ml 的霉菌菌悬液，做霉菌总数确定霉菌数。 2.4 接种 2.4.1 接种方式 （1）单菌接种：每种测试菌株单独做一个挑战试验。这种方法的优点是容 易了解每种微生物对防腐体系的敏感性，在筛选产品的防腐体系时有较好的参考 价值，但工作量大、费时、费工，和产品的实际污染菌情况也有差距（因来自自 然界的微生物常常不是单一的种类）。 （2）混合菌接种：西欧、德国等的许多国家和企业多采用这种方式，除了