微生物实验

酵母菌的分离、纯化和酒精发酵

（综合性实验,6学时）

〔目的要求〕

1．掌握倒平板的方法。

2．掌握分离微生物的基本操作技术。

3．测定酵母菌的发酵能力，检验生成的酒精（和CO2）

4．镜检发酵的微生物。

〔基本原理〕

环境中微生物数量多，种类复杂，为了获得某种微生物（酵母菌）的纯培养，可根据该微生物对营养、酸碱度、O2等条件的不同，而供给它适宜的培养条件，或加入某种抑制剂造成只利用此菌生长，而抑制其它菌生长的环境，再通过稀释涂布等方法分离，直至得到纯菌株（酵母菌）。

酒精发酵作用是在厌氧的条件下，主要由酵母菌推动，在酿造过程工业中，酒精发酵是生产酒精及各种酒类的基础。已糖经微生物代谢分解形成酒精并放出CO2的作用，称为酒精发酵。将分离得到的酵母菌进行酒精发酵，测定其酒精发酵力，观察酵母菌形态。

〔实验材料〕

1、培养基：（1）酵母菌的分离：马铃薯培养基或葡萄糖酵母汁蛋白胨培养基（配方见教材）；（2）酒精发酵：酒精发酵培养基。

2、试剂：10%的氢氧化钠、10%硫酸，1%重铬酸钾等。

3、器皿：盛90mL无菌水三角烧瓶、盛9mL无菌水试管、无菌吸管、培养皿、玻璃涂棒、接种环等,艾氏发酵管等。

4、其它：显微镜，接种环，染色液，冲洗瓶、酒精灯、标签等。

5、葡萄。

〔操作步骤〕

一、酵母菌的分离和纯化

（一）酵母菌的富集（教师准备）

1、样品采集：市售葡萄，装入灭菌纸袋，注明编号、时间及来源。

2、增殖培养：用清水将葡萄洗干净，压榨葡萄汁，加10％的葡萄糖置密封瓶25-28℃

培养（发酵）72h。

（二）稀释液的制备及分离、纯化方法

1.倒平板。

2.取发酵液进行10倍洗系列稀释，用划线法和涂布法分离酵母菌。

3.镜检确认为酵母菌后，挑菌置斜面培养基纯化培养（30℃，24－48h）备用。

样品10-110-210-310-410-510-6

30℃24－48h

涂布法

划线法

（纯化）

备土壤制稀释液

稀释涂布平板法平板划线分离法

倒平板（标签）倒平板，待凝固

吸-3、10-4、10-5各0.2mL，10-1中取）

放在相对应的平板中

涂布均匀培养（24h，30℃）

培养（24h，30℃）

挑菌（镜检确认是酵母菌）挑菌（镜检确认是酵母菌）

二、酒精发酵

1、酒精发酵

以无菌操作接种少许啤酒酵母到发酵液中，28～30℃培养24～28h后观察结果。

2、CO2生成检验

（1）观察盲管有无气体，并划上记号，标记其体积；

（2）拔去棉塞，吸5mL发酵液于另一试管备用；

（3）加入10%NaOH，使液面恰达管口，以拇指将管口塞紧，反复倒置摇动，勿使外界空气进入；

（4）NaOH吸收管内CO2，所余气体导入盲管中，拇指慢慢移动，此时育管中液面上升，其上升的空间为CO2所占的空间。

反应式：CO2+NaOH——NaHCO3

3、酒精生成的检验

（1）打开管，嗅闻有无酒精气味；

（2）于2、（2）取出的发酵液中，加入10%H2SO42mL；

（3）加1%重硌酸钾10～20滴，若由橙黄色变为黄绿色，则证明有酒精生成，反应式：

2K2Cr2O7+8H2SO4+3CH3CH2OH→3CH3COOH+2K2SO4＋2Cr2（SO4）3＋11H2O

(重铬酸钾) （乙醇）（乙酸）（硫酸铬）

〔实验报告〕

1、实验结果

（1）在你选用的培养基平板上，描述所分离的酵母菌的菌落特征。

大多数酵母菌的菌落特征与细菌相似，但比细菌菌落大而厚，菌落表面光滑、湿润、粘稠，容易挑起，菌落质地均匀，正反面和边缘、中央部位的颜色都很均一，菌落多为乳白色

（2）纪录酒精发酵的结果。

CO2：

酒精：

2、思考题：

（1）、为什么要将培养皿倒置培养？

1.培养基由液态到固态过程中会产生较多的水蒸气，水蒸气在皿盖上凝结会产生水滴，如果培养皿正置水滴滴下会将菌落冲散不利于细菌的培养和计数。

2.在37度下恒温培养，培养基中的水分易挥发若不将培养皿倒置培养基中的水分散失不利于细菌的生长。

3.平板倒置可减少操作过程中落入培养皿内的灰尘细菌植入培养基发生污染。

（2）在平行划线中，为什么每划完一组平行线都须将接种环上的剩余物烧掉？

因为接种完后，接种环上已经沾染了上一次接种时的细菌，如果不灼烧，下一次接种将会被上一次所沾染的细菌污染

（3）如何证实你分离的微生物是酵母菌？

大多数酵母菌的菌落特征与细菌相似，但比细菌菌落大而厚，菌落表面光滑、湿润、粘稠，容易挑起，菌落质地均匀，正反面和边缘、中央部位的颜色都很均一，菌落多为乳白色

检验co2和酒精