[28]蝉花真菌的分离及液体发酵培养

当归与“莲花归 ”RAPD 分析
马 毅 1 ,丁永辉 23 (11兰州大学药学院 ,甘肃兰州 730000; 21甘肃省食品药品监督管理局 ,甘肃兰州 730000)
参考文献
[ 1 ] 冯立才 1 上海天马山蝉花的初步研究 1 上海应用技术 学院学报 , 2002, 2 (2) : 1251
[ 2 ] 蒲垫龙 ,等 1 昆虫真菌学 1 合肥 :安徽科学技术出版 社 , 1996: 3361
[ 3 ] 戴芳澜 1真菌的形态和分类 1北京 :科学出版社 , 1987: 921
含淡黄白色粉即为孢子 。 312 从浙江杭州云栖竹径采集的蝉花 ,分离得到 真菌 ,以子座芽和孢子得率高 ,且几乎没有杂菌污 染 。将分离得到的纯培养物经微室培养 ,初步定为 拟青霉属蝉拟青霉 。 313 蝉花真菌可以离开寄主人工培养 。参照虫草 真菌的液体发酵方法 ,经三种培养基筛选 ,以培养基 中含有蚕蛹粉 、鸡蛋等动物源成分效果较好 ,可能提 供了真菌寄主体内类似的激素等促进因子有关 。 314 含动物蛋白成分的发酵培养基上蝉拟青霉生 长较快 ,发酵 2天后醪液稠 ,前 36 h耗糖速度快 , 72 h耗氮速度快 ; pH 先下降后缓慢升高 ; 96 h后培养 基所含糖氮量有所回升 ,可能是由部分菌丝自溶引 起 ,但菌丝湿重未明显下降 。此时发酵罐适宜补充 糖氮以提高产量 。摇瓶培养应在 96 h及 时终止以 收获菌丝 。 315 培养基含蚕蛹粉和鸡蛋等动物源性成分 ,培 养成本偏高 。探索以其他成分替代使蝉花发酵工艺 更接近工业化生产 。至于发酵蝉花真菌是否具有与 蝉花相同的功效有待进一步研究 。
蝉花是真菌寄生于竹蝉若虫体内形成的复合 体 ,由于生长特定的环境和寄主 ,故资源稀少 ,再加 上长期采挖资源日趋枯竭 ,已成为一种稀世良药 。 采用人工培养该有广阔前景 。 1 材料与方法 111 材料 蝉花于 2004 年 7 月采自浙江杭州云 栖竹径 。 112 培养基
分离培养 基 : 土 豆 15% , 葡 萄 糖 2% , 蛋 白 胨 012% , 酵 母 膏 012% , K2 HPO4 011% , M gSO4 0105% ,琼脂粉 115%。121℃灭菌 20 m in〔1〕。
(2005 - 07 - 11收稿 2005 - 11 - 20修回 )
100
中药材第 29卷第 2期 2006年 2月
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96 5175 417 1135 1165 15192
108 6156 413 1135 1164 21175
图 1 蝉花真菌的发酵曲线 (左纵坐标轴表示 pH、菌浓 、湿重 、滤液糖量 ,右纵坐标轴表示滤液含氮值 )
形成疏散的孢子头 ,或连成叠瓦状链 ,孢子增多后易 成堆 聚 集 。初 步 鉴 定 为 拟 青 霉 属 的 蝉 拟 青 霉 Paecilom yces cicadae〔1, 2〕。 212 液体培养基筛选 种子培养接种后于 25℃ 180 r/m in振荡培养 4天 ,以 10%接种量转种到发酵 培养基中 25℃ 180 r/m in振荡培养 15天 。隔天取样 测定菌丝湿重 ,结果显示培养基 3 在第 5 天的菌丝 湿重显著高于其它培养基 。第 5 天菌丝收率 :培养 基 1为 23 g /L;培养基 2为 59 g /L;培养基 3为 159 g /L。 213 发酵工艺 蝉花真菌在发酵培养基 3 培养 , 定时取样测定 pH值 、菌丝体湿重 ,用菲林法和甲醛 法分别测定培养基多糖和氨基氮 ,并绘制发酵曲线 见图 1。
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时间 ( h) —■—PH —◆—菌浓 —Ξ—湿重 —▲—滤液糖 —Ε—滤液 N
0 5121 011 0106 515 59108
Isola tion and Ferm en ta tion Culture of Fung i from C o rdyceps sobofife ra CHENG Dong2qing, D ING Zhi2shan, L IN M ei2ai, PAN Pei2lei, CHEN Yi2tao
液体种子培养基 :土豆 15% ,葡萄糖 2% ,蛋白 胨 012% , 酵 母 膏 012% , K2 HPO4 011% , M gSO4 0105% ,每 250 m l锥形瓶装 50 m l。 121℃灭菌 20 m in。
液体发酵培养基 : 11马铃薯 20%、蔗糖 20%、水 1000 m l; 21玉米粉 66 g、麸皮 160 g、酵母粉 20 g、蔗 糖 130 g、水 1000 m l; 31鸡蛋 110 g、蚕蛹粉 30 g、 VB1 2片 、M gSO4 ·7H2 O 015 g、K2 HPO4 1g、水 1000 m l。三种发酵培养基均用 250 m l锥形瓶装 100 m l, 121℃灭菌 20 m in。 113 蝉花真菌的分离培养
子座芽分离 :从僵虫头顶切下子座芽 ,无菌水洗 净 , 011%升汞 2～3 m in,无菌水洗净 ,切取中间部位 组织块接入培养基 ,置 25℃培养 ,待菌落长成直径 012～015 cm 时 ,挑选少量菌丝反复在平板培养基 上分离纯化 2～4次 ,确定无其它杂菌后移入试管培 养保存 。
孢子分离 :用透明袋套住蝉花 (花蕾 ) ,让孢子 弹射粘贴到纸袋上 , 然后将纸袋浸入 25%葡萄糖 液 ,洗下孢子 。取 011 m l原液 ,加入 1 m l无菌水和 1 m l 011%NaC lO ,两分钟后加入无菌水 ,离心洗涤 3 次 ,加入 25%葡萄糖溶液 ,置 25℃培养 。每天镜检 , 当孢子萌发时 ,用微吸管吸单个孢子滴于平板中培 养。 114 真菌鉴定 采用微室培养法观察鉴定 。 115 种子发酵液培养 种子瓶接入蝉花真菌菌苔 1 ×1 cm2 , 25℃180 r/m in振荡培养 4天 。 2 结果 211 分离与鉴定 从僵虫体 、子座芽和孢子均分 离纯化得到真菌 。子座芽和孢子的分离率为 100% 且未见杂菌污染 ,僵虫体分离效果略差 。子座芽和 孢子在分离培养基上均容易生长 ,菌落生长于 48 h 左右即可见 ,起初星状放射生长 、菌丝平伏 ,菌丝逐 渐呈白色绒毛状 ,菌落白色 、圆形隆起 ,表面有细小 水珠 ,以后中间颜色加深 ,呈紫色 。
·栽培与育种 ·
蝉花真菌的分离及液体发酵培养
程东庆 ,丁志山 ,林美爱 ,潘佩蕾 ,陈宜涛 (浙江中医学院生命科学系 ,浙江杭州 310053)
摘要 目的 :探讨蝉花真菌分离及液体发酵培养 。方法 :从蝉花僵虫体 、子座芽 、孢子分离真菌 ,并采用三种液 体培养基考察菌丝收率 。结果 :分离得到的蝉花真菌经鉴定为拟青霉属的蝉拟青霉 。在含蚕蛹粉 、鸡蛋等动物性 成分的液体培养基中培养 4天 ,菌丝收率 135 g /L。结论 :从蝉花分离得到的蝉拟青霉 ,可用液体发酵培养 。
24 3198 219 0179 2185 41144
36 4121 314 0192 1194 39126
48 4152 319 1106 1179 33142
60 4183 411 1113 1173 28195
72 5136 414 1129 1169 18176
ห้องสมุดไป่ตู้
84 5154 417 1133 1164 16136
关键词 蝉花 ;拟青霉 ;分离 ;培养 中图分类号 : R28212 文献标识码 : B 文章编号 : 100124454 (2006) 0220099203
《本草纲目 》记载 :蝉花出蜀中 ,其蝉上有一角 , 如花冠状 。蝉花产于江苏 、浙江 、福建 、四川 、云南等 地 ,性寒 ,味甘 ,无毒 。民间用于治疗视物不明 、小儿 惊风夜啼等症 。蝉花含丰富的蛋白质 、氨基酸 、真菌 多糖及生理活性物质 ,有抑制肿瘤 、镇痛退热 、镇静 明目等多种功能 ,且有降低血压 、减慢心率 、抗疲劳 、 抗应激及提高免疫力 。
僵虫体分离 :洗净虫体表面 ,用 011%升汞溶液 和 75%乙醇消毒 ,无菌水漂洗 3 次 ,选取胸足为界 的前段部分 ,用解剖刀切去表皮 ,避开消化道 ,取血
腔菌丝切成芝麻粒大小 ,接 入分离培养基 。于 25℃ 培养 ,待菌落长至 012～015 cm 时 ,挑选少量菌丝反 复在分离培养基上纯化 2～4次 ,确定无其它杂菌后 移入试管培养保存 。
生长较快 ,于发酵 2 天后醪液稠 ,瓶壁有菌黏 附 ,呈紫色 。从发酵曲线可见 :前 36 h耗糖速度快 , 接着速度减缓 ;前 72 h耗氮速度快 ,后减慢 。前 24 h pH 降低 ,接着缓慢升高 ; 96 h后培养基所含糖氮 量有所回升 ;菌丝湿重 、菌浓 (100 m l发酵液 3000 r/ m in离心 15 m in后 ,沉淀菌体体积 ) 84 h后增加不 明显 ;菌浓 96 h后略有下降 。菌丝收率为 135 g /L。 3 讨论 311 蝉花为一味古老的名贵药材 ,与冬虫夏草同 属虫菌复合体 。竹蝉若虫被真菌侵入 ,近老熟前 ,体 腔内充满蝉花菌菌丝 。6月下旬老熟若虫从土中钻 出地面羽化 。被菌寄生的竹蝉从通气孔道中向上爬 行 、至通气孔口 。此时正是雨季 ,温度 、湿度适宜真 菌繁殖 ,很快白色菌丝围裹竹蝉若虫全身 ,并从若虫 头顶长出孢子梗 ,呈分枝 ,形似花蕾 。孢子梗分枝富
用微室培养孢子极易萌发 ,先成芽管随后发展 成菌丝 , 4 d后形成大量分生孢子 。产孢细胞单生 或簇生于营养菌丝或孢子梗上 ,一般基部柱形或膨 大 ,向上变成细长管状 ,少数锥形 。分生孢子长形 ,
基金项目 :浙江省青年教师资助计划 (71003015)
中药材第 29卷第 2期 2006年 2月
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( Zhejiang College of Traditional Chinese M edicine, Hangzhou 310053, China) Abstract Object: To study the fungi isolated from Cordyceps sobolifera and its fermentation culture. M ethods: The fungi was iso2 lated and identified by its hypha and spores1 Three liquid media were used in the culture1 Results: Pure culture was gained and the fungi was identified to be Paecilom yces cicadae1 The fungi can grow best in liquid media: egg 110 g + silkworm powder 30 g + VB1 2 tablets +M gSO4 ·7H2O 015 g + K2 HPO4 1g + H2O 1000 m l, in which every litre can p roduce 135 g wet hypha after cultured 4 d1 Conclution: Paecilom yces cicadae from Cordycep s sobolifera can be cultured in liquid media1 Key words Cordyceps sobolifera; Paecilom yces cicadae; Isolation; Fermentation culture