乙型肝炎病毒核酸定量检测操作程序

乙型肝炎病毒(HBV)实时荧光定量PCR

乙型肝炎病毒（HBV）实时荧光定量PCR[目的要求]掌握血清中HBV-DNA的提取方法及原理；HBV-DNA实时荧光定量PCR的测定原理；HBV-DNA实时荧光定量PCR实验操作及结果分析了解核酸测定引物设计原理；实时荧光定量PCR仪的工作原理及操作。

[教学时数]讲授2学时，实验6学时。

[讲授内容]血清中病毒DNA的提取方法和原理；实时荧光定量PCR的测定原理；核酸测定引物设计原理；HBV-DNA测定引物设计思路；HBV-DNA荧光定量PCR试剂组成、相应作用及反应混合液配制；实时荧光定量PCR仪的工作原理及操作[实验内容]分组提取血清中HBV-DNA；配制反应液并上机操作，实时观察，结果分析；实验结果讨论；实验总结[自学内容]“感染性疾病的分子诊断”实验指导（自编）实验乙型肝炎病毒（HBV）实时荧光定量PCR【原理】Real time PCR 是普通PCR 的一项改进，使用了针对扩增DNA 的荧光物质，使得DNA 的数量与检测到的荧光强度成线性关系，大致得到DNA 的扩增曲线，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。

即对DNA靶分子的起始拷贝数进行定量的核酸检测。

该方法精确、灵敏、特异性强、污染途径小、自动化程度高、操作简单。

是国际公认的核酸分子定量的标准方法。

它已逐渐代替了Northern blotting 以及semi RT-PCR技术。

本实验从HBV携带者或者乙型肝炎患者血清中抽提HBV基因组DNA，采用核酸扩增结合TaqMan荧光探针技术, 利用一对乙肝病毒特异性引物和一特异性结合于扩增区另一位点的TaqMan探针, 实现对乙肝病毒模板的扩增和检测。

使用商品化试剂盒：HBV实时荧光定量试剂盒，深圳匹基公司（PG，Biotech.）。

针对表面抗原S基因，设计一对引物和一个探针。

TaqMan荧光探针技术中，两个荧光染料标记在探针上，一个叫报告基团（R），一个叫淬灭基团（Q）。

当两个荧光基团都连在探针上时，报告基团的荧光被淬灭基团抑制。

乙肝病毒核酸定量SOP

1、目的采用PCR技术、实时荧光探针技术，用于临床血清或血浆标本中的乙型肝炎病毒核酸的定量检测，或用于乙型肝炎的辅助诊断和抗病毒药物治疗中的疗效观察。

2、原理本试剂盒采用乙型肝炎病毒(HBV)-核酸释放剂快速裂解、释放血清或血浆样本中的乙型肝炎病毒(HBV)DNA,利用针对乙型肝炎病毒(HBV)核酸保守区设计的一对特异性引物、一条特异荧光探针，配以PCR反应液，在荧光定量PCR仪上，应用实时荧光定量PCR检测技术，通过荧光信号的变化实现乙型肝炎病毒(HBV) DNA的定量检测。

整个试验过程无须单独提取样本中的DNA，只需将血清或血浆样本直接加入PCR反应管中与乙型肝炎病毒(HBV) -核酸释放剂充分混合即可作为PCR扩增的模板，避免了常规样本核酸提取过程中的环境污染。

PCR检测体系含有UNG酶+dUTP防污染措施，将可能的产物污染充分降解，避免假阳性结果。

PCR检测体系含有阳性内对照（乙型肝炎病毒（HBV）内标），通过检测内标是否正常来监测待测样本中是否具有PCR抑制物，避免PCR假阴性。

PCR检测体系含有内参比荧光ROX，用于校正加样误差和管间差异，便于仪器自动分析报告荧光与内参比荧光ROX的比值，使定量更准确。

3、试剂保存及有效期试剂应避光密闭保存于-20±5℃。

试剂盒有效期为12个月，避免反复冻融。

采用泡沫加冰运输5天不会影响产品效期。

4、样本要求4.1. 适用样本类型:血清或血浆样本。

4.2. 样本采集:4.2.1 血清样本采集:用无菌注射器抽取受检者静脉血2ml, 注入无菌收集管，室温不超过4小时，待样本自行析出血清，或直接室温1600rpm离心5分钟分离出血清，转移到1.5ml灭菌离心管中备用；4.2.2血浆样本采集:用无菌注射器抽取受检者静脉血2ml,注入含有EDTA或枸橼酸钠抗凝剂的无菌收集管，立即轻轻颠倒混匀，室温不超过4小时，待样本自行析出血浆，或直接1600pm离心5分钟分离出血浆，转移到1.5ml灭菌离心管中备用。

《乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、人类免疫缺陷病毒(1 2型)核酸检测试剂盒(PCR-荧光法)操作规程》.

乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、人类免疫缺陷病毒（1+2型）核酸检测试剂盒（PCR-荧光法）操作规程1.目的规范核酸检测试验操作，确保检测结果的准确性。

2.原理2.1 汇集：吸取8份（或以下）样品到指定的汇集管。

2.2提取：病毒核酸提取的方法为磁珠法。

试剂盒提供之内对照(IC)为不具感染性的假病毒，在进行样品核酸提取前加入样品中，监控提取、扩增和分析的全过程。

标本经裂解液处理后会将病毒外鞘膜破坏，蛋白质变形，使病毒裂解释放出病毒基因组核酸。

加入表面包被有二氧化硅的磁珠颗粒，在高盐环境下带负电荷的核酸吸附到带正电荷的的磁珠颗粒表面。

洗液可以洗去未结合的物质，如变性的蛋白、细胞碎片、PCR抑制物等并降低盐浓度。

纯化的病毒在特定的环境下从磁珠颗粒表面洗脱下来成为扩增的模板。

2.3扩增：采用PCR扩增TaqMan荧光探针标定技术同时对HBV（DNA）、HCV（RNA）、HIV（RNA）进行检测。

在反转录酶的作用下HCVRNA、HIVRNA反转录成cDNA，再与HBVDNA一同通过TaqDNA聚合酶的作用扩增病毒核酸的保守区域，TaqDNA聚合酶5`—3`外切酶活性切割反应系统中带荧光标记的TaqMan探针，随着PCR的进行，荧光信号不断积累。

通过PCR仪的检测血液标本达到和超过荧光阈值的信号给出样品的阴阳性结果。

选择性PCR扩增：采用UNG-dUTP抗污染系统。

在PCR扩增系统中采用UTP代替TTP，产生大量U-DNA片段。

UNG酶特异识别U-DNA片段中含UTP的位点并进行切割，U-DNA被降解后不能作为再次扩增的模板，系统选择性的扩增天然的核酸分子，从而防止了PCR扩增产物的污染。

2.4 质量控制原理为监控实验进行，保证实验结果的准确，在每次检测过程依靠阳性、阴性质控品以及内标进行监测。

2.4.1阴性质控品监控系统性假阳性，如果阴性质控品检测结果为阳性，说明实验存在假阳性的风险，因此实验中的阳性结果需复查。

《乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、人类免疫缺陷病毒(1+2型)核酸检测试剂盒(PCR-荧光法)操作规程》

乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、人类免疫缺陷病毒（1+2型）核酸检测试剂盒（PCR-荧光法）操作规程1.目的规范核酸检测试验操作，确保检测结果的准确性。

2.原理2.1 汇集：吸取8份（或以下）样品到指定的汇集管。

2.2提取：病毒核酸提取的方法为磁珠法。

试剂盒提供之内对照(IC)为不具感染性的假病毒，在进行样品核酸提取前加入样品中，监控提取、扩增和分析的全过程。

标本经裂解液处理后会将病毒外鞘膜破坏，蛋白质变形，使病毒裂解释放出病毒基因组核酸。

加入表面包被有二氧化硅的磁珠颗粒，在高盐环境下带负电荷的核酸吸附到带正电荷的的磁珠颗粒表面。

洗液可以洗去未结合的物质，如变性的蛋白、细胞碎片、PCR抑制物等并降低盐浓度。

纯化的病毒在特定的环境下从磁珠颗粒表面洗脱下来成为扩增的模板。

2.3扩增：采用PCR扩增TaqMan荧光探针标定技术同时对HBV（DNA）、HCV（RNA）、HIV（RNA）进行检测。

在反转录酶的作用下HCVRNA、HIVRNA反转录成cDNA，再与HBVDNA一同通过TaqDNA聚合酶的作用扩增病毒核酸的保守区域，TaqDNA聚合酶5`—3`外切酶活性切割反应系统中带荧光标记的TaqMan探针，随着PCR的进行，荧光信号不断积累。

通过PCR仪的检测血液标本达到和超过荧光阈值的信号给出样品的阴阳性结果。

选择性PCR扩增：采用UNG-dUTP抗污染系统。

在PCR扩增系统中采用UTP代替TTP，产生大量U-DNA片段。

UNG酶特异识别U-DNA片段中含UTP的位点并进行切割，U-DNA被降解后不能作为再次扩增的模板，系统选择性的扩增天然的核酸分子，从而防止了PCR扩增产物的污染。

2.4 质量控制原理为监控实验进行，保证实验结果的准确，在每次检测过程依靠阳性、阴性质控品以及内标进行监测。

2.4.1阴性质控品监控系统性假阳性，如果阴性质控品检测结果为阳性，说明实验存在假阳性的风险，因此实验中的阳性结果需复查。

乙肝dna检测规程模板

乙型肝炎病毒核酸扩增荧光定量检测标准操作程序1.目的：明确乙肝病毒核酸定量检测的操作规程，指导检验人员正确进行乙肝病毒核酸定量的检测。

2.适用范围：2.1适用于进行乙肝病毒核酸定量检测的检验人员。

2.2适合仪器：LightCycler型核酸扩增荧光检测仪2.3方法原理：采用PCR方法结合荧光探针的扩增技术2.4样品要求：血清3.职责：实验操作人员应严格按操作规程进行实验。

4.试剂来源：中山大学达安基因股份有限公司HBV DNA荧光PCR检测试剂盒。

5.质控物：阴性、阳性对照及阳性参控品系列均来源于试剂盒6.标准操作：6.1 试剂准备（在试剂准备区操作）6.1.1将试剂盒及其它所需试剂置室温解冻（Taq酶为液态试剂，临用前取出，用后立即放回冰格），完全融解后混匀。

6.1.2根据当次实验标本量，取出相应试剂总的需求量于一管中（其余随即放回原温度保存），如所需要的管数为n (n=标本数+1管阴性对照+1管阳性对照+1管临界阳性对照+4管阳性参控品)（定性检测无需做阳性参控品），取PCR反应管，转移至样本制备区。

6.2 样本制备及加样（在标本制备区操作）6.2.1 取血清标本40ul，或阴阳性对照标准品各10ul（强阳性标准品使用前加入稀释液90ul 混匀），加等量DNA提取液打匀，（提取液内含不溶于水的物质，取样时需用加样器充分混匀后吸取。

如出现因吸头嘴部太细不能吸取或取样后填满吸头的现象，可先用洁净无污染的剪刀将吸头嘴部剪去一截）。

沸水浴10分钟，转至4℃静置8-12小时以保证病毒颗粒充分裂解。

6.2.2 10000rpm离心5分钟，取上清液2ul直接加入到PCR反应管中，6000rpm离心数秒。

6.2.3 将各反应管带入PCR仪。

6.3 PCR扩增（在扩增区操作）按仪器使用说明或标准操作程序操作。

扩增条件如下：93℃→2分钟预变性93℃30秒→55℃60秒（40个循环）6.4 结果判断：6.4.1 2个阴性对照的Ct值应无数值，1个强阳性对照的Ct值应小于等于30，1个临界阳性对照的Ct值应大于阳性对照的Ct值，并小于等于38，否则实验视为无效。

乙肝病毒(HBV)PCR检测

乙肝病毒（HBV）PCR检测
试剂盒组成
DNA提取液：裂解病毒蛋白外壳，使病毒DNA游离
PCR反应管：含有扩增HBV特异DNA片段的引物、 dNTPs、Taq酶、PCR缓冲液、Mg2＋等，只需加入模板即可进行扩增反应。
阳性模板：纯化的HBV －DNA，无病毒外壳，无感染性，直接加入PCR反应管扩增后用作阳性对照。
加好样的PCR反应管放入PCR扩增仪的反应板上，扩增程序：
（1）93ºC 3分钟预变性（2）三步循环：
93ºC 45秒（变性） 55ºC 45秒（复性）共35个循环 72ºC 1分钟（延伸）
（3）72ºC 保温5分钟（防止延伸不完整）
3. 电泳检测：直接取PCR反应产物加入2％琼脂糖凝胶上电泳 20分钟，EB染色后在紫外灯下观察，若在314bp 处（与阳性对照处于同一位置）出现条带，则怀疑为HBV阳性。
1. 标本处理：每六人一组，取血清40ul加入0.5离心管，再加入 40ulDNA提取液，沸水浴10分钟，10000rpm离心 5分钟，上清用于扩增反应。
2. PCR反应：每两人一组其中一人取一PCR反应管，取1步骤离心后的上清2ul，加入PCR反应管底层溶液中，6000rpm离心数秒。另一人取一PCR反应管，取阳性模板2ul加入加入 PCR反应管底层溶液中，6000rpm离心数秒。
扩增人ß – actin特异片段
每两人一组ห้องสมุดไป่ตู้在一0.5离心管中加入以下组分：
模板
4ul
引物
2ul
dNTPs
1ul
Taq酶
0.5ul
10×PCR缓冲液 2.5ul
ddH2O
15ul
（反应体系为25ul）
（所发0.5ml离心管已加好除模板以外的所有组分，请加入4ul昨日所提取的基因组DNA溶液即可进行扩增）

PCR实验室操作流程

乙型肝炎病毒（HBVDNAPCRABI7300)检侧标准操作程序一、INFORMATIONFORTEST检测信息项目名称乙型肝炎病毒核酸方法聚合酶链反应方法依据卫生部《全国临床检验操作规程》第三版（2006)第七篇第六章第一节二、ANALYTICALPRINCTPLE检测原理聚台酶链式反应（PCR〕可对特定核苷酸片段进行指数级的扩增，而实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团,利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。

在实时荧光定量PCR反应中，引入了一种荧光化学物质，荧光物质有两种：荧光探针和荧光染料.我们目前是使用TaqMan荧光探针的检测原理:PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。

探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5’一3’外切酶活性将探针酶切降解,使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成,荧光信号强度也等比例增加（图一）。

这样就可以通过荧光强度变化监测产物量的变化，从而得到一条荧光扩增曲线图。

三、操作步骤（一）试剂配制1、进入试剂准备区，开启冰箱冷冻层取出HBV—DNA检测试剂盒。

查看外包装盒（包括生产批号、有效期)，无误后拆开试剂盒，取出核酸提取液、反应液及Taq酶（核对核酸提取液、HBVPCR反应液及Taq 酶管上批号与试剂外包装盒批号是否一致)(图1）,不一致则不可使用，需更换新的试剂。

室温平衡20min，完全融化后2000rpm离心备用。

2、核酸提取液的分装(1）取0.5ml离心管架置于超净工作台内（开机前用紫外线消毒30分钟）,用右手拿起镊子逐个将离心管放入离心管架（注意应夹住离心管外壁，不能碰到管内壁)，摆放顺序为横列从左往右摆，竖列为从上往下隔行排，离心管个数为n(n=样本数+对照品+质控品).完成后将镊子放回原位（图2）.(2)用移液器准确吸取核酸提取液50ul分装至0。

乙型肝炎病毒(HBV)核酸定量检测标准操作规程

乙型肝炎病毒（HBV）核酸定量检测标准操作规程（PCR-荧光探针法）1.目的: 规范乙型肝炎病毒（HBV）核酸定量检测操作流程，保证检测结果的准确性。

2.应用范围: HBV DNA 荧光定量检测。

3.职责:3.1 文件编写：实验室技术员。

3.2 文件审核：实验室主管。

3.3 文件审批：实验室主任。

3.4 执行：PCR实验室所有工作人员。

4. 参考文献：4.1 中山大学达安基因股份有限公司乙型肝炎病毒（HBV）核酸定量检测试剂盒（PCR-荧光探针法）说明书。

4.2 中山大学达安基因股份有限公司核酸扩增荧光检测系统DA7600型使用说明书。

5. 内容：5.1 检测方法：PCR-荧光探针法。

5.2 实验原理：用一对乙型肝炎病毒特异性引物和一条乙型肝炎病毒特异性荧光探针，配以PCR反应液、耐热DNA聚合酶（Taq酶）、核苷酸单体（dNTPs）等成分，通过PCR体外扩增法，即高温变性、低温退火、适温延伸进行DNA扩增，并对PCR全过程进行实时监测，从而定量检测乙型肝炎病毒DNA。

5.3 性能参数：5.3.1 精密度：检测下限为5.0x102IU/ml。

5.3.2 线性范围：1.0x103～1.0x108IU/ml。

5.4 标本采集：由合作单位按照以下要求进行采集5.4.1 标本类型：血清。

5.4.2 标本采集：用一次性无菌注射器抽取受检者静脉血2毫升，注入无菌的干燥玻璃管，室温（22～25℃）放置30～60 min，全血标本可自发完全凝集析出血清，或直接使用水平离心机，1500 rpm离心5min；吸取上层血清，转移至1.5ml灭菌离心管。

5.4.3 标本保存：标本可立即用于测试，也可以保存于-20℃待测，保存期为6个月，应避免反复冻融。

5.4.4 运送条件：标本运送采用0℃冰壶。

5.4.5 标本拒收标准：污染、严重溶血、脂血类或肝素抗凝剂标本。

5.5 设备和试剂：5.5.1 设备： DA7600荧光定量PCR仪、低速水平离心机、生物安全柜、台式高速离心机、移液器、混匀器、恒温水浴箱/干式恒温器、冰箱（4℃、-20℃）、移动/固定紫外灯、冷冻离心机。

乙型肝炎病毒核酸定量检测试剂盒(PCR-荧光探针法)操作说明

5 3
1 弱阳性血清对照 100μl/管 0 1 定量校准品 1 号 15μl/管 7 1 （7.5×10 IU/ml） 1 定量校准品 2 号 15μl/管 6 2 （7.5×10 IU/ml） 1 定量校准品 3 号 15μl/管 5 3 （7.5×10 IU/ml） 1 定量校准品 4 号 15μl/管 4 4 （7.5×10 IU/ml） 1 定量校准品 5 号 15μl/管 3 5 （7.5×10 IU/ml）注：不同批号试剂盒中各组份不能互换。自备实验耗材：适用规格的离心管、微量移液器等。
乙型肝通用名称：乙型肝炎病毒核酸定量检测试剂盒(PCR-荧光探针法) 英文名称：Diagnostic Kit for Quantification of Hepatitis B Virus DNA (PCR-Fluorescence Probing) 【包装规格】 32 人份/盒【预期用途】乙型肝炎病毒是乙型病毒性肝炎的病原体，具有较强传染性，传播途径复杂，流行面广，发病率高等特点，可导致急慢性乙型肝炎，淤胆型肝炎，严重的可导致急性肝衰竭，临床上主要表现为肝功能损害，部分患者可有黄疸。隐形感染较为常见。目前临床上常用的 HBV 检测方法主要有酶免疫法、化学发光法检测 HBV 标志物和核酸检测 HBV DNA 方法。本试剂盒定量检测人血清和血浆样本中的乙型肝炎病毒 DNA，主要是通过对乙肝患者血中 HBV DNA 基线水平和变化情况的监测，用于评估抗病毒治疗的应答和治疗效果监测。检测结果仅供临床参考，不能作为患者病情单独的评价指标，必须结合临床表现和其他实验室检测指标对患者病情进行评价，亦不能作为血液筛查 HBV 病毒的筛查试剂使用。【检验原理】本品基于 TaqMan 探针实时荧光 PCR 技术。在 PCR 反应过程中，同时利用 Taq 酶的 5’→3’聚合酶活性和核酸外切酶活性，使得 TaqMan 探针降解，荧光报告基团和淬灭基团分离使得荧光信号发射， FAM 荧光检测乙型肝炎病毒， JOE/RED 610 nm 波长通道检测内参。本品使用外源性内参，可以监控和避免由于样本中的 PCR 抑制物或操作不当引起的“假阴性”结果。【主要组成成份】每个反应组份名称装量主要成份中的用量 1 2 3 4 5 6 7 8 9 核酸提取液 A 核酸提取液 B 内参 MgCl2 PCR缓冲液A Taq酶 HBV引物探针阴性对照阳性血清对照 3×1.1ml/管 2×1ml/管 160μl/管 450μl/管 480μl/管 160μl/管 320μl/管 100μl/管 100μl/管 100μl 50μl 3μl 13μl 15μl 5μl 10μl －－－ 7 μl 7 μl 7 μl 7 μl 7 μl 聚乙二醇、 NaCl NaOH、SDS、Tween-20、 Chelex-100 合成病毒 MgCl2 Buffer、dNTPs Taq酶、UNG酶 HBV 引物和探针，内参引物和探针 HBV 阴性血清 HBV 阳性血清 HBV 阳性血清寡核苷酸片段寡核苷酸片段寡核苷酸片段寡核苷酸片段寡核苷酸片段【储存条件及有效期】-20℃保存12个月。探针若单独储存，应注意避光。【适用仪器】本品适用于 AB 7300/7500/Mx3000P/LightCycler 480/SLAN 实时荧光定量 PCR 仪。【样本要求】用一次性的针筒抽取病人静脉血 1ml，置于灭菌的一次性试管中室温自然凝固或 800～1600g 离心 20 分钟，取分离出的血清 0.2ml 左右送检。血清标本 2～8℃可放置 72 小时，-70℃可长期保存，标本不宜反复冻融。【检验方法】 1. 试剂配制按样本数（样本数＝待检血清样本数＋血清对照品 3 个＋定量校准品 5 个）n 配制反应液：取 PCR 缓冲液 A n×15μl、HBV 引物探针 n×10μl、Taq 酶 n×5μl、MgCl2 n×13μl 至于一离心管中混匀；低速离

乙肝dna检测的操作规程

乙肝dna检测的操作规程
乙肝DNA检测的操作规程主要包括以下步骤：
1. 采集血液样本：通过抽取受检者的静脉血液来获取样本。

建议在空腹状态下进行抽血，以提高检测的准确性。

2. 提取DNA片段：利用特定的设备和技术，如EV卸电泳、PCR等，从血液样本中提取出乙肝病毒的DNA片段。

这一步骤是检测的关键环节，需要使用精密的仪器和专业的操作。

3. 比对和分析：将提取出的DNA片段与标准样本进行比对，通过特定的检测方法，如荧光定量PCR、基因测序等，分析DNA片段的特性和序列，以确定乙肝病毒的种类和复制程度。

4. 得出检测结果：根据比对和分析的结果，得出乙肝病毒DNA的定量或定性检测结果。

通常情况下，检测结果会以数字或阴阳性方式呈现。

5. 报告与解读：将检测结果整理成书面报告，并提供给医生或受检者。

医生根据检测结果判断受检者是否感染乙肝病毒，以及病毒的复制程度和传染性。

受检者应遵循医生的建议进行相应的治疗或监测。

需要注意的是，乙肝DNA检测是一项高技术含量的实验，需要由经过专业培训的医务人员进行操作。

同时，乙肝病毒的检测结果解读需要结合其他相关检查结果和临床表现进行综合分析，因此最好在医生的指导下进行。

hbv_dna检测的基本流程

hbv_dna检测的基本流程1. 样本采集
- 静脉血液采样
- 正确标识并保存样本
2. 样本预处理
- 离心分离血浆
- 提取血浆中的核酸
3. 核酸扩增
- 使用聚合酶链式反应(PCR)技术
- 扩增hbv_dna靶序列
4. 扩增产物检测
- 实时荧光定量PCR检测
- 凝胶电泳检测
5. 结果分析
- 根据ct值或带型分析结果
- 判断hbv_dna是否存在及含量水平
6. 报告出具
- 对检测结果进行解读
- 出具规范的检测报告
整个流程需要在无菌条件下进行操作,严格控制质量,确保检测结果的准确性和可靠性。

hbv_dna检测结果是判断肝炎病毒感染状态及疗效评估的重要依据。

HBV-DNA检测标准操作程序

2.3 吸取已编号的待测血清或血浆样本、试剂盒中的阴性对照、强阳性对照、临界阳性对照及定量标准品（1→）各200μl,分别加入到1.5ml离心管中，在离心管上编好号，振荡混匀。

2.4 56℃温浴15-2Omin,期间颠倒混匀数次。

2.5 加入200Ul无水乙醇，充分混匀，将全部液体转入装有2ml收集管的硅胶柱中，IoOoorPm离心Imin,倒掉收集管中的废液，将硅胶柱重新放入收集管中。

2.6 在硅胶柱中加入500Ul溶液Wl（使用前先检查是否加入相应体积的无水乙醇），1000OrPm离心Imin,倒掉收集管中的废液，将硅胶柱重新放入收集管中。

2.7 在硅胶柱中加入500Ul溶液W2（使用前先检查是否加入相应体积的无水乙醇），1000OrPm离心Imin,倒掉收集管中的废液，将硅胶柱重新放入收集管中。

2.8 在硅胶柱中加入500Ul溶液W2（使用前先检查是否加入相应体积的无水乙醇）,IoOOOrPm离心Imin,倒掉收集管中的废液。

2.9 将硅胶柱放入收集管中，1200OrPm空管离心3min,丢弃收集管。

2.10 将硅胶柱放入新的1.5ml离心管中，开盖静置L2min,往硅胶柱中心加入80Ul 的TE洗脱液，静置2-5min,1200OrPm离心2min,丢弃硅胶柱，盖好离心管盖，做好相对应的编号。

（注意：TE洗脱液的体积应不少于50ul,体积过小影响回收率。

为增加基因组DNA的回收率，可将TE洗脱液稍微加热。

获得的DNA应保存在-20°C,以防DNA降解。

）3 .加样（在样本处理区进行）3.1 向设定的n个PCR反应管中分别加入步骤1处理好的样品DNA、强阳性对照、临界阳性对照、阴性对照以及定量标准品（4个）各20μ∣,盖紧管盖，稍做离心。

3.2 将PCR反应管转移到检测区，放入相应的荧光PCR检测仪内，记录样品摆放顺序。

4 .PCR扩增（检测区）4.1 循环条件设置使用ABI7500和Line-Gene9660荧光PCR检测仪时循环程序设置如下：1150℃2min无2195℃9min无34595℃15sec无58℃50sec单次采集荧光4138℃10sec无■阴性对照无定量值出现，且内标Ct值W40；■强阳性对照检测值范围(3.16X105-3.16X106),临界阳性对照检测值范围(3.16×101-3.16×102),且内标Ct值W40。

HBV、HCV检测规程

乙型肝炎病毒核酸定量检测1原理本试剂盒用一对乙型肝炎病毒特异性引物和一条乙型肝炎病毒特异性荧光探针配以PCR反应液、耐热DNA聚合酶（TAQ酶）、核苷酸单体（DNTPS）等成分，用PCR体外扩增法定量检测乙型肝炎病毒DNA。

2 标本种类及收集要求2.1 标本采集2.1.1标本种类：血清或血浆。

2.1.2标本要求：血清——用一次性无菌采血针抽取受检者静脉血2ml，注入无菌的干燥生化管，使用水平离心机，3000rpm离心10min;吸取上层血清，转移至1.5ML进口灭菌管。

血浆——用一次性无菌采血针抽取受检者静脉血2ml，注入含EDTA（乙二胺四乙酸二钠）抗凝剂管，立即轻轻颠倒玻璃管混合5~10次，使抗凝剂与静脉血充分混匀，3000rpm离心10min;吸取上层血浆，转移至1.5ML 进口灭菌管2.2 标本储存：标本可立即用于测试，也可以保存与—20℃待测，保存期为6个月。

2.3标本运输：密封，室温运输。

2.4标本拒收标准：污染、标本量不足、严重溶血或脂血标本不宜作此项检测。

3试剂3.1 试剂名称：乙型肝炎病毒核酸定量检测试剂盒（PCR-荧光探针法）3.2 试剂生产厂家：中山大学达安基因股份有限公司。

3.3 包装规格：20人份/盒3.4 试剂盒组成DNA浓缩液，DNA提取液，PCR反应管，HBV临界阳性质控品，HBV强阳性质控品，阴性质控品，HBV阳性定量参考品（1.0×104IU/ml、1.0×105 IU/ml、3.5试剂储存条件及有效期：-20℃避光保存，有效期6个月。

4 仪器设备4.1 仪器名称：生物安全柜(Ⅱ级)、高速冷冻离心机、荧光定量PCR仪、恒温金属浴。

4.2 仪器厂家：上海培清、美国NUAIR公司、美国eppendorf、美国ABI生物技术公司、广州达安基因有限公司。

4.3 仪器型号：ABI7300、DA7600。

5 操作步骤5.1 DNA提取：5.1.1 标本处理（血清和血浆标本处理相同）-取100ul血清加入等量DNA浓缩液，振荡器振荡混匀5sec；12，000rpm离心10min；去上清，沉淀中加入30ul DNA 提取液，振荡器剧烈振荡混匀5-10sec，瞬时离心数秒，100℃恒温处理10±1min；12，000rpm离心5min，备用。