乙型肝炎病毒核酸定量检测操作程序
乙型肝炎病毒核酸定量检测操作程序
标本编号：操作时间：操作者：
1、将浓缩液及样品从-20℃取出，平衡至室温（ - ）。
2、用移液器加（）ul血清到（）ul浓缩液，振荡混匀。
3、将混匀好的标本放入高速冷冻离心机（）转离心（）分钟。
4、弃上清，沉淀中加入（）ul DNA提取液混匀。
5、（）℃恒温（）分钟（10±1分钟）。
6、（）转离心（）分钟，备用。
7、吸取（）ul上清到反应管，瞬时离心（）秒。
8、将反应管通过传递窗到产物扩增区准备扩增。
9、用ABI 7500扩增仪进行扩增.
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乙肝病毒核酸定量SOP
1、目的 采用PCR技术、实时荧光探针技术，用于临床血清或血浆标本中的乙型肝炎病毒核酸的定量检测，或用于乙型肝炎的辅助诊断和抗病毒药物治疗中的疗效观察。 2、原理 本试剂盒采用乙型肝炎病毒(HBV)-核酸释放剂快速裂解、释放血清或血浆样本中的乙型肝炎病毒(HBV)DNA,利用针对乙型肝炎病毒(HBV)核酸保守区设计的一对特异性引物、一条特异荧光探针，配以PCR反应液，在荧光定量PCR仪上，应用实时荧光定量PCR检测技术，通过荧光信号的变化实现乙型肝炎病毒(HBV) DNA的定量检测。 整个试验过程无须单独提取样本中的DNA，只需将血清或血浆样本直接加入PCR反应管中与乙型肝炎病毒(HBV) -核酸释放剂充分混合即可作为PCR扩增的模板，避免了常规样本核酸提取过程中的环境污染。 PCR检测体系含有UNG酶+dUTP防污染措施，将可能的产物污染充分降解，避免假阳性结果。 PCR检测体系含有阳性内对照（乙型肝炎病毒（HBV）内标），通过检测内标是否正常来监测待测样本中是否具有PCR抑制物，避免PCR假阴性。 PCR检测体系含有内参比荧光ROX，用于校正加样误差和管间差异，便于仪器自动分析报告荧光与内参比荧光ROX的比值，使定量更准确。 3、试剂保存及有效期 试剂应避光密闭保存于-20±5℃。试剂盒有效期为12个月，避免反复冻融。采用泡沫加冰运输5天不会影响产品效期。 4、样本要求 4.1. 适用样本类型:血清或血浆样本。 4.2. 样本采集: 4.2.1 血清样本采集:用无菌注射器抽取受检者静脉血2ml, 注入无菌收集管，室温不超过4小时，待样本自行析出血清，或直接室温1600rpm离心5分钟分离出血清，转移到1.5ml灭菌离心管中备用； 4.2.2血浆样本采集:用无菌注射器抽取受检者静脉血2ml,注入含有EDTA或枸橼
乙肝病毒核酸检测标本采集、送检、处理流程
乙肝病毒核酸检测标本采集、送检、处理 流程 一、引言 乙肝病毒核酸检测是一种重要的手段，用于乙肝病毒感染的早期诊断和监测治疗效果。本文档旨在描述乙肝病毒核酸检测的标本采集、送检和处理流程，以确保流程规范和结果准确性。 二、标本采集 1. 标本选择：乙肝病毒核酸检测的标本可使用血清、血浆或乙肝病毒DNA提取物。根据实验室提供的要求和使用的方法，正确选择合适的标本进行采集。 2. 采集器具：使用无菌器具进行标本采集，如无菌收集管、无菌采血针等。 3. 采集流程： - 患者应事先了解采集流程与注意事项，并保持合作配合。
- 消毒部位：消毒患者采血部位，通常选择肘弯处的静脉。 - 采血：按照相应的方法采集合适数量的血液样本。注意血液采集的整洁和标本不得受到污染。 4. 采集注意事项： - 采血前需要对采血设备进行消毒处理。 - 采血时要避免对血液标本造成不必要的污染，防止样本交叉感染。 - 采血后进行适当的处理，确保采血点不出现血肿或其他并发症。 三、标本送检 1. 样本存放：采集的标本应放入防漏、密封良好的中。若需要长期保存，应在-80℃低温条件下保存，以防止DNA的降解。 2. 标本信息：在标本上标注清楚患者信息，如姓名、年龄、性别等。确保标本信息准确，以避免混淆和误诊。
3. 快递选择：选择快递公司进行标本运输，确保安全、快捷的 送达实验室。在包装标记时，应注明标本的特殊性质，以提醒运输 人员注意。 四、标本处理 1. 样本分装：实验室收到标本后，根据实验要求进行样本分装。如分装到提取试剂盒、酶解管中，标注清楚样本编号，确保实验过 程的可追溯性。 2. 提取和纯化：根据实验方法进行标本的提取和纯化操作。确 保提取和纯化过程的洁净，避免外源性核酸污染。 3. PCR扩增：将提取纯化后的样本进行PCR扩增反应。注意PCR操作条件的准确性，避免扩增过程中的交叉污染。 4. 结果分析：根据PCR扩增结果，通过相关分析方法，如凝 胶电泳、定量PCR等，对乙肝病毒核酸进行检测和分析。 五、质量控制与结果报告
《乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、人类免疫缺陷病毒(1+2型)核酸检测试剂盒(PCR-荧光法)操作规程》
乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、人类免疫缺陷病毒（1+2型）核酸检测 试剂盒（PCR-荧光法）操作规程 1.目的 规范核酸检测试验操作，确保检测结果的准确性。 2.原理 2.1 汇集：吸取8份（或以下）样品到指定的汇集管。 2.2提取：病毒核酸提取的方法为磁珠法。试剂盒提供之内对照(IC)为不具感染性的假病毒，在进行样品核酸提取前加入样品中，监控提取、扩增和分析的全过程。标本经裂解液处理后会将病毒外鞘膜破坏，蛋白质变形，使病毒裂解释放出病毒基因组核酸。加入表面包被有二氧化硅的磁珠颗粒，在高盐环境下带负电荷的核酸吸附到带正电荷的的磁珠颗粒表面。洗液可以洗去未结合的物质，如变性的蛋白、细胞碎片、PCR抑制物等并降低盐浓度。纯化的病毒在特定的环境下从磁珠颗粒表面洗脱下来成为扩增的模板。 2.3扩增：采用PCR扩增TaqMan荧光探针标定技术同时对HBV（DNA）、HCV（RNA）、 HIV（RNA）进行检测。在反转录酶的作用下HCVRNA、HIVRNA反转录成cDNA，再与HBVDNA一同通过TaqDNA聚合酶的作用扩增病毒核酸的保守区域，TaqDNA聚合酶5`—3`外切酶活性切割反应系统中带荧光标记的TaqMan探针，随着PCR的进行，荧光信号不断积累。通过PCR仪的检测血液标本达到和超过荧光阈值的信号给出样品的阴阳性结果。
选择性PCR扩增：采用UNG-dUTP抗污染系统。在PCR扩增系统中采用UTP代替TTP，产生大量U-DNA片段。UNG酶特异识别U-DNA片段中含UTP的位点并进行切割，U-DNA 被降解后不能作为再次扩增的模板，系统选择性的扩增天然的核酸分子，从而防止了PCR扩增产物的污染。 2.4 质量控制原理 为监控实验进行，保证实验结果的准确，在每次检测过程依靠阳性、阴性质控品以及内标进行监测。 2.4.1阴性质控品监控系统性假阳性，如果阴性质控品检测结果为阳性，说明实验存在假阳性的风险，因此实验中的阳性结果需复查。 2.4.2低浓度阳性质控品监控系统假阴性，如果低浓度阳性质控品检测结果为阴性，说明实验存在假阴性或灵敏度下降的风险，因此实验中的阴性结果均需复测。 2.4.3内对照分为DNA内对照和RNA内对照，是每个反应管中的阳性质控，用于监控单个反应管中DNA与RNA的假阴性风险，如果标本检测结果为阴性，其DNA 内对照与RNA内对照结果必须为阳性，否则提示该标本的扩增受到抑制，该阴性 检测结果有假阴性风险，需要复测。 3.适用范围 适用于核酸实验室采用核酸技术进行的HBV、HCV、HIV三项单管混样检测。 4.职责 4.1 授权的检验人员负责试验操作、结果判读，作好相关记录，对检测结果的真实性和有效性负责。 4.2 授权的监督人员负责监督该规程执行。 5.原始样品系统 血浆 6.材料与设备 6.1 消耗品 6.1.1乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、人类免疫缺陷病毒（1+2型）核酸检测试剂盒（PCR-荧光法），苏州华益美生物科技有限公司； 6.1.2 96孔深孔板 6.1.3 1.5ml离心管（手工实验用）和2mlAxgen离心管（用于配置PCR反应液）； 6.1.4 5ml汇集管； 6.1.5 96孔扩增板或八连管； 6.1.6 带滤芯并经灭菌处理的Tip头； 6.1.7 自封袋； 6.1.8 磁棒套管； 6.1.9留样板和封膜
HBV-DNA检测标准操作程序
2.3 吸取已编号的待测血清或血浆样本、试剂盒中的阴性对照、强阳性对照、临界阳 性对照及定量标准品（1→）各200μl,分别加入到1.5ml离心管中，在离心管上编好号，振荡混匀。 2.4 56℃温浴15-2Omin,期间颠倒混匀数次。 2.5 加入200Ul无水乙醇，充分混匀，将全部液体转入装有2ml收集管的硅胶柱中，IoOoorPm离心Imin,倒掉收集管中的废液，将硅胶柱重新放入收集管中。2.6 在硅胶柱中加入500Ul溶液Wl（使用前先检查是否加入相应体积的无水乙醇），1000OrPm离心Imin,倒掉收集管中的废液，将硅胶柱重新放入收集管中。 2.7 在硅胶柱中加入500Ul溶液W2（使用前先检查是否加入相应体积的无水乙醇），1000OrPm离心Imin,倒掉收集管中的废液，将硅胶柱重新放入收集管中。 2.8 在硅胶柱中加入500Ul溶液W2（使用前先检查是否加入相应体积的无水乙醇）,IoOOOrPm离心Imin,倒掉收集管中的废液。 2.9 将硅胶柱放入收集管中，1200OrPm空管离心3min,丢弃收集管。 2.10 将硅胶柱放入新的1.5ml离心管中，开盖静置L2min,往硅胶柱中心加入80Ul 的TE洗脱液，静置2-5min,1200OrPm离心2min,丢弃硅胶柱，盖好离心管盖，做好相对应的编号。（注意：TE洗脱液的体积应不少于50ul,体积过小影响回收率。为增加基因组DNA的回收率，可将TE洗脱液稍微加热。获得的DNA应保存在-20°C,以防DNA降解。） 3 .加样（在样本处理区进行） 3.1 向设定的n个PCR反应管中分别加入步骤1处理好的样品DNA、强阳性对照、临界阳性对照、阴性对照以及定量标准品（4个）各20μ∣,盖紧管盖，稍做离心。 3.2 将PCR反应管转移到检测区，放入相应的荧光PCR检测仪内，记录样品摆放顺序。 4 .PCR扩增（检测区） 4.1 循环条件设置 使用ABI7500和Line-Gene9660荧光PCR检测仪时循环程序设置如下：
乙型肝炎病毒(HBV)核酸定量检测标准操作规程
乙型肝炎病毒（HBV）核酸定量检测标准操作规程（PCR-荧光探针法） 1.目的: 规范乙型肝炎病毒（HBV）核酸定量检测操作流程，保证检测结果的准确性。 2.应用范围: HBV DNA 荧光定量检测。 3.职责: 3.1 文件编写：实验室技术员。 3.2 文件审核：实验室主管。 3.3 文件审批：实验室主任。 3.4 执行：PCR实验室所有工作人员。 4. 参考文献： 4.1 中山大学达安基因股份有限公司乙型肝炎病毒（HBV）核酸定量检测试剂盒（PCR-荧光探针法）说明书。 4.2 中山大学达安基因股份有限公司核酸扩增荧光检测系统DA7600型使用说明书。 5. 内容： 5.1 检测方法：PCR-荧光探针法。 5.2 实验原理：用一对乙型肝炎病毒特异性引物和一条乙型肝炎病毒特异性荧光探针，配以PCR反应液、耐热DNA聚合酶（Taq酶）、核苷酸单体（dNTPs）等成分，通过PCR体外扩增法，即高温变性、低温退火、适温延伸进行DNA扩增，并对PCR全过程进行实时监测，从而定量检测乙型肝炎病毒DNA。 5.3 性能参数： 5.3.1 精密度：检测下限为5.0x102IU/ml。 5.3.2 线性范围：1.0x103～1.0x108IU/ml。 5.4 标本采集：由合作单位按照以下要求进行采集 5.4.1 标本类型：血清。 5.4.2 标本采集：用一次性无菌注射器抽取受检者静脉血2毫升，注入无菌的干燥玻璃管，室温（22～25℃）放置30～60 min，全血标本可自发完全凝集析出血清，或直接使用水平离心机，1500 rpm离心5min；吸取上层血清，转移至1.5ml灭菌离心管。 5.4.3 标本保存：标本可立即用于测试，也可以保存于-20℃待测，保存期为6个月，应避免反复冻融。 5.4.4 运送条件：标本运送采用0℃冰壶。 5.4.5 标本拒收标准：污染、严重溶血、脂血类或肝素抗凝剂标本。 5.5 设备和试剂： 5.5.1 设备： DA7600荧光定量PCR仪、低速水平离心机、生物安全柜、台式高速离心机、移液器、混匀器、恒温水浴箱/干式恒温器、冰箱（4℃、-20℃）、移动/固定紫外灯、冷冻离心机。 5.5.2 试剂：
达安HBV-DNA定量试剂说明书
1 目的 规范LightCycler荧光PCR检测仪检测乙型肝炎病毒（HBV-DNA）的检验工作，指导检验人员正确进行乙肝病毒核酸定量的检测，保证检验结果的质量。 2 范围 本规程适用于LightCycler荧光PCR检测仪检测乙型肝炎病毒（HBV-DNA） 3 试剂 中山大学达安基因公司乙肝病毒(HBV)核酸扩增荧光检测试剂盒 4 仪器 Roche LightCycler荧光PCR检测仪 高速台式冷冻离心机 微量加样器（覆盖1-1000μl） 5 样品处理 样品处理按《PCR实验室标本处理规程》进行收集和处理，具体操作见本规程附录1和附录2。 6 测定 6.1 PCR扩增 6.1.1 打开稳压器电源，再打开计算机电源。 6.1.2 打开扩增仪电源，按仪器操作规程进入扩增循环条件设定。
6.1.3 将循环条件设定为： 6.1.4 检查反应管是否盖紧，以免荧光物质泄漏污染仪器。 6.1.5 将待反应的PCR反应管放入扩增仪中，并根据实际情况和仪器操作规程在程序中定好反应孔位置。 6.1.6 关闭扩增仪盖，按仪器操作规程开始循环。 6.1.7 扩增结束后关闭扩增仪电源，取出PCR反应管，密封放入垃圾桶。 6.2 产物分析 6.2.1 条件设置：反应结束后自动保存检测数据文件，调整荧光数值为 F1/F2。点击Quantification读取结果。 6.2.2 基线的确定：取3～8个循环的荧光信号。 6.2.3 噪声容限（阈值）：调节在阴性质控品以上，要求在Step3：Analysis下相关性r值＜-0.97，接近-1.0。 6.2.4 对照标准：保证阴性质控品的Ct值不出现任何数值（默认为40）。 6.2.5 最后记录仪器自动分析计算出的未知标本数值（M），关闭计算机。
乙型肝炎病毒抗体诊断(胶体金法SOP)标准操作程序1精编版
乙型肝炎病毒抗体诊断（胶体金法SOP） 测定标准操作程序 编写者：宿金涛 日期：2012年3月1日 一. 原理：乙型肝炎病毒表面抗原、表面抗体、e抗原、e抗体、核心抗体检测试剂盒（胶体金法）采用胶体金免疫层析分析技术、将五个诊断意义相关的试剂通过一个包装组合在一起，同时进行乙型肝炎病毒五项标志物的检测，在不影响各自性能的情况下，便于客户的储存和使用。 HBsAg检测试剂采用双抗体夹心法，试剂含有被事先固定于膜上测试区(T)的抗体。 测试时，标本滴入试剂加样处，标本与预包被的胶体金颗粒结合的抗HBsAg抗体反应。然后，混合物随之在毛细效应下向上层析。如是阳性，胶体金抗体在层析过程中先于标本中的HBsAg结合，随后家何物会被固定在膜上的抗HBsAg抗体结合，在测试区内（T）会出现一条紫红色带。这条带是HBsAg抗体-HBsAg-HBsAg抗体金标粒子的复合物在膜上结合形成的。如是阴性，则测试区内（T）将没有紫红色带。无论HBsAg是否存在于标本中，一条紫红色带都会出现在指控内（C）。质控区内（C）所显现的紫红色条带是判定是否有足够标本，层析过程是否正常的标准，同时也作为试剂的内控标准。 HBsAb检测试剂双抗原夹心法，试剂含有被事先固定于膜上测试区（T）的乙肝表面抗体。 测试时，标本滴入试剂加样处，标本与预包被的胶体金颗粒结合的HBsAg反应。然后，混合物随之在毛细效应下向上层析。如是阳性，胶体金抗体在层析过程中先于标本中的HBsAg结合，随后结合物会被固定在膜上的HBsAg抗体结合，在测试区内(T)会出现一条紫红色条带。这条带是HBsAg-HBsAb-HBsAg金标粒子的复合物在膜上结合形成的。如果阴性，则测试区内(T)将没有紫红色条带。无论HBsAg是否存在于标本中，一条紫红色条带都会出现在质控区内(C)。质控区内(C)所显现的紫红色条带是判定是否有足够标本，层析过程是否正常的标准，同时也作为试剂的内控标准。 HBeAg检测试剂采用双抗体夹心法，试剂含有被事先固定于膜上测试区（T）的乙肝e抗体。 测试时，标本滴入试剂加样处，标本与预包被的胶体金颗粒结合的HBeAg抗体反应。然后，混合物随之在毛细效应下向上层析。如是阳性，胶体金抗体在层析过程中先于标本中的HBeAg结合，随后结合物会被固定在膜上的HBeAg抗体结合，在测试区内(T)会出现一条紫红色条带。这条带是HBeAg抗体-HBeAg-HBeAg抗体金标粒子的复合物在膜上结合形成的。如果阴性，则测试区内(T)将没有紫红色条带。无论HBeAg抗体是否存在于标本中，一条紫红色条带都会出现在质控区内(C)。质控区内(C)所显现的紫红色条带是判定是否有足够标本，层析过程是否正常的标准，同时也作为试剂的内控标准。 HBeAb,HBcAb检测试剂才有竞争抑制法，试剂含有被事先固定于膜上测试区(T)的抗体。 测试时，血清或血浆标本滴入试剂加样处，随之标本在毛细效应下向上层析。如标
乙肝病毒DNA检测Microsoft Word 文档
乙肝病毒DNA检测 乙肝病毒DNA指的是脱氧核糖核酸，病毒的复制是靠DNA的复制来完成的，DNA的浓度越高，病毒的复制越活跃。合起来，HBV-DNA指的就是乙肝病毒的脱氧核糖核酸。乙肝病毒DNA检测是判断乙肝病毒复制的常用手段。一般的，把数值大于10的3次方为阳性，把3-5次方认为是低量复制，5-7为中等量，大于7次方为大量。乙肝两对半并不能准确的判断病毒复制情况，DNA弥补了这个的不足。不过由于DNA检测技术要求严格，容易受到干扰，因此，一次结果不足以说明问题，遇到阳性，可以换医院再次检查。 目录 1DNA检测 2作用 3临床意义 4复制过程 ▪第一步：黏附 ▪第二步:脱壳 ▪第三步：入核 ▪第四步：转录 ▪第五步：翻译 ▪第六步：逆转录 ▪第七步：组装 5频率 6注意事项 7检测方法 8检测报告 9检测费用 10检测要空腹吗 11乙肝病毒DNA检测的作用 1DNA检测 以往乙肝患者抗病毒治疗的指征是：乙肝病毒e抗原阳性（大三阳）患者
HBVDNA数值要求达到10的5次方拷贝/毫升（20000U/ml），乙肝病毒e抗原阴性（小三阳）患者乙肝病毒DNA数值要求达到10的4次方拷贝/毫升（2000U/ml），但是10的4次方拷贝/毫升以下也不能认为就没有问题了，最新的国际研究资料表明：和肝脏疾病进展相关的病毒DNA水平域值尚不清楚，即使HBVDNA水平持续低于20000U/ml，也可能乙肝病毒情仍在进一步发展，因此HBVDNA数值应该越低越好，目前国际建议的HBVDNA检测正常值应该是：< 50U/ml 。 2作用 目前，乙肝病毒DNA检测在乙肝检查化验中使用的越来越普遍，可见乙肝病毒DNA检测在乙肝检查化验中占的分量越来越重，这是因为乙肝病毒DNA检测对确诊乙肝和评估乙肝治疗效果具有十分重要的作用。主要表现在以下七个方面： 1、了解乙肝病毒在体内存在的数量。 2、乙肝病毒是否复制。 3、乙肝是否传染，传染性有多强。 4、是否有必要服药。 5、肝功能异常改变是否由病毒引起。 6、判断病人是适合用哪类抗病毒药物。 7、判断药物治疗的疗效。 3临床意义 所以说HBV—DNA定量检测指标降低在乙肝治疗中有着非常重要的意义，是乙肝转阴的前奏，也是康复最为关键的一步，只有体内的HBV—DNA定量指标降低，病毒的复制繁殖才会停止，乙肝的彻底治愈才有希望。 乙肝病毒DNA检测的临床意义一、对医生的诊断和用药非常重要。通过乙肝病毒DNA检测能够判定判断乙肝患者适合用哪类抗病毒药物；乙肝病毒DNA检测对用药的剂量、用药时间、是否需要联合用药以及用药的效果等提供重要的参考依据，也是临床上评价抗病毒或免疫增强药物疗效的最客观的指标。 乙肝病毒DNA检测的临床意义二、能够直接反映乙肝病毒复制状态及传染性的最佳指标，通过乙肝病毒DNA的含量能直接反映病毒在体内存在的数量、是否传染，传染性有多强。但是需要说明的一点是：乙肝病毒载量的多少并不代表肝脏的损伤程度，也无法判断病情的严重程度。
乙肝五项操作规程
乙肝五项（乳胶法）操作规程 1.检测目的 乙型肝炎病毒标志物(HBsAg、HBsAb、HBeAg、HBeAb、HBcAb)检测。 2.测定原理 HBsAg检测采用双抗体夹心法原理，试剂含有被事先固定于膜上测试区（T区）的抗体。检测时，标本滴入试剂加样处，标本与预包被的乳胶颗粒（即标记物）结合的HBsAb（即标记抗体）反应，该结合物随之在毛细效应下向上层析。如是阳性，乳胶抗体（标记抗体）在层析过程中先与标本中的HBsAg结合，随后结合物会被固定在T区膜上的HBsAb捕获，形成HBsAb标记抗体-HBsAg-HBsAb复合物，从而在T区形成一条红杠。如为阴性，则T区没有红杠。 HBsAb检测采用双抗原夹心法原理，试剂含有事先固定于膜上测试区（T区）的HBsAg。检测时，标本滴入试剂加样处，标本与预包被的乳胶颗粒结合的HBsAg反应（即标记抗原）反应，该结合物随之在毛细效应下向上层析。如是阳性，乳胶抗原（标记抗原）在层析过程中先与标本中的HBsAb结合，随后结合物会被固定在T区膜上的HBsAg捕获，形成HBsAg标记抗原-HBsAb-HBsAg复合物，从而在T区形成一条红杠。如为阴性，则T区没有红杠。 HBeAg检测采用双抗体夹心法原理。试剂含有事先固定于膜上测试区（T区）的HBeAb。检测时，标本滴入试剂加样处，标本与预包被的乳胶颗粒结合的HBeAb反应（即标记抗体）反应，该结合物随之在毛细效应下向上层析。如是阳性，乳胶抗体（标记抗体）在层析过程中先与标本中的HBeAg结合，随后结合物会被固定在T区膜上的HBeAb捕获，形成HBeAb标记抗原-HBeAg-HBeAb复合物，从而在T区形成一条红杠。如为阴性，则T区没有红杠。 HBeAg、HBcAb采用竞争抑制法原理，试剂含有事先固定于膜上测试区（T区）的抗体。检测时，标本滴入试剂加样处，随之标本在毛细效应下向上层析。如标本中含有相应的抗体，则同膜上测试区(T)的单克隆抗体竞争，与预包被在乳胶颗粒上的相应抗原反应。如标本中没有相应的抗体，则预包被在乳胶颗粒上的相应抗原与膜上测试区(T) 的单克隆抗体全部结合。阳性标本，测试区(T)将没有红色条带；阴性标本，测试区(T)会出现明显的红色条带。
乙型肝炎病毒(HBV)实时荧光定量PCR
乙型肝炎病毒（HBV）实时荧光定量PCR [目的要求] 掌握血清中HBV-DNA的提取方法及原理；HBV-DNA实时荧光定量PCR的测定原理；HBV-DNA实时荧光定量PCR实验操作及结果分析 了解核酸测定引物设计原理；实时荧光定量PCR仪的工作原理及操作。 [教学时数] 讲授2学时，实验6学时。 [讲授内容] 血清中病毒DNA的提取方法和原理；实时荧光定量PCR的测定原理；核酸测定引物设计原理；HBV-DNA测定引物设计思路；HBV-DNA荧光定量PCR试剂组成、相应作用及反应混合液配制；实时荧光定量PCR仪的工作原理及操作 [实验内容] 分组提取血清中HBV-DNA；配制反应液并上机操作，实时观察，结果分析；实验结果讨论；实验总结 [自学内容] “感染性疾病的分子诊断” 实验指导（自编） 实验乙型肝炎病毒（HBV）实时荧光定量PCR 【原理】 Real time PCR 是普通PCR 的一项改进，使用了针对扩增DNA 的荧光物质，使得DNA 的数量与检测到的荧光强度成线性关系，大致得到DNA 的扩增曲线，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。即对DNA靶分子的起始拷贝数进行定量的核酸检测。该方法精确、灵敏、特异性强、污染途径小、自动化程度高、操作简单。是国际公认的核酸分子
定量的标准方法。它已逐渐代替了Northern blotting 以及semi RT-PCR技术。 本实验从HBV携带者或者乙型肝炎患者血清中抽提HBV基因组DNA，采用核酸扩增结合TaqMan荧光探针技术, 利用一对乙肝病毒特异性引物和一特异性结合于扩增区另一位点的TaqMan探针, 实现对乙肝病毒模板的扩增和检测。使用商品化试剂盒：HBV实时荧光定量试剂盒，深圳匹基公司（PG，Biotech.）。针对表面抗原S基因，设计一对引物和一个探针。TaqMan荧光探针技术中，两个荧光染料标记在探针上，一个叫报告基团（R），一个叫淬灭基团（Q）。当两个荧光基团都连在探针上时，报告基团的荧光被淬灭基团抑制。在延伸中，DNA聚合酶利用5’→3’外切酶活性把报告基团从探针上切下来。一旦和淬灭基团分开，报告基团释放出荧光。通过监测荧光信号的积累来反映乙肝病毒DNA的扩增.产物的积累，根据扩增反应的动力学特征使用外部标准曲线对初始模板定量（图4）。 图4：TaqMan荧光探针技术原理 R:荧光报告基团Q：荧光淬灭基团 【试剂与器材】 1．HBV-DNA检测试剂盒：DNA提取液1，DNA提取液2，PCR预混合液（含有Mg2+、PCR反应缓冲液、dATP、dUTP、dGTP、dCTP引物、荧光标记的探针）、Taq酶、UNG，强阳性对照血清、阴性对照血清、临界阳性血清，四种不同浓度的阳性参控品、双蒸去离子水。 2．荧光定量PCR仪 3．PCR反应管 4．移液器及移液器吸头 5．高速离心机 6．漩涡混合器
乙型肝炎病毒实验室检测技术规范
乙型肝炎病毒实验室检测技术规范 简介 本文档旨在制定乙型肝炎病毒实验室检测技术规范，以确保实验室操作的准确性、有效性和安全性。本规范适用于乙型肝炎病毒的检测工作，包括样本采集、处理、实验操作和数据分析等环节。 实验室设备和材料要求 - 实验室应配备符合乙型肝炎病毒检测要求的设备，包括PCR 仪、离心机、显微镜等。 - 实验室应储备足够的试剂和耗材，确保进行实验所需材料的充足性和质量。 - 实验室应建立样本采集、储存和处理的标准操作流程，确保样本的完整性和稳定性。 实验操作规范
- 实验操作前，操作人员应接受相关的乙型肝炎病毒检测方法培训，熟悉操作流程和安全注意事项。 - 实验操作中应严格遵守无菌技术操作要求，避免交叉污染和误差的发生。 - 样本采集时应采用合适的器械和方法，并确保采集的样本足够，并满足乙型肝炎病毒检测的要求。 - 样本处理过程中应遵循实验室内的安全操作规定，包括穿戴个人防护装备、定期消毒等。 - 实验操作中应遵循乙型肝炎病毒检测方法的标准程序，确保操作的准确性和可靠性。 数据分析和结果报告要求 - 实验数据应进行准确的记录和整理，确保数据的可追溯性和准确性。 - 数据分析应遵循乙型肝炎病毒检测方法的要求，运用适当的统计方法和质控措施进行数据分析。 - 检测结果应及时报告，包括样本编号、检测方法、检测结果等内容，并存档备查。
质量控制要求 - 实验室应建立质量控制体系，包括质量控制样品的使用和监测，以确保实验结果的准确性和可靠性。 - 定期进行设备的校准和维护，确保设备运行的准确性和稳定性。 - 实验操作过程中应进行内部质量控制的监测，包括设立质控样品和进行校准实验等。 安全要求 - 实验室应遵守乙型肝炎病毒实验室安全管理规范，包括建立安全操作标准、储存和处置感染性废弃物等。 - 操作人员应接受相关的安全培训，熟悉应急处理措施和事故报告要求。 - 实验室应建立和维护安全管理档案，包括安全设施和装备的维护记录、事故处理记录等。 总结
乙型肝炎病毒核酸定量检测标准作业指导书
乙型肝炎病毒核酸定量检测标准作业指导书-模板 1.目的 采用PCR技术、实时荧光探针技术，用于临床血清或血浆标本中的乙型肝炎病毒核酸的定量检测，或用于乙型肝炎的辅助诊断和抗病毒药物治疗中的疗效观察。 2.范围 适用于乙型肝炎病毒核酸（HBV DNA）定量检测（PCR-荧光探针法）。 3.职责 3.1操作人员：负责标本制备检测、仪器操作、报告发送。 3.2专业组组长：负责本组耗材的请购，监督本组标本检测、仪器操作、报告发送、质控管理等各方面工作。 3.3实验室主任：负责监督和指导实验室各方面工作。 4.原理 采用荧光PCR技术，以HBV基因组中相对保守区为靶区域，设计特异性引物及荧光探针，在样品核酸纯化之后，通过荧光定量PCR对HBV DNA进行扩增，并检测荧光信号，仪器软件系统自动绘制出实时扩增曲线，根据阈循环值（CT）实现对未知样品的检测。另外，本试剂盒带有内标物质，用于对核酸提取的整个过程进行监控，减少假阴性结果的出现。 5.样品要求 5.1适用样品类型：血清或血浆。 5.2样品采集： 5.2.1血清 用一次性无菌注射器抽取受检者静脉血2:^，注入无菌的真空采血管中（未加抗凝剂），室温（22-25℃）放置30-60min血标本可自发完全凝集析出血清，或直接使用水平离心机，1500rpm离心5min，吸取上层血清，转移至1.5ml灭菌离心管。 5.2.2血浆 用一次性无菌注射器抽取受检者静脉血2ml，注入含EDTA （乙二胺四乙酸二钠）抗凝剂的真空
采血管，立即轻轻颠倒混匀5-10次，使抗凝剂与静脉血充分混匀，5-10min后分离血浆于无菌的1.5ml 灭菌离心管。 5.3样品保存和运送 使用专用样品0c冰壶送检，温度约维持在4℃左右。分离后的血清或血浆可立即用于测试， 也可以保存于-20℃待测，保存期为6个月。 5.4拒收样品：拒绝重度溶血样品、肝素抗凝的血浆。 6.仪器和试剂 6.1仪器 AB7500核酸扩增仪、恒温金属浴、生物安全柜、低温离心机等。 6.2试剂 生产厂家：中山大学达安基因股份有限公司 产品标准批号：YZB/国7265-2013 线性范围：100 IU/ml-5x108 IU/ml 最低检出限及定量限：最低检出限浓度为30 IU/ml,最低定量浓度为100 IU/ml。 试剂各组分见表1： 表1试剂盒组分表
乙型肝炎病毒核酸扩增荧光定量检测标准操作规程
乙型肝炎病毒核酸扩增荧光定量检测标准操作规程 一、乙型肝炎病毒核酸扩增荧光定量检测标准操作规程采用PCR方法结合荧光探针的体外扩增和检测技术，适用于检测人临床血清或血浆样本中的乙型肝炎病毒DNA，用于乙型肝炎的辅助诊断，并应用于抗病毒药物治疗中辅 助疗效的判断。 1、储存条件及有效期本试剂盒 一、乙型肝炎病毒核酸扩增荧光定量检测标准操作规程采用PCR方法结合荧光探针的体外扩增和检测技术，适用于检测人临床血清或血浆 样本中的乙型肝炎病毒DNA，用于乙型肝炎的辅助诊断，并应用于抗病毒药物 治疗中辅助疗效的判断。 1、储存条件及有效期本试剂盒贮存于-20℃的条件下有效期为12个月（请于有效期内使用）。 2、样本采集 2.1 本试剂盒适用于血清或血浆样本。 2.2 采集血清样本时，取被检者静脉血。 2.3 用无菌注射针头抽取 2ml，收集于无菌离心管中。 2.4 室温放置不超过4小时。 2.5 1600g离心20分钟，吸取血清【切勿吸入红细胞】转入另一无菌离心管中备用。 2.6 采集血浆样本时，无菌注射针头采2ml静脉血于含有EDTA作为抗凝剂的无菌离心管中【不可用肝素抗凝】。 2.7 室温放置不应超过4小时，室温1600g离心20分钟。 2.8 分离血浆【切勿吸入红细胞】，转入无菌离心管中备用。 3、样本存放 3.1 待测样本在2-8℃保存不应超过24小时。 3.2 -20℃保存不超过三 个月。 3.3 -70℃以下长期保存。 3.4 应避免反复冻融。 4、试用仪器Roche LightCycler，Roter-Gene 2000/3000,PE Gene Amp 5700，PE Gene Amp 7700，ABI-7000，ABI-7300，BIO-RAD iCycler，Line-GeneⅠ，Line-GeneⅡ，MJ OpticonⅠ，MJ Opticon Ⅱ等国内市场主流荧光PCR仪 5、扩增试剂准备（PCR前准备区） 5.1 从试剂盒中取出HBV PCR反应液、Taq酶及UNG,室温融化并混合均匀后，2000rpm离心10sec 5.2 设所需要的PCR反应管管数为n（n = 样本数 + 2管阴性对照 + 1管强阳性对照 + 1管临界阳性对照 + 4管阳性工作标准品），每个测试反应体系配制如下表： 5.21 Roche LightCycler ,Roter-Gene2000/3000仪器，准备相应数量的毛细管 试剂 HBV PCR反应液 Taq酶 UNG 用量 17.8 ul 0.2 ul
HBV、HCV检测规程
乙型肝炎病毒核酸定量检测 1原理 本试剂盒用一对乙型肝炎病毒特异性引物和一条乙型肝炎病毒特异性荧光探针配以PCR反应液、耐热DNA聚合酶（TAQ酶）、核苷酸单体（DNTPS）等成分，用PCR体外扩增法定量检测乙型肝炎病毒DNA。 2 标本种类及收集要求 2.1 标本采集 2.1.1标本种类：血清或血浆。 2.1.2标本要求：血清——用一次性无菌采血针抽取受检者静脉血2ml，注入无菌的干燥生化管，使用水平离心机，3000rpm离心10min;吸取上层血清，转移至1.5ML进口灭菌管。血浆——用一次性无菌采血针抽取受检者静脉血2ml，注入含EDTA（乙二胺四乙酸二钠）抗凝剂管，立即轻轻颠倒玻璃管混合5~10次，使抗凝剂与静脉血充分混匀，3000rpm离心10min;吸取上层血浆，转移至1.5ML 进口灭菌管 2.2 标本储存：标本可立即用于测试，也可以保存与—20℃待测，保存期为6个月。 2.3标本运输：密封，室温运输。 2.4标本拒收标准：污染、标本量不足、严重溶血或脂血标本不宜作此项检测。3试剂 3.1 试剂名称：乙型肝炎病毒核酸定量检测试剂盒（PCR-荧光探针法） 3.2 试剂生产厂家：中山大学达安基因股份有限公司。 3.3 包装规格：20人份/盒 3.4 试剂盒组成 DNA浓缩液，DNA提取液，PCR反应管，HBV临界阳性质控品，HBV强阳性质控品，阴性质控品，HBV阳性定量参考品（1.0×104IU/ml、1.0×105 IU/ml、 3.5试剂储存条件及有效期：-20℃避光保存，有效期6个月。 4 仪器设备 4.1 仪器名称：生物安全柜(Ⅱ级)、高速冷冻离心机、荧光定量PCR仪、恒温金属浴。 4.2 仪器厂家：上海培清、美国NUAIR公司、美国eppendorf、美国ABI生物技
乙型肝炎的病毒载量监测方法
乙型肝炎的病毒载量监测方法 乙型肝炎是一种由乙型肝炎病毒（HBV）引起的传染病，全球范围内有数亿人感染乙型肝炎病毒。乙型肝炎病毒的患者往往会出现肝脏炎症、肝功能异常等症状，严重者可能发展成肝硬化和肝癌。因此，对乙型肝炎病毒的病毒载量进行监测对于疾病的诊断、治疗和预防具有重要意义。 乙型肝炎病毒的病毒载量监测主要通过检测血液中的HBV DNA水平来进行。 目前常用的方法包括定量PCR（聚合酶链反应）和实时PCR。这些方法通过扩增 和检测HBV DNA的数量，可以准确地测量病毒在患者体内的含量。 定量PCR是一种常用的病毒载量监测方法。它通过扩增HBV DNA片段的数量，然后通过比较样本中的HBV DNA与标准曲线上的对应点，从而确定病毒载量的水平。定量PCR的优点是灵敏度高、可靠性好，可以检测到非常低浓度的病毒。 实时PCR是一种更为先进的病毒载量监测方法。与定量PCR不同，实时PCR 可以在反应过程中实时监测HBV DNA的扩增情况。它利用荧光探针或染料来标记PCR产物，通过检测荧光信号的强度来确定HBV DNA的数量。实时PCR具有高 度的灵敏度和准确性，可以在短时间内完成大量样本的检测。 除了PCR方法，还有一些其他的病毒载量监测方法。例如，核酸杂交法可以 通过探针与HBV DNA的互补配对来检测病毒的存在。此外，还有一些新兴的技术，如数字PCR和基因芯片技术，也被应用于乙型肝炎病毒的病毒载量监测。 病毒载量监测对于乙型肝炎的治疗和预后评估具有重要意义。根据病毒载量的 水平，医生可以判断疾病的活动程度和患者的感染状态，从而制定相应的治疗方案。病毒载量监测还可以用于评估治疗的疗效，及时调整治疗方案，以提高治疗的效果。 总之，乙型肝炎病毒的病毒载量监测是诊断、治疗和预防乙型肝炎的重要手段。定量PCR和实时PCR是目前常用的监测方法，具有高度的灵敏度和准确性。随着
乙型肝炎检测操作规程
乙型肝炎检测试剂盒操作规范 1.检测用途： 定向检测人血清/血浆样本中的乙型肝炎病毒标志物，包括乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAg）、表面抗体(HBsAb)、e抗原(HBeAg)、e抗体(HbeAb)、核心抗体(HbcAb)。 2.检测临床意义: 乙型肝炎一般临床主要表现为乏力，食欲减退、恶心、呕吐、肝肿大及肝功能异常，部分进行性脾肿大、蜘蛛痣、肝掌等表现。但部分慢性乙肝无明显症状，但在病理上会出现肝小叶内炎症和肝细胞变性及坏死，严重者会发生纤维化，甚至肝硬化。 3.检验原理： HBsAg、HbsAb、HbeAg检测采用双抗体夹心法，检测时，标本滴入试剂加样处，标本与预包被的乳胶颗粒结合HBsAg、HbsAb、HbeAg抗体产生反应，显示出红色条带。 HbeAb、HbcAb检测试剂采用竞争抑制法，检测时，血清/血浆标本滴入试剂加样处，随之标本在毛细效应下向上层析。如标本中含有相应的抗体，则同膜上测试区（T）的抗体竞争与预包被在乳胶颗粒的相应抗原反应。如标本中没有相应的抗体，预包被在乳胶颗粒的复合物的相应抗原则同膜上测试区（T）抗体全部结合，显示出红色条带。阳性标本，测试区内（T）将没有红色条带，阴性标本，测试区内（T）将出现明显红色条带。 4.检测样本要求： 样本采集后应尽快分离血清或血浆以避免溶血，检测时应尽量使用新鲜的样本。样本若不能及时送检，可在2摄氏度-8摄氏度冷藏3天。长期保存需冷冻于-20摄氏度。忌反复冻融、发臭、溶血等异常样本请勿使用。 5．检测方法： 检测前须将试剂和样本恢复至室温（20摄氏度-30摄氏度）。 5.1从原包装铝锡袋中取出试剂，并在1小时内使用。 5.2用吸管吸取样本，逐滴（每孔2-3滴）加入试剂的五个加样孔中，同时开始计时。 5.3等待红色条带的出现，结果应在15-30分钟内判读。30分钟后判定无效。 6．检验方法的局限性： 6.1本试剂仅用于体外诊断。 6.2本试剂仅适用于人血清/血浆样本检测，用其他样本或溶液检测的结果可能有误。 6.3本试剂只用于初筛检测，检测结果不可作为诊断机体是否感染乙型肝炎病毒的唯一依据。如需确诊，可采用ELISA等其他方法进一步检测。 7.注意事项 7.1均一性：用均一性国家参考或其标化的HBsAg、HbsAb HbeAb、HbcAb某一浓度的阳性企
PCR实验室操作流程
乙型肝炎病毒(HBV DNA PCR ABI7300)检侧标准操作程序一、INFORMATIONFORTEST检测信息 项目名称乙型肝炎病毒核酸 方法聚合酶链反应 方法依据卫生部《全国临床检验操作规程》第三版（2006) 第七篇第六章第一节 二、ANALYTICALPRINCTPLE检测原理 聚台酶链式反应(PCR〕可对特定核苷酸片段进行指数级的扩增，而实时荧光定量PCR技术,是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法.在实时荧光定量PCR反应中，引入了一种荧光化学物质，荧光物质有两种：荧光探针和荧光染料.我们目前是使用TaqMan荧光探针的检测原理:PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5’一3’外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成,荧光信号强度也等比例增加（图一）.这样就可以通过荧光强度变化监测产物量的变化，从而得到一条荧光扩增曲线图。
三、操作步骤 (一）试剂配制 1、进入试剂准备区，开启冰箱冷冻层取出HBV-DNA检测试剂盒。查看外包装盒（包括生产批号、有效期），无误后拆开试剂盒，取出核酸提取液、反应液及Taq酶（核对核酸提取液、HBVPCR反应液及Taq 酶管上批号与试剂外包装盒批号是否一致）（图1），不一致则不可使用，需更换新的试剂.室温平衡20min，完全融化后2000rpm离心备用。 2、核酸提取液的分装 (1)取0.5ml离心管架置于超净工作台内（开机前用紫外线消毒30分钟），用右手拿起镊子逐个将离心管放入离心管架(注意应夹住离心管外壁,不能碰到管内壁)，摆放顺序为横列从左往右摆，竖列为从上往下隔行排，离心管个数为n(n=样本数+对照品+质控品）。完成后将镊子放回原位(图2）。