浅谈核酸干扰技术的应用

浅谈核酸干扰技术的应用

[摘要]RNAi(RNAinterference)即核酸干扰技术已在多项生物学研究中显示出强大的功能,且具有广阔的应用前景。本文简要介绍了它在功能基因组研究、遗传工程及育种改良、病毒感染的预防和治疗、对恶性肿瘤的预防和治疗等方面的作用。

[关键词]RNAi;技术;功能

RNAi(RNAinterference)即核酸干扰,它是正常生物体内抑制特定基因表达的一种现象。从理论上来讲,RNAi通过对靶基因的抑制能治疗绝大部分疾病,因此,RNAi成为举世公认的新一代基因生物技术,它不仅为揭开基因功能提供了有效的研究工具,而且为人类目前无法医治的疑难杂症开辟了潜力无限的治疗途径。2006年10月2日,瑞典卡罗林斯卡医学院宣布,将2006年的诺贝尔生理学或医学奖授予两名美国科学家得鲁、菲尔和克雷格、梅洛。RNAi技术在功能基因组和遗传学研究、药物开发研究,包括抗肿瘤基因治疗和信号转导通路研究等方面,显示出了巨大的优势和广阔的发展前景。

1RNAi技术是功能基因组研究的重要工具

李伊雄等人在研究斑马鱼RNAi过程中,将表达绿色荧光蛋白(greenfluorescentprotein,GFP)基因的载体分别与有义RNA、反义RNA、针对GFP 序列的dsRNA和非针对GFP序列的dsRNA共同注射到斑马鱼体内,结果只有注射了针对GFP序列的dsRNA的实验组斑马鱼没有出现绿色荧光蛋白的表达。在单细胞的斑马鱼胚胎中分别注射zf-T基因(控制斑马鱼脊索发育)和Pax6.1(控制斑马鱼眼睛发育)的dsRNA,结果分别产生了无尾和无眼(或单眼)的斑马鱼;将针对Zf-T和Pax5.1的dsRNA共同注射到单细胞斑马鱼胚胎,结果出现了既无尾又无眼(或单眼)的斑马。鱼;有义RNA、反义RNA和非针对zf-T和Pax6.1的dsRNA 的对照组均未出现上述现象。上述实验显示,基因沉默技术是进行基因功能研究的有力工具。

根据基因组测序结果或EST文库构建的dsRNA文库可以应用于大规模的基因组筛选,或根据DNA芯片原理,将微电子技术与RNAi技术结合,构建RNAi芯片,让细胞生长在多种siRNA片段组成的点阵芯片上,产生各种基因功能失活表型库,可以快速地观察和研究功能基因组库,效率高,技术简单,甚至可以代替繁琐的传统基因敲除技术。RNAi技术将成为基因功能组研究的重要工具之一。

2RNAi技术可用于遗传工程及育种改良

可以预计,根据易感病毒的致病基因,设计短片段的dsRNA进行预处理育种,可以增强植物等生物对易感病毒的抗性;根据RNAi原理,设计控制系列基因的顺序表达或不表达,定向改造生物性状、培育生物新品种;根据RNAi原理,可以设计生产提高人体疾病免疫水平或避免器官移植排斥反应的特效药,而基本无毒副作用等。同时转基因生物往往具有转化效率低、稳定性不高、表达水平难以预料等弊端,RNAi技术无疑将对提高转基因的表达水平有着积极作用。

3RNAi技术可用于病毒感染的预防和治疗

目前,病毒感染的预防和治疗仍然是世界范围难题。尽管RNAi技术应用于哺乳动物至今大约只有2年左右的时间,但已在控制人类病毒性疾病的研究方面取得了令人欣喜的成果。研究已经证实,siRNA能够抑制逆转录病毒如人类免疫缺陷病毒(HIV)、鸡肉瘤病毒(RSV),负链RNA病毒如呼吸道合肥病毒(RSV)、正链RNA病毒如脊髓灰质炎病毒(poliovirus)、DNA病毒如人乳头瘤病毒(HPV)等的基因表达,其siRNA转染细胞的病毒产物明显下降。

Jacque等设计的针对HIV一1基因数个区域的siRNA,包括长末端重复序列(LTK)及辅助基因vif和nef。当这些siRNAs和HIV一1病毒共同转染Magi细胞,24h后病毒复制减少95%以上;在外周淋巴细胞,siRNAs诱导特异序列降解、阻止病毒中间体形成、防御HIV感染细胞等。

利用siRNA进行抗乙肝病毒(HBV)研究也取得了令人振奋的成果。以色列学者Shlomai和SHaul等设计了针对HBV基因19nt的两种pSURER载体。实验中将pSURERX-siRNA和HA-X载体(表达x)或pURERcore-siRNA和HA-core载体(表达core)转染Huh7细胞,72h后X、core蛋白的表达显著降低。Kapadia等也证明siRNA能特异性抑制丙肝病毒(ttCV)复制和相关蛋白质表达;美国Rockfeller大学Rice实验室研究人员证实siRNA能够修复98%丙肝患者受损的肝细胞。

中国工程院院士钟南山教授领导的课题组针对SARS病毒的RNA基因组设计了48条siRNA序列,筛选了其中的4条siRNA序列,经过研究证实能够非常有效的、特异性地阻断SARS病毒感染和病毒增殖,预防SARS病毒感染的有效率达90%以上,治疗效果80%以上。

4RNAi技术对恶性肿瘤的预防和治疗

国际上已在白血病和其他肿瘤的研究中已经取了不少成果。Wilda等应用RNAi成功地阻止了慢性髓性白血病和急性淋巴母细胞瘤瘤细胞的生长分化。Cioca等分别针对人白血病细胞中的cRaf和Bcl2设计siRNA,导入多株人白血病细胞后,两者的蛋白质水平显著降低,且沉默后的cRaf表达抑制了HE60细胞发生单核细胞样分化。Brummelkamp等利用逆转录病毒载体将siRNA导入肿瘤细胞中,特异性抑制了癌基因Krass(V12)的表达,在急性髓性白血病的治疗研究方面取得了比较乐观的结果。Elbashir等用Hela细胞作为研究对象,转染导入siRNA,其靶向mRNA所表达的蛋白质比转染前降低了90%。Lin等利用RNAi技术使Bel2基因沉默,明显抑制了前列腺癌LNCaP细胞的生长,并观察到受染细胞染色体浓缩、基因组断裂等细胞凋亡现象。

国内这方面的研究取得了有意义的进展,“hdm2”是罹患乳腺癌的重要致癌基因。2001～2002年中国科学院生物物理研究所人工模拟合成2lnt的针对hdm2的hdm2一siRNA序列,导入已患人乳腺癌的裸鼠体内,可以明显抑制hdm2的表达,明显抑制乳腺癌的生长。MDR是肿瘤化疗失败的主要原因,形成MDR的最常见因素是肿瘤细胞MDR1基因编码的PgP糖蛋白的过度表达。Wu等使用化学合成的siRNA在乳腺癌具有MDR表型的细胞中干扰MRD1的表达,MDR1的mRNA和PgP水平显著下降。罗切斯特大学Rowley博士领导的研究小组研制的dsRNA,可使端粒酶产生大幅度减少,75d后端粒缩短了85%。端粒酶在大多数癌症中扮演着重要角色。Rowley等的研究结果预示着大多数癌症的治疗又增加了一个有效的靶点。

5结语

尽管RNAi技术已在多项生物学研究中显示出强大的功能,且具有广阔的应用前景,但由于该技术还不够成熟,还有许多问题有待解决。例如,RNA干扰的非特异性沉默及脱靶现象,siRNA的miRNA活性及siRNA诱发的干扰素效应,这些不良反应均可能对机体造成不必要的伤害。又如,作用于靶mRNA上不同位点的siRNA为何具有不同的RNAi效率;如何将siRNA安全导入细胞;如何提高siRNA 在体内的稳定性,并延长其作用时问等。尽管如此,RNAi技术已作为一种强大、高效、特异的基因研究工具,在生命科学领域显示了巨大的发展潜力。随着RNAi 机制的逐渐阐明,RNAi技术将日趋完善,从而大大推进基因功能的研究,为各种疾病的治疗开辟新途径,对医学生物学的发展产生深远的影响。